低聚果糖糖单体分离纯化的方法与流程

本发明涉及食品技术领域，特别涉及一种低聚果糖糖单体分离纯化的方法。

背景技术：

菊糖又称菊粉，是由D-果糖经β(2→1)糖苷键链接而成，末端以一个葡萄糖分子结尾的线性直链多糖，

菊糖的聚合度分布为2-60。因其特殊的β(2→1)糖苷键结构，在口腔、胃、小肠中均不会消化分解，只能在结肠中被双歧杆菌等部分发酵分解产生少量热量，所以菊糖具有多种生理功能。可以改善肠道环境，防止便秘，还能促进矿物质吸收，调节血糖、血脂，并且具有抗氧化、抗癌，调节免疫系统的功能。因此菊糖在食品、医药、保健等行业有巨大的应用潜力和经济效益。

目前低聚果糖的制备方式主要包括合成法和菊糖降解法，前者是由蔗糖分子的果糖残基上通过β(2→1)糖苷键连接1～3个果糖基而成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)合成的；后者是菊糖通过化学法或酶法降解后分离纯化制备得到的。目前的糖单体无论是由合成法低聚果糖分离纯化得到还是由菊糖源的原料制备，均为GFn型。菊糖和低聚果糖被欧盟批准为食品添加剂，2009年，菊糖被我国批准为新资源食品，但是由于缺少统一的检测标准，很多企业不敢随意添加，大大影响了菊糖和低聚果糖的推广，Fn型糖单体的制备是解决菊糖和低聚果糖检测标准品缺乏的唯一途径。

菊糖是由不同聚合度的聚果糖混合而成的混合物，成分复杂；且菊糖型聚果糖既有Fn型，又有GFn型；菊糖糖单体理化性质非常相似；聚果糖缺少快速检测的官能团，无法快速检测等又增加了糖单体分离纯化的难度。

技术实现要素：

鉴于此，有必要提供一种工艺简单且纯度高的低聚果糖Fn型糖单体分离纯化的方法。

一种低聚果糖糖单体分离纯化的方法，包括如下步骤：

步骤1：配置包含菊糖或低聚果糖的原溶液；

步骤2：将所述原溶液上样至Bio-Gel-P4色谱柱，并用第一洗脱剂冲洗，收集得到第一洗脱液；

步骤3：将所述第一洗脱液浓缩形成浓缩液；

步骤4：将所述浓缩液上Bio-Gel-P2色谱柱，并用第二洗脱剂冲洗，收集得到第二洗脱液；

步骤5：将所述第二洗脱液减压浓缩至没有液体流出为止，得到含量为95％以上的Fn型低聚果糖糖单体，包括F3，F4，F5，F6，F7，F8或F9型糖单体中的一种。

在其中一个实施例中，步骤1中，将菊糖或低聚果糖加入去离子水中形成包含菊糖或低聚果糖的原溶液，所述菊糖和低聚果糖的浓度在40-200g/L。

在其中一个实施例中，步骤1中，所述菊糖的聚合度为2-60，所述低聚果糖的聚合度为2-9。

在其中一个实施例中，步骤2中，所述第一洗脱剂为去离子水。

在其中一个实施例中，步骤2中，所述原溶液上样体积为1ml，上样浓度为100g/L，所述第一洗脱剂洗脱流速为0.1-0.5mL/min。

在其中一个实施例中，步骤3中，所述浓缩液的浓度在40-200g/mL之间。

在其中一个实施例中，步骤4中，所述第二洗脱剂为质量分数在0％-10％之间的低浓度乙醇或者去离子水。

在其中一个实施例中，步骤5中，所述Fn型低聚果糖糖单体，包括F3，F4，F5，F6，F7，F8或F9型糖单体中的一种。

在其中一个实施例中，在完成步骤2后，进行步骤3前还包括下述步骤：将所述第一洗脱液在示差折光检测器的液相上进行检测，并将相同组分的糖单体进行混合。

在其中一个实施例中，在完成步骤5之后还包括下述步骤：将所述Fn型低聚果糖糖单体用液相色谱仪示差折光检测器进行检测。

上述低聚果糖糖单体分离纯化的方法，通过包含菊糖或低聚果糖的原溶液，通过Bio-Gel-P4色谱柱一级分离后进行组分浓缩，再通过Bio-Gel-P2色谱柱对浓缩液进行二级分离，最终制备得纯度95％以上的低聚果糖Fn型单一组分产品，上述低聚果糖糖单体分离纯化的方法工艺简单，分离后得到的Fn型低聚果糖糖单体纯度高。

附图说明

图1为一实施方式的低聚果糖糖单体分离纯化的方法流程图。

图2表示本申请提供的实施例一TLC结果示意图。

图3表示本申请提供的实施例二TLC结果示意图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对低聚果糖糖单体分离纯化的方法的做进一步详细的说明。

