[0055]DuetDOWN-1-R:5'-GATTATGCGGCCGTGTACAAT-3'
[0056] 实施例3大肠杆菌pEIDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3)工程菌的构建方法
[0057] 以CTAB法获得E.coliJM109基因组，PCR扩张获得Pgm目的基因，再将Pgm目的 基因导入PETDuet-ValG-GalU质粒中，具体方法如下：
[0058]1. Pgm目的基因的扩增
[0059] 根据E.coliJM109基因组序列设计引物：
[0060]Pgm-F: 5' -TGCACTGCAGAACGTTGCAGACAAAGGAC-3'(PstI),
[0061]Pgm-R:5' -ATTTGCGGCCGCTTACGCGTTTTTCAGAAC-3'(NotI)。以E.coliJM109 基 因组为扩增模板，Pgm-F/Pgm-R为引物PCR扩增Pgm基因。PCR体系：10Xbuffer5.OyL， dNTPs4. 0yL，Pgm-F1. 0yL，Pgm-R1. 0yL，E.coliJM109 基因组模板 3. 0yL，TaKaRa ExTaqHS0. 25
[0062]yL，RNaseFreedH20 补充至 35. 75yL。PCR程序：98°C预变性 2min;98°C变性 10s，57°C退火30s，70°C延伸2min(30次循环）；72°C延伸10min。如图1所示，利用胶快速回 收试剂方法来回收Pgm目的基因片段，经T-A克隆得到重组载体pMD19-T-Pgm，转化E.coli DH5a。
[0063] 2.工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)的构建
[0064]分别用PstI和NotI对pMD19-T_Pgm和质粒实施例2制备的pETDuet-ValG-GalU 双酶切，将获得纯化后的目的基因Pgm与线性质粒pETDuet-ValG-GalU连接，连接产物转 化至E.coliBL21 (DE3)，涂布于含150yg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板，筛选含表达质粒 pETDuet-ValG-GalU-Pgm的转化子。以特异性引物pETUpstream-F/DuetDOWN-1-R进行菌 落PCR鉴定，如图2中泳道4所示，PCR鉴定后提取质粒，再分别以PstI和NotI进行单 双酶切，如图3中泳道6、7所示，泳道6单酶切9400bp左右及泳道7双酶切1700bp左右皆 出现亮条带，鉴定得到正确结果后，测序，质粒PETDuet-ValG-GalU-Pgm构建成功，获得含 质粒pETDuet-ValG-GalU-Pgm的重组工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3) 〇
[0065]实施例 4 工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)强化合成UDPG的检测
[0066] L实验目的：比较工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)和工程菌 pETDuet-ValGBL21(DE3)合成UDPG的含量。
[0067] 2.实验方法：通过测定工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3)和工程菌 pETDuet-ValGBL21(DE3)在完成诱导表达后，添加葡萄糖至终浓度500mM，分别在2h，5h时 间点取lmL菌液，8000rpm、4°C离心5min收集菌体，超纯水洗涤1次，用200yL超纯水重悬 浮，沸水浴加热40min后，12000rpm离心lOmin取上清，用高效液相色谱仪分析，色谱条件 为：色谱柱InertSustainC18,流速lmL/min，10iiL进样量，以100mM的pH6.0三乙胺乙 酸缓冲液为流动相，254nm下进行检测分析UDPG含量。
[0068] 3?实验结果：在以工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3)和对照工程菌 pETDuet-ValGBL21(DE3)合成UDPG含量的比较中，能够实现4-7倍左右的提高，具体数据 如图4所示。
[0069] 4.实验结论：结果表明，本发明的pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)的工程菌 能强化合成较多m)PG。
[0070] 实施例5工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)全细胞催化井冈羟胺A为井 冈霉素A
[0071] L实验目的：比较工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3)和工程菌 pETDuet-ValGBL21(DE3)全细胞催化井闪羟胺A为井闪霉素A的转化率及产物含量。
