一种产udpg的重组工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产UDPG的重组工程菌及其在制备井冈霉素A中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 自沈寅初等学者发现一株产抗纹枯病菌活性物质的放线菌，并成功开发出井冈霉 素产品（井闪霉素A为主要有效成分），以更环保更高效的方式代替了有机砷制剂，因此实 现井闪霉素A发酵生产的高产成为了首要问题。尽管已有人通过不同的诱变方式，不同的 基因工程的技术对发酵生产菌株进行改造并且实现了较为理想的产率，但是在井闪霉素A 实现高产的同时，井闪羟胺A副产物存在着大量积累的现象。发酵产物井闪羟胺A的存在， 不但增加井闪霉素A分离的成本，而且影响着井闪霉素A的产率。
[0003] 已有学者以吸水链霉菌发酵生产菌株为基础，通过对糖基转移酶的过表达和增加 糖基供体的供给两方面的研宄，表明增加糖基供体的供给对井闪羟胺A的积累的影响更加 的明显，结果表明井冈霉素A与井冈羟胺A的比例从3. 15提高到了 5. 75。针对井冈霉素A 的合成机制，井闪羟胺A能够在尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG)存在下糖基转移酶（ValG)作用 合成井闪霉素A，已有学者通过大肠杆菌过表达ValG，结果表明体外表达的ValG有着良好 的活性，工程菌全细胞能够实现井闪羟胺A向井闪霉素A-定的转化效果。
[0004] 目前已经有着大量文献报道以大肠杆菌为宿主强化合成UDPG并成功获得UDPG的 大量积累。已有学者通过UDPG合成机制的研宄，其中关键酶为葡萄糖磷酸变位酶（Pgm)，尿 苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（GalU)，尿苷二磷酸激酶。在ZichaoMao等报道中，在大肠杆 菌中以PQE80L为表达载体，共表达pgm，galU，galE:lgtB。使其从葡萄糖-6-磷酸节点处 分向UDPG合成的碳流量比对照菌提高8倍多。而在YanY等报道中有着同样明显的效果， 结果实现并提高花青素在大肠杆菌中合成，以pETDuet-1，p⑶FDuet-1为载体，构建pEGP， p⑶F-At3GT-MdANS，以双启动子分别启动各自基因，向宿主菌中加入底物进行转化，结果证 明UDPG量比野生菌株提高了 57. 8%，花青色素-0-葡糖苷产量达到61. 4mg/L，远高于只共 表达ANS和3GT时的16.lmg/L。
[0005] 本发明首次以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌构建ValG与强化合成UDPG的关键酶 GalU，Pgm的共表达的工程菌，以井闪羟胺A为底物全细胞催化实现井闪霉素A的高产量及 高产率。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是克隆吸水链霉菌中存在的ValG，大肠杆菌JM109中UDPG合成途径中 存在的GalU，Pgm，并构建强化UDPG合成途径的糖基转移酶的工程菌，以用于实现全细胞催 化井闪羟胺A为井闪霉素A。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种产UDPG的重组工程菌，所述工程菌是将吸水链霉菌中的ValG基 因及大肠杆菌JM109中的GalU基因和Pgm基因导入宿主菌构建而成；所述ValG基因的核 苷酸序列为SEQIDN0:1所示，所述GalU基因的核苷酸序列为SEQIDN0:2所示，所述Pgm基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示。
[0009] 进一步，所述宿主菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0010] 本发明还提供一种所述的产UDPG的重组工程菌在制备井冈霉素A中的应用，具体 所述的应用为：以重组工程菌经诱导培养后的湿菌体为催化剂，以井闪羟胺A为底物，以纤 维二糖为辅助底物，以50mM、pH6. 0磷酸钠缓冲液为反应介质，在150rpm，30°C条件下进行 转化反应，反应结束后，获得含井闪霉素A的混合液，将混合液分离纯化，获得井闪霉素A。 所述底物的初始浓度为〇.l-l〇g/L缓冲液，所述纤维二糖的终浓度为5-15g/L缓冲液，所述 湿菌体的用量以缓冲液体积计为40-100g/L缓冲液。优选所述底物的初始浓度为lg/L缓 冲液，所述纤维二糖的终浓度为l〇g/L缓冲液，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为80g/L 缓冲液。
[0011] 本发明所述湿菌体的制备方法为：将重组工程菌接种至新鲜LB液体培养基， 180rpm，37°C过夜培养，以体积浓度1 %接种量转接至新鲜LB液体培养基，37°C，180rpm培 养3-4h，添加终浓度100mM乳糖，30°C诱导培养8-10h，将培养液离心，获得湿菌体。
