一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维及其制备方法与流程

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维及其制备方法。

背景技术：

膳食纤维是一种多糖，它既不能被胃肠道消化吸收，也不能产生能量。膳食纤维的生理功能：这类物质能刺激肠道蠕动，有利于粪便排出，可预防便秘、直肠癌、痔疮及下肢静脉曲张；可预防动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病的发生；预防胆结石的形成；产生饱腹感，对肥胖病人进食有利，可作为减肥食品；改善耐糖量，可调节糖尿病人的血糖水平，可作为糖尿病人的食品；改善肠道菌群，预防肠癌、阑尾炎等。

过多的摄食膳食纤维会影响其他营养素的吸收。但适量地增加食用膳食纤维对于便秘和肥胖人群说就是非常有益的了。

半乳甘露聚糖是指由甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接形成主链，半乳糖通过α-1,6-糖苷键连接形成侧链组成的天然多分枝杂多糖，广泛存在于多种植物的胚乳及细胞壁中(Thombare et al.International Journal of Biological Macromolecules,2016,88:361-372)。不同来源的半乳甘露聚糖，其半乳糖残基与甘露糖残基的比例也不尽相同，如槐豆和瓜尔豆来源的半乳甘露聚糖中两者的比例分别为1:4和1:2(Malgas et al.Enzyme and Microbial Technology,2015,70:1-8)。瓜尔豆胶是一种来源于瓜尔豆(Cyamopsis tetragonolobus)的天然植物胶，主要成分是半乳甘露聚糖，具有粘度高、易溶于水、稳定性好等多种特性，受到国内外研究者和生产者的广泛关注(Thombare et al.International Journal of Biological Macromolecules,2016,88:361-372)。

半乳甘露聚糖经常被使用在食物产品中，用来增加其水相的黏度，也可以当做食品的安定剂使用。另外，半乳甘露聚糖还被用于医药与美容之中。本品有很低的热量，具有多种生理功能，可促进小肠内双歧杆菌增殖，预防便秘、结肠癌、心血管病和降血糖。可在各类食品中，按生产需要适量使用。

半乳甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染、减少肉鸡球虫病的危害、提高肉鸡均匀度、降低肠道粘度、促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。

通常，瓜尔豆胶中的半乳甘露聚糖中半乳糖残基侧链排列集中且有序，仅少数区域未被半乳糖残基取代(McCleary.Carbohydrate Rresearch,1985,139:237–260)。因此，完全降解瓜尔豆胶中的半乳甘露聚糖需要多种糖苷水解酶的协同作用，如β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)和α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)等(Moreira et al.Applied Microbiology and Biotechnology,2008,79:165-178)。β-甘露聚糖酶随机水解半乳甘露聚糖主链中的β-1,4-糖苷键，形成低分子量寡糖，是瓜尔豆胶降解酶系中最重要的糖苷水解酶。根据氨基酸序列的相似性，β-甘露聚糖酶主要来自糖苷水解酶5、26、113和134家族，广泛存在于细菌、真菌以及高等植物等中(Dhawan et al.Critical Reviews in Biotechnology,2007,27:197-216)。其中来源于糖苷水解酶26家族的β-甘露聚糖酶对富含半乳糖侧链的半乳甘露聚糖活力较高(Malgas et al.Enzyme and Microbial Technology,2015,70:1-8)。

甘露寡糖是指由2-10个甘露糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的寡糖，瓜尔豆来源的甘露寡糖中还含有由α-1,6-糖苷键连接的半乳糖侧链。甘露寡糖具有性质稳定、低热量、不引发龋齿、降血糖等特点，是新一代功能食品配料。因此，瓜尔豆来源的半乳甘露寡糖及可溶性膳食纤维具有非常广阔的市场前景。

申请号为201510174562.2的中国发明专利申请公开了一种利用β-甘露聚糖酶、木聚糖酶和内切葡聚糖酶三种酶复合降解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖的方法；申请号为201510175963.X的中国发明专利申请公开了一种利用β-甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶三种酶复合降解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖的方法；申请号为201510175978.6的中国发明专利申请则公开了一种利用β-甘露聚糖酶、内切葡聚糖酶和纤维二糖酶复合降解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖的方法。

上述方法均为利用多种酶复合酶解瓜尔豆胶制备低聚半乳甘露糖，所制备的酶解液中，甘露寡糖通常占产物的95％以上，但是这些方法制备的产品均为低分子量的半乳甘露寡糖，基本上不含有可溶性膳食纤维。目前，尚未见有关利用瓜尔豆胶制备富含半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维的文献和专利报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维，该膳食纤维含有20％～30％的半乳甘露聚糖，因此，其不仅具有膳食纤维的功能，还增加了半乳甘露聚糖的活性。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维，以质量百分比计，含有20％～30％的半乳甘露寡糖。