[0072] 2.实验方法：将工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)和工程菌 pETDuet-ValGBL21 (DE3)分别接种至新鲜LB液体培养基，180rpm，37°C过夜培养，并以体 积浓度1 %接种量将培养液转接至新鲜LB液体培养基，37°C，180rpm培养3-4h，添加终浓度 100mM乳糖，30°C诱导培养8-10h，在完成诱导表达后，获得全细胞重组工程菌。
[0073] 以50mM的pH6. 0磷酸钠缓冲液为反应介质，加入终浓度10g/L缓冲液的纤维二 糖，初始浓度为lg/L缓冲液的井闪羟胺A，添加80g/L缓冲液的重组工程菌湿菌体，构成转 化液体系1. 5mL，在150rpm，30 °C水浴摇床培养60h，分别在24h，28h，32h，36h，40h时间点 取80yL样品。离心除去菌体，用高效液相色谱仪分析，色谱条件为：色谱柱HypersilODS C18,流速lmL/min，5yL进样量，以含0. 2%似2即04的2. 5%甲醇溶液为流动相，210nm下 进行检测分析。
[0074] 3.实验结果：以工程菌pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21 (DE3)和对照工程菌 pETDuet-ValGBL21(DE3)对井冈羟胺A向井冈霉素A转化效果的比较，具体数据如图5所 不〇
[0075] 4.实验结论：结果表明，本发明的pETDuet-ValG-GalU-PgmBL21(DE3)工程菌能 够实现井闪羟胺A向井闪霉素A75%的转化效率并且加快全细胞催化的速度。
【主权项】
1. 一种产UDPG的重组工程菌，其特征在于所述工程菌是将吸水链霉菌中的ValG基因 及大肠杆菌JM109中的GalU基因和Pgm基因导入宿主菌构建而成；所述ValG基因的核苷 酸序列为SEQ ID N0:1所示，所述GalU基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2所示，所述Pgm 基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :3所示。
2. 如权利要求1所述的产UDPG的重组工程菌，其特征在于所述工宿主菌为大肠杆菌 BL21(DE3) 〇
3. -种权利要求1所述的产UDPG的重组工程菌在制备井闪霉素A中的应用。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以重组工程菌经诱导培养后 的湿菌体为催化剂，以井冈羟胺A为底物，以纤维二糖为辅助底物，以50mM、pH 6. 0磷酸钠 缓冲液为反应介质，在150rpm，30°C条件下进行转化反应，反应结束后，获得含井闪霉素A 的混合液，将混合液分离纯化，获得井闪霉素A。
5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：将重组工程菌接 种至新鲜LB液体培养基，180rpm，37°C过夜培养，以体积浓度1 %接种量转接至新鲜LB液体 培养基，37°C，180rpm培养3-4h，添加终浓度100mM乳糖，30°C诱导培养8-10h，将培养液离 心，获得湿菌体。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于底物的初始浓度为0. l-10g/L缓冲液，所述纤 维二糖的终浓度为5-15g/L缓冲液，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为40-100g/L缓冲 液。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于底物的初始浓度为lg/L缓冲液，所述纤维二 糖的终浓度为l〇g/L缓冲液，所述湿菌体的用量以缓冲液体积计为80g/L缓冲液。
【专利摘要】本发明公开了一种产UDPG的重组工程菌及其在制备井冈霉素A中的应用，所述工程菌是将吸水链霉菌中的ValG基因及大肠杆菌JM109中的GalU基因和Pgm基因导入宿主菌构建而成；所述ValG基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述GalU基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示，所述Pgm基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；工程菌可以用于全细胞催化井冈羟胺A为井冈霉素A，于相同时间内转化速率更快，并实现了75％转化率。
【IPC分类】C12P19-46, C12R1-19, C12N1-21
【公开号】CN104593309
【申请号】CN201510004526
【发明人】陈小龙, 范永仙, 连振静, 罗星荣, 沈寅初
【申请人】浙江工业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月6日