[0012] 本发明所述重组工程菌的构建方法为：
[0013] 1?大肠杆菌pETDuet-ValGBL21(DE3)工程菌的构建方法
[0014] 根据NCBI数据库上所报道的吸水链霉菌ValG基因序列设计引物，并根据 pETDuet-1质粒上的MCS2序列及ValG酶切情况选出适合的酶切位点，然后以吸水链霉 菌基因组为模板扩增ValG目的片段，该基因大小为1269bp，序列如SEQIDNO:1 ;经过 T-A克隆，得到经测序正确的重组子；用限制性内切酶酶切得到目的片段并将其克隆至 pETDuet-1的MCS2上相应的酶切位点，转化至大肠杆菌得到含重组子pETDuet-ValG的工程 菌pETDuet-ValGBL21 (DE3)，测序验证重组子构建成功。
[0015] 2?大肠杆菌pETDuet-ValG-GalUBL21(DE3)工程菌的构建方法
[0016] 根据NCBI数据库上所报道的大肠杆菌JM109GalU基因序列设计引物，并根 据pETDuet-1质粒上的MCS1序列及GalU酶切情况选出适合的酶切位点，然后以大肠杆 菌JM109基因组为模板扩增GalU目的片段，该基因大小为950bp，序列如SEQIDNO: 2;经过T-A克隆，得到经测序正确的重组子；用限制性内切酶酶切得到目的片段并将 其克隆至pETDuet-ValG的MCS1上相应的酶切位点，转化至大肠杆菌得到含重组子 pETDuet-ValG-GalU的工程菌pETDuet-ValG-GalUBL21 (DE3)，测序验证重组子构建成功。
[0017] 3?大肠杆菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)工程菌的构建方法
[0018] 根据NCBI数据库上所报道的大肠杆菌JM109Pgm基因序列设计引物，并根 据pETDuet-1质粒上的MCS1序列及Pgm酶切情况选出适合的酶切位点，然后以大肠杆 菌JM109基因组为模板扩增Pgm目的片段，该基因大小为1666bp，序列如SEQIDNO: 3 ;经过T-A克隆，得到经测序正确的重组子；用限制性内切酶酶切得到目的片段并将其 克隆至pETDuet-ValG-GalU的MCS1上相应的酶切位点，转化至大肠杆菌得到含重组子 pETDuet-ValG-GalU-Pgm的工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3)，测序验证重组子构 建成功，获得工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3) 〇
[0019] 本发明构建的糖基转移酶（ValG)及UDPG合成关键酶一UDPG焦磷酸化酶（GalU)， 葡萄糖磷酸变位酶（Pgm)工程菌能够合成大量的UDPG，为糖基转移酶的酶学反应提供更多 的糖基供体。该工程菌可以用于全细胞催化井闪羟胺A为井闪霉素A。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：鉴于吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicussubsp.jinggangensis)发酵生产井闪霉素A存在大量井闪轻胺A的积累， 本发明以井冈羟胺A为底物，以高产UDPG的重组工程菌全细胞催化生产井冈霉素A，于相同 时间内转化速率更快，并实现了 75%转化率。 (四）
【附图说明】
[0021] 图 1 为PCR扩增电泳图，M为lOOOObpDNAMarker，1 为ValG，2 为GalU，3 为Pgm。
[0022] 图 2 为pETDuet-ValGBL21 (DE3)、pETDuet-ValG-GalUBL21 (DE3)及 pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)工程菌的菌落PCR电泳图，M为lOOOObpDNAMarker， 1 为ValG，2 为pETDuet-ValGMCS1 的空载体对照，3 为ValG-GalU，4 为ValG-GalU-Pgm。
[0023] 图 3 为重组质粒pETDuet-ValG、pETDuet-ValG-GalU、pETDuet-ValG-GalU-Pgm、 pETDuet-lBL21 菌株单双酶切电泳图，M为lOOOObpDNAMarker，1 为pETDuet-1 单 酶切，2 为pETDuet-ValG单酶切，3 为pETDuet-ValG双酶切，4 为pETDuet-ValG-GalU 单酶切，5 为pETDuet-ValG-GalU双酶切，6 为pETDuet-ValG-GalU-Pgm单酶切，7 为 pETDuet-ValG-GalU-Pgm双酶切。
[0024] 图4为EcoliBL21 (D