一种改善水产养殖动物肠道的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种改善水产养殖动物肠道的菌株及其应 用。
【背景技术】
[0002] 随着我国水产养殖业的高速发展，高密度养殖模式所带来的巨大经济效益促使其 成为多数经济鱼类主要的养殖模式。然而高密度养殖模式管理不善容易导致养殖病害频 发，养殖水体严重恶化等诸多问题，为此养殖户们在调高养殖密度的同时，将注意力投到了 近几年兴起的益生菌剂上，通过投放益生菌，以控制水体中病原菌的数量及净化水质，进而 降低养殖病害发生。芽孢杆菌在水产养殖上的应用自日本的Kozasa首次将东洋芽孢杆菌 应用于水产养殖以来，其在改善水质、抑制致病菌、增强养殖动物机体自身抵抗力等方面的 应用均得到了充分的研宄开发。但目前已报导的应用于水产养殖的益生菌功能都比较单 一，筛选分离具有多重功效的益生菌能创造巨大经济利益，具有重要的研宄意义。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种改善水产养殖动物肠道的菌株，该菌株 为地衣芽抱杆菌菌株FA08 于2014年08月25日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院2号，保 藏编号为CGMCCN〇:9544 ;并同时揭露了利用该菌株制备所得的益生菌制剂。
[0004] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的： 申请人从采自福建省宁德市养殖池底泥样品中分离并筛选得到能够改善水产养殖动 物肠道的菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16srDNA鉴定，最终确认其为地衣 HVi'WikBacilluslicheuiformis)一个菌株。
[0005] 同时，利用该菌株制备能够改善水产养殖动物肠道的益生菌制剂，其制备操作步 骤如下： (1) 菌株培养：取权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08 )并将其接种至LB培养基中，且于28-40 °C、150-200rpm下活化培养 5-10h;活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40°C、 150-200rpm条件下培养 12-24h; (2) 菌株浓缩：将经步骤（1)培养所得的菌液置于8000-10000rpm离心5-10min，弃上 清得湿菌液； (3) 菌株固定：于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸 石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C条件下进行干燥，最后分装包装即得所述益生菌制剂 的成品。
[0006] 进一步地，所述LB培养基的组分均为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，H20 1000mL。
[0007] 本发明的有益效果在于：提供一种地衣芽孢杆菌 FA08,利用其制备所得的微生物制剂，对水产病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有较好的抑 制作用，能产生多种活性酶，能够降低水产养殖动物的饵料系数，并能提高水产动物成活 率，具有较好的生产应用前景。
【具体实施方式】
[0008] 本发明一种改善水产养殖动物肠道的菌株即地衣芽孢杆菌 )FA08是采自福建省宁德市养殖池底泥样品中分离并筛选得到能够改善水 产养殖动物肠道的菌株，并揭露了利用该菌株FA08制备改善水产养殖动物肠道的益生菌 制剂。
[0009] -、菌株FA08的分离与鉴定： 1、初筛： 称取l〇g采自福建省宁德市养殖池底泥样品，加入l〇〇mL0. 85%NaCl中，搅拌后取上 层浊液置于LB培养基，之后于37°C、180rpm条件下富集培养30h，富集培养所得菌液置于 75°C水浴20min，水浴后的菌液进行梯度稀释及LB平板涂布法分离操作，然后挑取LB平板 上长起的形态不一的菌落，保存备用。
[0010] 2、复筛： 取初筛得到的各菌落并分别置于LB试管中，于37°C、180rpm下活化6h;活化好的菌液 按10%接种量接种至CMC-Na产酶培养基中，37°C，180rpm发酵48h;所得发酵液经lOOOOrpm 离心6min，得上清液，备用； 配制CMC-Na平板，打孔后，孔内添加50uL所得的上清液，之后置于37°C过夜反应；反 应后的平板用刚果红染色lh，接着用0. 85%NaCl脱色，观察比较各孔中上清液水解圈的大 小，进而筛选出产酶能力较强的菌株，将该菌株标记为菌株FA08。
[0011] 其中，CMC-Na产酶培养基的组分为：蛋白胨10. 0g，酵母膏9. 0g，CMC-Na 5. 0g， pH8. 0;CMC-Na平板的组分为：CMC-Na 15. 0g、硫酸铵l.Og、酵母膏l.Og、硫酸镁l.Og、磷 酸二氢钾1.0g、H20 1000mL、Agar 20.0g〇
[0012] 3、鉴定： 将筛选所得菌株FA08接种至LB固体培养基中，37°C下培养，并观察菌落形态，并做部 分生理生化特性的测定，结果如下：菌落白色微黄，中间凸起，表面光滑，边缘不规则，革兰 氏阳性，产芽孢，葡萄糖发酵阳性，水解淀粉阳性。同时对该菌株进行16S rDNA鉴定，得其 16s rDNA序列如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 将测得的16s rDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为地衣 芽孢杆菌则结合生理生化鉴定结果及16s rDNA序列数据库比 对结果，确定该菌株FA08为地衣芽孢杆菌/icAefli/bu's)的一个菌株。
[0014] 二、益生菌制剂的制备： 利用菌株FA08制备能够改善水产养殖动物肠道的益生菌制剂，其操作步骤如下： (1)菌株培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于28-40°C、150-200rpm下 活化培养5-10h;活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于 28-40°C、150-200rpm条件下培养 12-24h; (2) 菌株浓缩：将经步骤（1)培养所得的菌液置于8000-10000rpm离心5-10min，弃上 清得湿菌液； (3) 菌株固定：于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸 石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C条件下进行干燥，最后分装包装即得所述益生菌制剂 的成品。