优选地，所述半乳甘露寡糖的聚合度为2～6。

优选地，所述富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维的重均分子量为24800Da。

本发明还提供一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维的制备方法，包括如下步骤：

S1：制备含有β-甘露聚糖酶的重组菌；

S2：利用重组菌发酵制备β-甘露聚糖酶；

S3：利用β-甘露聚糖酶水解瓜尔豆胶溶液；

S4：将步骤S3中的酶解液进行过滤、脱色、离子交换和浓缩即得富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维。

优选地，其中在步骤S1中，所述β-甘露聚糖酶的编码基因来源于米黑根毛霉CAU432。

优选地，在所述步骤S1中，所述重组菌为毕赤酵母GS115。

优选地，在所述步骤S2的发酵液中，所述β-甘露聚糖酶的酶活达到74000U/mL。

优选地，在所述步骤S3中，β-甘露聚糖酶与瓜尔豆胶的混合比例为：每克瓜尔胶粉加入β-甘露聚糖酶100～2000U。

优选地，在所述步骤S3中，所述瓜尔豆胶水溶液的浓度为2％～10％。

优选地，在所述步骤S3中，水解的时间为1～24h，水解的温度为30℃～70℃。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1、本发明提供的β-甘露聚糖酶稳定性好，比酶活力高，在食品、饲料等行业中具有很大的应用价值；

2、本发明提供的制备方法，其水解率及半乳甘露聚糖转化率高、产物易于分离、最终产品的重均分子量约为24800Da；

3、利用本发明提供的制备方法可以生产含半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维糖浆和糖粉两种产品，且产品收率高，其收率分别为74.2％和72.8％。

附图说明

图1为重组菌毕赤酵母GS115的生长状况(以菌体湿重计)及发酵产生的蛋白质以及分泌的β-甘露聚糖酶的实验结果图；

图2为不同加酶量水解瓜尔豆胶所得酶解液和粗糖液的粘度及粗糖液中还原糖的得率；

图3为水解产物凝胶排阻色谱分析图；

图4为水解产物中半乳甘露寡糖及可溶性膳食纤维薄层层析色谱分析图；

图5为富含半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维的扩大生产的工艺流程图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将参照附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维，重均分子量为24800Da，其中，半乳甘露寡糖的质量百分比为20％～30％，半乳甘露寡糖的聚合度为2～6。

本发明还提供一种富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维的制备方法，包括如下步骤：

S1：制备含有β-甘露聚糖酶的重组菌，其中β-甘露聚糖酶的编码基因来源于米黑根毛霉CAU432；

S2：微生物发酵：利用重组菌发酵制备有β-甘露聚糖酶；

S3：利用β-甘露聚糖酶水解瓜尔豆胶溶液；

S4：将步骤S3中的酶解液进行过滤、脱色、离子交换和浓缩即得富含半乳甘露聚糖的可溶性膳食纤维。

作为本实施例优选的实施方式，在步骤S1中，重组菌为毕赤酵母GS115。

作为本实施例优选的实施方式，在步骤S2的发酵液中，β-甘露聚糖酶的酶活达到74000U/mL。

作为本实施例优选的实施方式，在步骤S3中，β-甘露聚糖酶与瓜尔豆胶的混合比例为：每克瓜尔胶粉加入β-甘露聚糖酶100～2000U。

作为本实施例优选的实施方式，在步骤S3中，瓜尔豆胶水溶液的浓度为2％～10％。

作为本实施例优选的实施方式，在步骤S3中，水解的时间为1～24h，水解的温度为30℃～70℃。

实施例2

一、重组菌的获得

S1：以米黑根毛霉CAU432cDNA为模板，用ManF(5′-CCATGTACGTAGCTTCTTCGTTTGTCCAGACAAG-3′)和ManR(5′-CCGCCTAGGTCACTTCTTGGCCATGGCATC-3′)组成的引物对，按照波利特等人的提供的方法(Katrolia et al.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61:394-401)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

S2：用限制性内切酶SnaBI和AvrII对S1中所得的PCR扩增产物进行双酶切，回收酶切后的DNA片段；用限制性内切酶SnaBI和AvrII对pPIC9K载体进行双酶切，回收酶切后的骨架载体；将DNA片段与骨架载体连接，得到重组载体甲(即在pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点之间插入了编码米黑根毛霉来源β-甘露聚糖酶的DNA片段)。

S3：将重组载体甲转化巴斯德毕赤酵母GS115，得到含有重组载体甲的重组菌毕赤酵母GS115。

二、重组菌毕赤酵母GS115的发酵

1、发酵方法

发酵方法参照文献“Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B,053002,Invitrogen)”中的方法。发酵采用5L发酵罐。种子培养基、发酵基本培养基、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基参照上述文献中的方法配制。整个发酵过程采用分批培养、甘油分批补料培养、100％甲醇诱导培养三个阶段。具体使用的培养基及操作过程如下：

