专利名称：获得用于生产维生素k2的有益乳酸菌变种的方法及在食品制造中的应用的制作方法
获得用于生产维生素K2的有益乳酸菌变种的方法及在食品制造中的应用本申请是原申请的申请日为2007年10月4日，申请号为200780037068. 5，发明名称为《获得用于生产维生素K2的有益乳酸菌变种的方法及在食品制造中的应用》的中国专利申请的分案申请。本发明涉及富含维生素和/或痕量元素营养食品的领域，以便改善人类的营养摄入量及在质和量上的营养平衡。本发明特别涉及使食物富含维生素K的方法。更具体地，本发明涉及获得乳酸菌菌株变种的方法，所述乳酸菌变种在标准发酵条件下生产的维生素K2是相同条件下培养的初始乳酸菌菌株获得的维生素K2的至少约
I.2 倍。本发明还涉及一种食品的制造方法，尤其是富含维生素K2的发酵产品和/或鲜奶产品的制造方法，以及由此获得的食品。维生素K是一种脂溶性维生素，它呈现两种自然形态维生素Kl (或叶绿醌)和维生素K2 (或甲基萘醌)。维生素Kl由植物合成。人们主要在绿色蔬菜(叶状蔬菜)和豆油中获得它。维生素Kl直接参与凝血过程。维生素K2由肠道菌群的细菌生产。它也微量存在于某些发酵食品(奶酪、基于发酵黄豆的亚洲典型产品如味噌和日本水豆豉等等)中。多数细菌有能力合成维生素K2。因此，除了肠道菌群的细菌以及，特别是大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌和类杆菌属的种，还可以列举某些乳酸菌的种和亚种，如乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis spp. lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(lactococcus lactis spp. cremoris)、乳明串珠菌、肠膜明串珠菌和丙酸杆菌的种。由所述细菌合成的维生素K2的含量通常在29至90微克/升发酵乳之间变化(Morishita等人，1999)。需要强调的是对维生素K2产量的测量通常从沉淀细胞的真空冷冻干燥制品实现，并且这些测量结果随不同测试菌株在生产水平上呈现出很大的不均勻性，可能在一倍至三倍多之间变化(Morishita等人，1999 ;Parker等人,2003)。关于生物活动，维生素K2因其在软组织钙化上的作用而尤其被熟知。维生素K最初因为它在凝血过程中的重要作用而被描述。因此，严重缺乏维生素K会导致溢血，凝血时间异常延长，以及淤血。很长时间以来人们认为严重缺乏维生素K在成年中极为少见，对维生素K的需求可以靠多样平衡的膳食以及体内肠细菌的生产来大大满足。在这一方面，有严重缺乏可能的人主要是-新生儿，它们在出生时肠内没有能产生维生素K的细菌； -肝脏、胆或肠道功能紊乱者(肝病患者、先天性粘液稠厚症患者、结肠炎患者、痢疾患者等)；以及-长期服用抗生素的人。近期，人们发现维生素K对人类健康的影响不仅限于其在凝血机制中的作用。事实上，自从80年代起，维生素K也因其在骨代谢中的作用而闻名(Hart等人，1984 ；Hart等人，1985)。这种维生素在调节骨形成中的调节骨钙蛋白活动的酶化学反应中作辅助因子(Hauschka PV等人，1989 ;Ducy P等人，1996)。它的作用更精确地说包括调节骨钙蛋白的羧化，骨钙蛋白是调节成骨过程的关键蛋白。如果缺乏维生素K，这一反应无法进行，会引发血液中脱羧骨钙蛋白对羧化骨钙蛋白比率的升高(Vaananen等人，1999)。西方国家人口统计学的发展表现为人口的逐渐老龄化，结果导致变性病理流行病的增长，尤其是骨质疏松。在这一方面，骨质疏松从此被认为是公众健康的重大问题。在90年代建立的人口统计学估计敲响了警钟，预计在未来的50年内这种病的发生率会显著增长，尤其在老年人当中。所以采取措施预防这种疾病成为当务之急，事先稀少地检查出并随后处理。
