一种高效制备低聚果糖的方法及其酶制剂的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于应用酶工程领域，具体涉及一株重组基因工程菌及其制备低聚果糖的 方法。
【背景技术】：
[0002] 低聚果糖$1"11〇1：〇〇1丨〖〇83(^1^1^(168)，简称?03，又称寡果糖或鹿果三糖族低聚 糖，分子式为:G-F-Fn，n= 1-3(G为葡萄糖，F为果糖）。它是由蔗糖和1-3个果糖基通过β-2-l 糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖及其混合 物。工业上一般由鹿糖经果糖基转移酶(Fruetosyltransferase，EC 2·4· 1.9，FTS)的转糖 基作用而生成低聚果糖，低聚果糖是一种保健食品，具有很多对人体有益的功能，如它热量 低，促进矿物质吸收，不引起龋齿，降血脂，润肠通便，是双歧杆菌的增殖因子等，其作为功 能性因子被广泛应用于食品中，如奶制品、饮料、糖果糕点、肉类加工品等。所以低聚果糖的 工业化生产对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
[0003] 目前低聚果糖的制备方法有两种:菊粉水解，蔗糖合成。因利用菊粉酶水解菊粉生 产低聚果糖有产品成分复杂，工艺繁琐，成本高等缺点，所以大多数厂家逐渐改用果糖基转 移酶催化蔗糖生产低聚果糖。
[0004] 酶的来源及制备方法。果糖基转移酶存在于植物以及微生物中。据文献报道，植物 中的果糖基转移酶催化活性很弱，产率低，且受到季节限制，而来自微生物的果糖基转移酶 比植物的催化活性高，且耐高温，可催化较高浓度的蔗糖进行转糖基反应，使用方便。具有 果糖基合成酶活性的微生物包括丝状真菌、酵母菌和细菌。不同微生物来源的果糖基转移 酶的相对分子质量、米氏常数、最适作用温度、最适pH及基质特异性方面存在一定差异。如 来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的果糖基转移酶的分子质量为52kDa,最适温度为55°C, 最适pH 6.5,而来源于微杆菌(Microbacterium sp.)的果糖基转移酶的分子质量46kDa,最 适温度48°C，最适pH6.0。再比如来源于黑曲霉的果糖基转移酶在不同pH下，转果糖基活性/ 水解活性不同，在pH 4.0~5.0和pH 8.0时低聚果糖产量最高，而在pH 5.0~8.0范围内的 水解酶活力最高。目前，常被用来作为工业化生产的菌种有黑曲霉(Aspergillus niger)、 日本曲霉(Aspergillus japonicus)、棘抱曲霉(Aspergillus aculeatus)和出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)等。目前，国内外工业化生产的方法主要是通过选出高活性菌 种后破碎菌体、菌体和酶分离制备液体酶制剂，进行低聚果糖的生产，工艺路线较长，设备 多，而且通常制备的低聚果糖产品外观色泽差或呈褐色，产品应用范围受到限制。进一步通 过野生型筛选、理化诱变和工艺条件优化的手段得到的果糖基转移酶普遍活力不高。而基 因工程手段是提高果糖基转移酶活性的有效途径之一。
[0005] 但是，受果糖基转移酶的酶学性质的影响，普遍耐热性差，反应温度不能过高，一 般低于50°C，在此条件下，底物鹿糖的浓度最大为50% (w/v)，通过微生物的果糖基转移酶 来进行低聚果糖的工业化生产，其理论的最大产率仅为55~60%(Yun Jff.Fructooligosaccharides-〇ccurrence, preparation , and application . Enzyme Microb Tech,1996,19:107-117)。这一工艺后的半成品还需要经脱色、精制、浓缩等工艺， 这些工艺存在操作复杂，消耗大，生产成本高等问题。
[0006] 针对目前常用的工业化生产菌种的耐热性差的问题，研究人员普遍从两个方面进 行研究。一种是自然界中寻找耐热性高产果糖基转移酶的菌株。另一种是采用PEG修饰、介 孔分子筛吸水、疏水性溶剂保护和酶的冻干结晶体制备等手段将目前耐热性差的果糖基转 移酶进行耐热性保护。
[0007] 进一步，无论是通过哪一种酶的耐热性保护方法，所获得的在高温下高底物浓度 下具有高活性的果糖基转移酶分子，必须经过高效和廉价的制备，才会具有工业应用的意 义。再进一步，疏水性溶剂可以使酶的结构更加紧密，酶的稳定性提高，利用这一特点，一方 面可以在不增加工艺步骤的前提下，实现高温高底物浓度下的低聚果糖的工业生产；另一 方面，可以缩减后期脱色、精制、浓缩等工艺，提高相关应用工艺技术的完善与优化，降低生 产成本。这对促进我国低聚果糖研究和国民经济发展具有重要的意义。