实验过程中所用的培养基及其成分如下，其中各成分均按照重量百分比计算。

BMGY培养基：1％酵母浸粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％Biotin，1％甘油，100mmol/L pH 6.0磷酸钾缓冲溶液。

BSM培养基：2.67％磷酸，0.093％CaSO₄，1.82％K₂SO₄，1.49％MgSO₄·H₂O，0.413％KOH，4％甘油。

毕赤酵母高密度发酵

种子培养：从保藏的甘油管吸取150μL菌液接种于150mL BMGY培养基中，30℃，200rpm的条件下振荡培养至OD600＝10.0左右。

分批培养：发酵罐装1.5L BSM培养基，灭菌后，浓氨水调节pH至4.0，加入6.535mL PTM1溶液(毕赤酵母痕量金属盐溶液)，接种150mL种子液，接种量10％(V/V)，转速600rpm，通气量1.0vvm，发酵18～24h。

甘油分批补料培养：待分批培养至甘油耗尽后，开始流加甘油，流速18.4mL/h/L起始发酵液，始终监视DO(溶解氧)，通过停止流加、调整转速和通气量等保持DO＞20％。流加时间4h，待OD600达180～220左右，停止流加。

100％甲醇诱导培养：停止流加甘油后，饥饿30min左右，流加100％甲醇诱导培养基，在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液增加至10.9mL/h/L起始发酵液左右，监控DO＞15％。发酵过程中取样分析细胞浓度、酶活和蛋白含量。

2、发酵结果

检测发酵过程中上清液中β-甘露聚糖酶的酶活力。酶活力的测定方法如下：

取0.1mL适当稀释的酶液，加入到0.9mL 0.5％(质量体积比)的槐豆胶底物溶液中(用50mM，pH 7.0的柠檬酸磷酸缓冲液配制)，55℃水浴反应10min，以甘露糖作为标准，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定所释放的还原糖量。

1个β-甘露聚糖酶酶活单位的定义：在pH7.0、55℃条件下，每分钟分解0.5％槐豆胶底物释放1μmol的甘露糖所需要的酶量，酶活计算公式为：H＝Cx×n/(T×V)，其中，H代表酶活力(U/mL)，Cx代表生成甘露糖物质的量(μmol)，n代表酶液的稀释倍数，T代表反应时间(min)，V代表加入稀释后的酶液体积(mL)。

比酶活定义为1mg蛋白所具有的酶活力单位，表示为U/mg。

发酵过程中，随着发酵时间的延长，重组菌毕赤酵母GS115的生长状况(以菌体湿重计)及发酵产生的蛋白质以及分泌的β-甘露聚糖酶的历程如图1所示。图1中，三角形点代表菌体湿重(g/L)；方形点代表发酵液酶活力(U/mL)；圆形点代表发酵液蛋白浓度(mg/mL)。

从图1中可以看出，随着发酵时间的延长，菌体湿重、蛋白质含量以及发酵液的酶活力均增加。当发酵时间为168h，菌体湿重、蛋白质含量以及发酵液的酶活力均达到最大值，此时，重组菌毕赤酵母GS115的发酵上清液中β-甘露聚糖酶的酶活力达到74000U/mL，发酵液蛋白含量达到9.2mg/mL，菌体湿重达445g/L。

三、利用β-甘露聚糖酶水解瓜尔豆胶

称取瓜尔豆胶5g完全溶解于100mL蒸馏水中(蒸馏水亦可换为pH为7.0的磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等)，按照与瓜尔豆胶的比例分别为100、200、400、800、1000和2000U/g的比例加入β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液。

用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量酶解液的粘度。所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即粗糖液，在相同条件下测量粗糖液的粘度，并用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖含量并计算还原糖得率。

不同加酶量水解瓜尔豆胶后，所得酶解液和粗糖液的粘度及还原糖的得率如图2所示。图2中，方形点代表还原糖的得率。从图2中可以看出，随着酶量的逐渐增加，酶解液及粗糖液的粘度逐渐下降，同时粗糖液中还原糖得率逐渐上升。β-甘露聚糖酶的加入量在100～2000U/g，酶解8h后，粗糖液还原糖得率从7.5％增加到20.0％，酶解液粘度从180mPa·s降低至60mPa·s，粗糖液粘度从80mPa·s降低至32mPa·s。考虑到成本问题，β-甘露聚糖酶的加入的最佳量为1000U/g。

