一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用，属于生物工 程技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物广泛应用于食品、医药、饲 料、精细化学品等工业领域中。在工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都不可 避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，其中酸胁迫是最重要的胁迫之一，严重限制 着乳酸菌生长性能和发酵力。
[0003] 因此，提供一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法尤为重要。
[0004] 本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ArgH蛋白，实现了乳酸乳球菌对于酸胁迫 抗性能力的提尚。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种提高乳酸乳球菌抵御酸胁迫的方法，从而提高乳酸乳球 菌对于酸胁迫条件的适应能力。
[0006] 本发明解决的第一个问题是提供了一种酸胁迫抗性提高的重组菌，该重组菌过量 表达精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
[0007] 所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0008] 所述ArgH的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，是SEQIDNO.2所示的序 列。
[0009] 所述ArgH的核苷酸序列，在本发明的一种实施方式中，来源于干酪乳杆菌 LactobacilluscaseiZhang〇
[0010] 所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸菌。
[0011] 所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌或乳杆菌。
[0012] 所述重组菌，在本发明的一种实施方式中，为乳酸乳球菌Lactococcuslactis NZ9000。
[0013] 本发明解决的第二个问题是提供了一种所述重组菌的构建方法，是将编码SEQID NO. 1所示氨基酸序列的argH基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再转化到宿主菌中获 得重组菌。
[0014] 所述表达质粒，可以是以下任意一种：pNZ8148,pNZ8149,pNZ8150。
[0015] 所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中是LactococcuslactisNZ9000， LactococcuslactisNZ3900 或LactobacilluscaseiZhang。
[0016] 所述构建方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQIDNO. 2所示的核苷 酸序列克隆到表达质粒PNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将重组质粒转化到宿 主菌LactococcuslactisNZ9000 中，得到重组菌株LactococcuslactisNZ-argH。
[0017] 本发明的第三个目的是提供一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所 述方法是在乳酸菌中过量表达精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
[0018] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，ArgH的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示 的序列。
[0019] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将SEQIDNO. 2所示的核苷酸序 列克隆到表达质粒PNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将重组质粒转化到宿主菌 LactococcuslactisNZ9000 中，得到重组菌株LactococcuslactisNZ-argH，诱导表达 ArgH〇
[0020] 本发明的有益效果：通过在乳酸菌中过量表达ArgH蛋白，得到了一株酸胁迫抗性 能力显著提高的重组乳酸菌。在酸胁迫条件下，重组菌株相对于对照菌株的生物量提高了 24%，pH4. 1条件下4h存活率为对照的1. 98倍。
【附图说明】
[0021] 图1:重组质粒pNZ8148-argH的结构图；
[0022] 图2 :酸胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明做更详细的说明。
[0024] 实施例1重组菌株的构建
[0025] 从NCBI数据库的L.caseiZhang中得到如SEQIDNO. 2所示的ArgH的基因序 列，并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒PNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将其电 转入宿主菌L.lactisNZ9000中，得到重组菌株L.lactisNZ-argH。
[0026] 具体如下：
[0027] 根据argH的基因序列设计分别如SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4所示的引物ArgHF、 ArgHR(表1)，以L.caseiZhang的基因组为模板PCR扩增或者采用化学合成的方法，获得 SEQIDNO. 2所示的基因片段。将PCR产物和载体pNZ8148分别用SpeI和SphI双酶切， 酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物转化大肠杆菌MC1061(商业化菌株）感受态，氯 霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定， 最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148-argH(重组质粒结构如图1所示）。然后从 重组MC1061中提取重组质粒，电转化L.lactisNZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳 性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株 LlactisNZ-argH〇
[0028] 电转化条件为：1yL质粒中与40yL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中， 冰上放置l〇min。电压2000V，电容25yF，电阻200Q。电击完毕后，立即向电转杯中加入 lmL含有20mMMgClJP2mMCaCl2的GM17培养基（GM17培养基配方：M17培养基+0. 5% glucose)。然后置于30°C静置培养1. 5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取 转化子验证。
[0029] 表1引物
[0030]
【主权项】
1. 一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌过量表达精氨酰 琥珀酸裂解酶ArgH。
2. 根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
3. 根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述ArgH的核苷酸序列是SEQ ID NO. 2所示的序列。
4. 根据权利要求1所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸菌为乳酸乳球菌或 乳杆菌。
5. -种权利要求1-4任一所述重组乳酸菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将编 码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的argH基因连接到表达质粒上获得重组质粒，再转化到宿 主菌中获得重组菌。
6. 权利要求1-4任一所述重组乳酸菌在食品、饲料、精细化学品领域的应用。
7. -种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过量表达 精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ArgH的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1 所示的序列。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌或乳杆菌。
10. 根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列克隆到表达质粒PNZ8148上，获得重组质粒pNZ8148-argH，再将重组 质粒转化到宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中，得到重组菌株Lactococcus lactis NZ-argH，诱导表达 ArgH。
【专利摘要】本发明公开了一种酸胁迫抗性提高的重组乳酸菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei Zhang的argH基因，得到了一株酸胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ-argH。酸胁迫条件下，重组菌株相对于对照菌株的生物量提高了24％，pH4.1条件下4h存活率为对照的1.98倍。本发明还提供了一种提高酸胁迫抗性的方法，该方法具有良好的工业应用价值。
【IPC分类】C12N15-74, C12N1-21, C12R1-46
【公开号】CN104593311
【申请号】CN201510023520
【发明人】陈坚, 张娟, 张明阳, 唐诗
【申请人】江南大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月16日