[0015] 需要说明的是，本发明中所涉及的LB培养基、LB试管的组分均为：蛋白胨10g，酵 母粉5g，NaCl10g，H20 1000mL;LB固体培养基、LB平板的组分均为：蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCl10g，琼脂 20g，H20 1000mL。
[0016] 为了更好的对本发明中益生菌制剂进行进一步阐述说明，申请人例举了如下实施 例。
[0017] 实施例1 菌株培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于30°C、150rpm下活化培养6h; 活化好即得种子液，接着按1%接种量将种子液接种至LB培养基，并于30°C、150rpm条件下 培养20h，得菌液备用； 菌株浓缩：将所得的菌液置于l〇〇〇〇rpm离心6min，弃上清得湿菌液； 菌株固定：于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土 200g/L，之后30°C条 件下进行干燥，最后分装包装即得所述益生菌制剂的成品。
[0018] 实施例2 菌株培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于28°C、200rpm下活化培养10h; 活化好即得种子液，接着按10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于40°C、200rpm条件 下培养24h，得菌液备用； 菌株浓缩：将所得的菌液置于9000rpm离心5min，弃上清得湿菌液； 菌株固定：于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的麦饭石粉1000g/L，之后 40°C条件下进行干燥，最后分装包装即得所述益生菌制剂的成品。
[0019] 实施例3 菌株培养：取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于35°C、170rpm下活化培养5h;活化好即得种子液，接着按8%接种量将种子液接种至LB培养基，并于35°C、170rpm条件下 培养20h，得菌液备用； 菌株浓缩：将所得的菌液置于8000rpm离心5min，弃上清得湿菌液； 菌株固定：于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的沸石粉50g/L，之后35°C条 件下进行干燥，最后分装包装即得所述益生菌制剂的成品。
[0020] 三、菌株FA08及其益生菌制剂的效果试验： 试验1 : 取菌株FA08并将其接种至LB培养基中，且于30°C、150rpm下活化培养6h;活化好即 得种子液，接着按1%接种量将种子液接种至LB培养基，并于30°C、150rpm条件下培养20h， 得发酵液经lOOOOrpm离心6min得上清液备用，制作抑菌板，打孔后，孔内添加50uL实施例 1菌株浓缩时所得的上清液，后置于37°C培养过夜；且该抑菌板：45°C熔融SLB添加1%活 化好的病原菌(溶藻弧菌、嗜水气单胞菌）；观察记录抑菌板上抑菌圈径； 试验结果： 试验2 :
【主权项】
1. 一种改善水产养殖动物肠道的菌株，其特征在于：所述菌株为地衣芽孢杆菌菌株 FA08 于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:9544。
2. -种改善水产养殖动物肠道的益生菌制剂，其特征在于：该益生菌制剂的制备操作 步骤如下： (1) 菌株培养：取权利要求1所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08 BcAmi/biTBis)并将其接种至LB培养基中，且于28-40 °C、150-200rpm下活化培养 5-10h;活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40°C、 150-200rpm条件下培养 12-24h; (2) 菌株浓缩：将经步骤（1)培养所得的菌液置于8000-10000rpm离心5-10min，弃上 清得湿菌液； (3) 菌株固定：于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250目的硅藻土或麦饭石粉或沸 石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C条件下进行干燥，最后分装包装即得所述益生菌制剂 的成品。
3. 根据权利要求2所述的一种改善水产养殖动物肠道的益生菌制剂，其特征在于：所 述LB培养基的组分均为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，H20 1000 mL。
【专利摘要】本发明是采自福建省宁德市养殖池底泥样品中分离并筛选得到能够改善水产养殖动物肠道的菌株，所述菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）FA08，于2014年08月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No:9544。同时揭露了利用该菌株制备改善水产养殖动物肠道的益生菌制剂的方法，制备所得的微生物制剂，对水产病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有较好的抑制作用，能产生多种活性酶，能够降低水产养殖动物的饵料系数，并能提高水产动物成活率，具有较好的生产应用前景。CGMCC No.95442014.08.25
【IPC分类】A23K1-16, C12N1-20, C12R1-10
【公开号】CN104593299
【申请号】CN201510008334
【发明人】徐长安, 唐旭, 刘源森, 林凌, 黄仕新, 方卫东
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月8日