实施例3、β-甘露聚糖酶在不同水解时间水解瓜尔豆胶的实验结果

称取瓜尔豆胶5g溶于100mL蒸馏水中，按照与瓜尔豆胶的比例为1000U/g加入β-甘露聚糖酶，分别置于50℃下水解1、2、4、8、12、24h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液，所得酶解液于10000rpm离心10min后，收集上清液，即得粗糖液。用DV-1旋转粘度计于25℃条件下测量粗糖液的粘度，并用3,5-二硝基水杨酸法测定粗糖液中还原糖含量并计算还原糖得率。

不同水解时间水解瓜尔豆胶所得粗糖液粘度及还原糖得率如表1所示。

表1不同水解时间水解瓜尔豆胶所得粗糖液粘度及粗糖液还原糖得率

从表1中可知，随着酶解时间逐渐延长，粗糖液粘度逐渐下降，同时粗糖液中还原糖得率逐渐上升。瓜尔豆胶经1000U/g的β-甘露聚糖酶酶解1-24h后，粗糖液还原糖得率从6.3％增加到24.9％，粗糖液粘度则从294mPa·s降低至32mPa·s。

实施例4、水解产物凝胶排阻色谱分析

瓜尔豆胶5g溶于100mL蒸馏水中，按照与瓜尔豆胶的比例分别加入1000U/g的β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液，于10000rpm离心10min后，收集上清液(粗糖液)，粗糖液经过真空冷冻干燥后，得到粉末状产品，即为含有半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维。

取冷冻干燥后的样品6mg，溶于3mL蒸馏水后，用0.22μm滤膜过滤后，进行凝胶排阻色谱分析。色谱柱为PL aquagel-OH MIXED(7.5mmI.D×30cm)，柱温40℃，流动相0.1M NaNO₃，以甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五塘为标准品。

水解产物凝胶排阻色谱结果如图3所示。从图中可以看出，水解产物的重均分子量为24800Da，其分散指数为9.47。

实施例5、水解产物中各组分分离及薄层层析分析

称取瓜尔豆胶5g溶于100mL蒸馏水中，按照与瓜尔豆胶的比例为1000U/g加入β-甘露聚糖酶，置于50℃下水解8h，酶解后沸水浴灭活10min，得到酶解液，于10000rpm离心10min后，收集上清液(粗糖液)，上清液经真空冷冻干燥后，得到含有半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维产品。

取1g产品溶于水后，加入无水乙醇，直至乙醇浓度达到80％(V/V)，静置30min后，于10000rpm下离心5min，分别收集沉淀和上清液。沉淀用80％(V/V)乙醇清洗3次后真空冷冻干燥即得可溶性膳食纤维，上清液经过旋转蒸发浓缩后冷冻干燥即得半乳甘露寡糖。经过多次试验，所得产品中半乳甘露寡糖约占20％～30％，可溶性膳食纤维约占70％～80％。

将得到的可溶性膳食纤维和半乳甘露寡糖配制成10mg/mL的溶液，进行薄层层析色谱分析。上样量1μL，展层剂为正丁醇：乙酸：水(2：1：1)，显色剂为甲醇：硫酸(95：5)。薄层层析结果如图4所示，其中1为可溶性膳食纤维，2为半乳甘露寡糖。可以看出，可溶性膳食纤维中基本不含聚合度小于6的半乳甘露寡糖，而半乳甘露寡糖则主要为甘露二糖和甘露三糖及少量含有半乳糖侧链的低聚合度甘露寡糖。

实施例6、含半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维的扩大生产

按照实施例1中的方法进行β-甘露聚糖酶发酵

如图5所示，在20L酶解罐中注入18L蒸馏水，加入900g瓜尔豆胶，按照与瓜尔豆胶的比例为1000U/g加入β-甘露聚糖酶，将酶解罐升温至50℃水解8h，经过100℃灭酶后冷却至室温。将酶解液放出后进行板框过滤(可以选择其他过滤方法)，加入硅藻土助滤，硅藻土的添加量为3kg/m²；收集滤液活性炭脱色，活性炭添加量为0.5％，80℃保温30min；脱色后过滤除去活性炭进行离子交换处理，按照阳离子、阴离子、阴离子、阳离子树脂顺序处理，阳离子树脂为001×7，阴离子树脂为D301；离子交换处理后通过薄膜浓缩或旋转蒸发浓缩。浓缩步骤可将糖液制成高浓度糖浆，其中可溶物的含量为30％～50％；也可经适当浓缩后，经喷雾干燥制成糖粉。

利用β-甘露聚糖酶水解瓜尔豆胶制备含半乳甘露寡糖的可溶性膳食纤维，经过计算酶解、过滤、脱色、离子交换、浓缩各个步骤的得率依次为86.9％、82.3％、80.7％、78.4％和74.3％。最终获得糖浆和糖粉的得率分别为74.2％和72.8％。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。