从此人们认为预防骨质疏松应该从幼年开始，经过最佳的骨质增长阶段，并在一生中继续维护骨量(bone mass)o众所周知营养因素在骨储备(bone reverse)的发展和维护中起重要作用。直到现在，设想和建议用来预防骨质疏松的营养策略主要集中在两个重要因素上，它们是钙质和维生素D。然而，人们现在知道其他营养因素可以有显著的益处。因其在成骨过程中的重要作用，维生素K在文献中越来越成为维持人类一生中骨健康的有前途的途径。建议的人类含维生素K的营养供给(I. 5微克/天/千克体重)是只考虑到维生素K凝血作用而确定的。然而，近期研究提出，如果同时考虑到维生素K在骨代谢中的作用，这一建议的营养供给最终估计不足(Ronden等人，1998)。虽然维生素K的需求仍然不被了解，但不足的供给导致成人骨量低并增大骨折的危险(Hart 等人，1985 ；Knapen 等人，1989 ；Szulc 等人，1993 ；Booth 等人,2000)。此外，对绝经期女性治疗措施的研究指出维生素K可以在这一目标减少骨质亏损(Shiraki等人，2000 ;Braam等人，2003)。最终，对动物的研究提出它在骨量增长的高峰过程中起到促进作用，协同维生素D会起到更好的效果。然而，明确地联系维生素K和骨质增长的研究目前只在动物中进行过。另外，最近研究为维生素K在骨代谢和，尤其在骨量的组成和维持上的作用提供了额外的有利证据(Booth 等人,2000 ；Shiraki 等人,2000 ；Braam 等人,2003 ；Hirano 和Ishi，2002)。与成人情况不同的是，目前没有可利用的数据证明维生素K对儿童的骨代谢有促进的作用。人们只知道为了最大量储备骨质并保护成人不得骨质疏松，在增长期优化骨量十分重要。不管怎样，如今全部数据表明改善食品中维生素K的含量是使人构造和维护优良骨结构(bone structure)的有利的和有前途的途径。在这种情况下，在食品市场上已经存在富含维生素K的工业产品。特别可以列举某些含有乳酸菌的乳制品，如“Petits Gervais aux Fruits”在法国被Demanderesse出售。然而可以注意到，一方面，这些产品的维生素K含量通常依赖于使用的发酵类型，另一方面，传统在乳制品中使用的乳球菌属的菌株不能生产足量的维生素K来真正满足人口的需求，甚至不足以减缓可能出现的维生素K的缺乏。因此目前需要一种食品生产技术，特别是生产富含维生素K满足需求的发酵制品和/或鲜乳制品，如有必要，能够弥补维生素K的缺陷，无论是在儿童和青少年还是在成年人和老年人中。在下文中，术语“维生素K2”和“维生素K”不加区别，指代维生素K2。本发明目的是满足这一需要提出使用乳酸菌菌株新变种制备食品，特别是发酵制品和/或鲜乳制品，生产的维生素K远远多于衍生它们的最初菌株。此外，在他们工作过程中，发明者校准了乳酸菌的实现条件，相对于传统生产条件明显促进了维生素K的生产。因此，在食品制备的后期，如发酵制品和/或鲜乳制品的制备，增加维生素K2的含量，可以在发明者认为能特别促进维生素K2生产的实现条件下有利地使用“过剩生产者”这一维生素K的变种，它是本发明的目标也是2006年10月4日的法国专利申请No. 06/08690的发明目的。术语“变种”在这里包括
-自然变种，也就是说在选择压力作用下从一种参照乳酸菌菌株自发获得的变种；自然变种不经过任何人工基因处理，而是主要从参照菌株通过突变和选择而获得；以及-突变株，在其染色体组中有一个或多个由基因工程技术诱发的突变，也就是说靠应用在参照菌株上的诱导突变技术，特别是借助载体的转基因技术。可以注意到，在某些国家(特别是在欧洲)，食品工业在开发含有微生物特别是活体微生物的用于人类和/或动物食品的产品时应采取预防措施。实际上，转基因有机体(这里是微生物)(转基因有机体或突变体)会在消费者中引起畏惧和担忧。这种对转基因有机体不利的负面形象在某些国家表现为公众倾向于“抵制”含有转基因有机体的食品。另外，消费者总是苛求推荐给他们的食品内容以及产品包含的各成分来源的透明度，在这一情况下，工业界会被迫推荐近乎专一的，甚至是专一的无转基因有机体的产品。在本发明所处的情况下，专一地利用自然菌株或来自自然菌株的变种来生产源于工业并含有微生物的食品是很有优势的。根据第一方面，本发明涉及获得某乳酸菌菌株自然变种的方法，所述变种在标准发酵条件下可以比在相同条件下培养的所述乳酸菌菌株生产更多的维生素K2，倍数至少等于I. 