【发明内容】
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[0008] 为了解决和克服上述低聚果糖生产中酶制剂成本高，生产工艺路线较长，设备多， 成本高等问题和不足，本发明利用基因工程手段实现了黑曲霉来源的果糖基转移酶制剂的 高效表达，并利用疏水性组合溶剂对果糖基转移酶的保护性，成功实现了在高温下、高浓度 蔗糖液中进行低聚果糖的工业生产。利用这一技术，大大缩短了低聚果糖生产工艺路线，减 少了设备投入，降低了生产成本。该方法技术先进，操作简单，生产成本低。
[0009] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：提供一株芽孢杆菌重组菌 株，所述重组菌是通过将黑曲霉来源的果糖基转移酶编码基因fru3基因在芽孢杆菌宿主细 胞中进行高效表达获得，所述重组菌还包含能使果糖基转移酶基因fru3基因在芽孢杆菌中 尚效表达的启动子Pshuttle-09 ;
[0010] 所述fru3基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；
[0011] 所述启动子Pshuttie-09的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0012] 所述芽孢杆菌宿主细胞为地衣芽孢杆菌CBB3008,保藏编号CCTCC No.M 208236， 具体参见中国发明专利ZL 200810235368.0,及Dandan Niu，et al .Microbial Cell Factories,2009,8:58；
[0013] 所述重组菌在下述条件下生产果糖基转移酶的发酵液酶活为1650~1680U/mL:
[0014] 发酵培养基质量体积比组成为:酵母膏2~4%，蛋白胨3.2~5.6%，葡萄糖10~ 30%，pH 4~8;
[0015] 发酵温度42 ± 1°C;发酵过程中维持溶氧为20%以上;发酵12h后，通过流加50 %葡 萄糖溶液，维持葡萄糖浓度为5~10g/L;发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为4~8;发酵时间 为150~180h;
[0016] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是:提供一种高温高糖浓度下生 产低聚果糖的方法，具体为:按每Kg蔗糖(干)加入果糖基转移酶3000~12000U，将果糖基转 移酶加入到2-110% (w/v)的蔗糖溶液中，再按疏水溶剂与蔗糖溶液体积比为2-50%加入疏 水溶剂，控制反应液在pH 3~8,温度在55~100°C，搅拌速度在50~200r/min的条件下反应 4 ~24h;
[0017] 所述疏水溶剂为DMS0,甲基叔丁基醚，异戊醇，正丁醇，叔丁醇，甲酸乙酯，乙酸甲 酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯，环己烷，正庚烷，十二烷中的至少一种；
[0018] 优选地，所述疏水溶剂为由乙酸丁酯、环己烷、正庚烷组成；
[0019] 优选地，所述疏水溶剂为由乙酸丁酯:环己烷:正庚烷按体积比=1:1:1组成。
[0020] 有益效果：
[0021] 1、本发明筛选获得的启动子，实现了果糖基转移酶的高效分泌表达，与原启动子 相比，果糖基转移酶的分泌量提高了3倍多，可以达到1680U/mL以上，本发明有助于降低果 糖基转移酶的发酵制造成本、简化发酵制造工艺以及降低发酵工业环境压力；
[0022] 2、本发明筛选获得果糖基转移酶的启动子的方法，相当于转录效率的优化，有利 于下游的发酵过程;本发明的重组菌的选育方法，经过适当修饰后，可以用于其它类型的工 业酶制剂，特别是以地衣芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌等为宿主细胞的工业 酶制剂生产菌株的选育；
[0023] 3、本发明利用疏水性组合溶剂提高了对果糖基转移酶的保护性，成功实现了在高 温下、高浓度蔗糖液中进行低聚果糖的工业生产，所制备的低聚果糖的糖浆中，蔗果三糖、 蔗果四糖和蔗果五糖的转化率可高达56%~60%，高于同类产品5%~10% ;
[0024] 4、本发明采用的疏水溶剂保护技术，可以提高酶的耐热性，从而提高底物蔗糖溶 液浓度，制备出的低聚果糖无需后期脱色、精制、浓缩等工艺，大大缩短了低聚果糖生产工 艺路线，减少设备投入，节约生产成本20~28%。
【附图说明】：
[0025]图1重组质粒的构