如图1所示，一实施方式的低聚果糖糖单体分离纯化的方法，包括如下步骤：

步骤S110：配置包含菊糖或低聚果糖的原溶液。

具体地，将菊糖或低聚果糖加入去离子水中形成包含菊糖或低聚果糖的原溶液。

优选地，所述菊糖和低聚果糖的浓度在40-200g/mL。所述菊糖的聚合度为2-60，所述低聚果糖的聚合度为2-9。

可以理解，在实际中，所述菊糖和低聚果糖的浓度及聚合度还可以选取其他的数值范围。

步骤S120：将所述原溶液上样至Bio-Gel-P4色谱柱，并用第一洗脱剂冲洗，收集得到的第一洗脱液。

优选地，所述第一洗脱剂为去离子水。

可以理解，由于第一洗脱剂采用去离子水，可以重复利用，制备过程清洁无污染。

优选地，所述原溶液的上样体积为1mL，所述原溶液的上样浓度为100g/L，所述第一洗脱剂洗脱流速为0.1-0.5mL/min。

步骤S130：将所述第一洗脱液浓缩形成浓缩液。

优选地，所述浓缩液的浓度在40-200g/mL之间。

步骤S140：将所述浓缩液上Bio-Gel-P2色谱柱，并用第二洗脱剂冲洗，收集得到的第二洗脱液。

优选地，所述第二洗脱剂为质量分数在0％-10％之间的低浓度乙醇或者去离子水。

步骤S150：将所述第二洗脱液减压浓缩至没有液体流出为止，得到含量为95％以上的Fn型低聚果糖糖单体。

其中，所述Fn型低聚果糖糖单体包括F3，F4，F5，F6，F7，F8或F9型糖单体中的一种。

优选地，在完成步骤S120之后，进行步骤S130之前还包括下述步骤：

将所述第一洗脱液在示差折光检测器的液相上进行检测，将相同组分的糖单体进行汇集。

优选地，在完成步骤S150之后还包括下述步骤：

将所述Fn型低聚果糖糖单体用示差折光检测器进行检测。

上述低聚果糖糖单体分离纯化的方法，通过包含菊糖或低聚果糖的原溶液，通过Bio-Gel-P4色谱柱一级分离后进行组分浓缩，再通过Bio-Gel-P2色谱柱对浓缩液进行二级分离，最终制备得纯度95％以上的低聚果糖Fn型糖单体，上述低聚果糖糖单体分离纯化的方法工艺简单，分离后得到的Fn型低聚果糖糖单体纯度高。

此外，上述低聚果糖糖单体分离纯化的方法由菊粉或菊粉源低聚果糖制备低聚果糖Fn型糖单体，相对于食品工业用以制备菊粉的主要原料为菊芋或者菊苣，成本更为低廉。

以下为具体实施例部分：

实施例1

本实施例的低聚果糖糖单体分离纯化的方法步骤如下：

(1)低聚果糖溶液配制：称取低聚果糖2g加入10mL去离子水配成原溶液。

(2)Bio-Gel-P4柱分离：取1mL 200g/L原溶液上样至100mL堆积体积的Bio-Gel-P4柱，用流速在0.1mL/min的乙醇洗脱，每2mL收集第一洗脱液。

(3)HPLC检测：将收集的第一洗脱液在示差折光检测器的液相上进行检测。

(4)浓缩：将(2)中所得样品经检测后单一组分的低聚果糖收集保存，含有相同组分的洗脱液混合后浓缩，浓缩至其浓度为40g/L。

(5)Bio-Gel-P2柱分离：将(4)所得浓缩液上Bio-Gel-P2柱，用流速在0.1mL/min的去离子水洗脱，每2mL收集第二洗脱液。

(6)终产品检测：用Waters高效液相色谱仪-2414示差折光检测器进行检测第二洗脱液，色谱柱为Asahipak NH₂P-504E Column(250x 4.6mm)，流动相为乙腈：水(65:35)，柱温30℃，流速1mL/min，上样量为10μL。TLC检测结果见图2，液相色谱结果显示样品1中低聚果糖F3纯度为95％，样品2中低聚果糖F3的纯度为96％。

注：TLC板1-4道依次为低聚果糖，果糖及蔗果三四五糖(F,GF3，GF4，GF5，从上到下)标准品，实施例1分离到的样品1，实施例1分离到的样品2。

实施例2

本实施例的低聚果糖糖单体分离纯化的方法步骤如下：

(1)低聚果糖溶液配制：称取低聚果糖1g加入10mL去离子水配成原溶液

(2)Bio-Gel-P4柱分离：取1mL 100g/L原溶液上样至100mL堆积体积的Bio-Gel-P4柱，用流速在0.2mL/min的去离子水洗脱，每2mL收集一次第一洗脱液。

(3)HPLC检测：将收集的第一洗脱液在示差折光检测器的液相上进行检测。

(4)浓缩：将(2)所得样品经检测后单一组分的低聚果糖收集保存，含有相同组分的洗脱液混合后浓缩，浓缩至其浓度为200g/L。

(5)Bio-Gel-P2柱分离：将(4)所得浓缩液上样Bio-Gel-P2柱，用流速在0.2mL/min的去离子水洗脱，每2mL收集第二洗脱液。

(6)终产品检测：用Waters高效液相色谱仪-2414示差折光检测器进行检测第二洗脱液，色谱柱为Asahipak NH₂P-504E Column(250x 4.6mm)，流动相为乙腈：水(65:35)，柱温30℃，流速1mL/min，上样量为10μL。TLC检测结果见图3，液相色谱结果显示样品1中低聚果糖F4纯度为96％，样品2中低聚果糖F4的纯度为95％。

注：TLC板1-4道依次为低聚果糖，果糖及蔗果三四五糖(F,GF3，GF4，GF5，从上到下)标准品，实施例2分离到的样品1，实施例2分离到的样品2。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。