2，所述方法至少包括a)标准发酵条件下在选择性介质上培养所述乳酸菌菌株，所述介质诱发细胞内氧化还原状态的改变；以及b)将与相同条件下培养的乳酸菌菌株相比，生产至少I. 2倍的维生素K2的变种选择出来。所述“变种”在本发明的意义下是能够比衍生它们的菌株生产更多维生素K2的乳酸菌菌株。更精确地，本发明的变种能够生产的维生素K2是初始菌株生产的维生素K2的至少I. 2倍。更优的是，根据本发明的变种生产维生素K2的产量比相同标准发酵条件下培养的初始乳酸菌菌株的产量更多，倍数至少约等于I. 5。这个倍数还可以更好，更优选约等于I. 7，更优选约等于I. 8，更优选约等于I. 9。这个倍数值更优的是至少约等于2、2. 2,2. 4、2. 5、2. 7、2. 8、2. 9、3。“参照”或“初始”的乳酸菌菌株是衍生了本发明的变种的菌株。这些菌株可以是自然菌株或者它们本身就是某个变种，也就是说自然变种或突变株。在本发明的范围内，“实验室条件”是完全标准的发酵条件并被所属领域技术人员所熟知。因此，词组“实验室条件”和“标准发酵条件”在这里完全是同意词。在本发明意义下最优的“实验室条件”如下在商用介质M17 (DifcoTM M17)或等同的介质上预先培养菌株。接下来的培养中借助预培养实现1%的接种。培养温度为大约30° C。要记住实验室条件可以由本领域技术人员根据其总体的知识按需要来改变，有可能在常规的校准实验之后。培养基是适于培养乳酸菌菌株特别是乳球菌属的某些种的菌株的介质。根据一种最佳的实现方式，乳酸菌菌株从乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、肠球菌属(Enterococcus)和丙酸杆菌属(Propionibacterium)中选择。它特别是从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、葡聚糖明串珠菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、丙酸杆菌的种。
优选地，如下文所述，在根据本发明的方法中，要实现一个从含有杆菌肽或氧化剂如过氧化物的培养基中选择的选择性介质。如此实现的选择性介质可以诱发细胞内氧化还原状态的变化。有利的是，这一变化和从表I列出的I 27号基因中选择的至少一种基因的表达在所述变种中相对于衍生它的乳酸菌菌株中的变化相关联表I
权利要求
1.乳酸菌菌株自然变种，该自然变种为乳酸乳球菌乳脂亚种(LactococcusIactissubsp. cremoris) CNCM 1-3558,所述乳酸菌菌株自然变种在标准发酵条件下可以比在相同条件下培养的所述乳酸菌菌株生产更多的维生素K2，倍数至少等于I. 2。
2.权利要求I记载的乳酸菌菌株自然变种的生物学纯培养物。
3.包括权利要求I记载的变种的乳酸酵素。
4.制造富含维生素K2食品的方法，其至少包括 a)在所述产品的中间制备阶段，使用权利要求I记载的变种和/或者权利要求3记载的酵素；以及 b)获得所述富含维生素K2的产品。
5.根据权利要求4记载的方法获得的富含维生素K2的食品。
6.根据权利要求5记载的食品，其特征在于，它是一种发酵产品和/或鲜乳制品。
7.权利要求I记载的变种和/或者权利要求3记载的酵素的用途，其用于制备富含维生素K2的食品。
8.根据权利要求7记载的用途，其特征在于，所述富含维生素K2的食品使食用者的骨骼更強壮。
全文摘要
本发明涉及获得用于生产维生素K2的有益乳酸菌变种的方法及在食品制造中的应用，具体涉及一种乳酸菌菌株自然变种，该自然变种为乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)CNCM I-3558，所述乳酸菌菌株自然变种在标准发酵条件下可以比在相同条件下培养的所述乳酸菌菌株生产更多的维生素K2，倍数至少等于1.2。
文档编号C12R1/01GK102732457SQ20121018741
公开日2012年10月17日 申请日期2007年10月4日 优先权日2006年10月4日
发明者佩吉·加罗, 克洛艾·贝亚尔, 加埃勒·凯雷, 吉约姆·戈贝尔, 热拉尔·利波夫斯基, 纳塔利亚·博基尔, 让-米歇尔·福里 申请人:达能日尔维公司