道地黄芪固氮菌新菌株t16及发酵液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物固氮细菌的利用领域，具体地说是涉及一种道地中药黄芪固氮菌 tl6及发酵液的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，全球种植业过分依赖和大量施用化肥造成的肥料浪费、土壤和地下水污 染以及生态失衡已经引起了世界各国的广泛关注。减少化肥的使用、提高氮肥利用率是当 前农业生产中急需解决的重要问题。充分发挥固氮细菌的生物固氮作用是减少氮肥使用量 最有效的途径，生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位。 生物固氮是自然界中仅次于光合作用的复杂生物反应系统，为全球的植物提供了大约75% 的氮素。生物固氮在提高土壤肥力、增强植物抗病能力等方面也发挥着极其重要的作用。
[0003] 固氮细菌根据其生活习性可分为自身固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌三类。自 身固氮菌是指在自由生活状态下能够固氮的细菌，其种类不多，分布很广，如圆褐固氮菌和 拜叶林克氏固氮菌。联合固氮菌是指定植于植物根表和近根土壤中，有的能侵入表皮和外 皮层的细胞间隙，靠根系分泌物生存、繁衍，与植物根系有密切的关系的固氮细菌，如雀稗 固氮菌和产脂固氮螺菌。共生固氮菌的细菌只有根瘤菌一类，其广泛存在于土壤中，浸染豆 科植物根部形成根瘤，能将空气中的氮气转化为氨提供给植物。上述三类固氮菌中，自身固 氮菌由于其固氮效率低，且固氮特殊，不适合在农业方面广泛应用，所以目前农业方面主要 应用联合固氮菌和共生固氮菌。
[0004] 黄苗（Bunge)是豆科黄苗属多年生草本植物，又名绵 芪。在我国产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。黄芪具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、 抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用，作为药用已有2000多年的历史。由于长期大 量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险。在黄芪种植过程中，各项 农资投入中化肥尤其是氮肥所占比重很大，其对黄芪的产量和活性成分聚集的影响也最显 著。而黄芪作为豆科植物，其根际土壤中也共生有大量固氮菌，发挥着重要的固氮作用。山 西浑源县是中药材黄芪的产地。得益于当地水土，浑源所产黄芪甲甙、多糖等含量均为国内 之首，并于2011年获批国家地理标志证明商标"正北芪"。根据浑源道地黄芪的正宗药用性 和原产地有用成份这一地理标识产物，以其原生地土壤根瘤菌为研究基础，对道地黄芪的 固氮根瘤菌进行分离，筛选和鉴定，并对其培养条件和生理生化以及生物信息学方面进行 研究。该研究为利用生物固氮在黄芪生产上实现节肥减耗、加强黄芪种植业生态系统的良 性循环提供科学基础和技术支持。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一株道地黄芪固氮菌新菌株tl6及发酵液的制备方法，该发 酵液具有非常明显的固氮活性。
[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
[0007] 一株道地黄苗固氮菌（热sp.)新菌株tl6于2014年9月18日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 9676,地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0008] 所述的道地黄苗固氮菌sp.)新菌株tl6是从山西省浑源地区的黄苗 生长土壤为材料分离得到的根瘤细菌。
[0009] 将道地黄芪固氮菌在Ashby无氮培养基上，新菌株116的菌落在YMA平板上呈圆 形，白色，半透明，湿润(见图1)。革兰氏染色，显示新菌株tl6为革兰氏阴性杆菌(见图2)， 孔雀绿染色呈阴性，提示新菌株tl6细胞内不含有芽胞(见图3)。根据《常见细菌系统鉴定 手册》对新菌株tl6进行了生理生化鉴定，结果见表1。
[0010] 表1本发明新菌株tl6的生理生化特征
【主权项】
1. 一株道地黄茂固氮菌（化izo如'u曲sp.)新菌株tl6于2014年9月18日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中也，保藏号为CGMCC No. 9676。
2. 根据权利要求1所述的道地黄茂固氮菌（化izo如'u? sp.)新菌株tl6,其特征在于， 所述的道地黄茂固氮菌（化izo如'册？ SP.)新菌株tl6是从山西省大同市浑源县黄茂基地± 壤中分离得到的细菌；将道地黄茂固氮菌在Ashby无氮培养基上，新菌株tl6的菌落在YMA 平板上呈圆形，白色，半透明，湿润；革兰氏染色，显示新菌株tl6为革兰氏阴性杆菌；孔雀 绿染色呈阴性，提示新菌株tl6细胞内不含有芽胞；根据《常见细菌系统鉴定手册》对新菌 株tl6进行了生理生化鉴定，结果如下表所示： 本发明新菌株tl6的生理生化特征
注；" + "表示呈阳性反应；"一"表示呈阴性反应 提取黄茂固氮菌新菌株tl6的基因组DNA，利用PCR反应扩增其16S rRNA部分序列，得 到一条约为1500bp左右的DNA片段；测序后获得序列长度为1309bp，测序结果使用BLAST 软件在GeneBank数据库中进行同源性比对，结果显示，新菌株tl6与化izo如'uffl /a知e的 16S rRNA基因序列同源性为100%(KF465964. 1)，结合形态观察及生理生化试验，将新菌株 tl6 石角《备sp.。
3. 根据权利要求1所述的道地黄茂固氮菌新菌株tl6,其发酵液的制备方法包括如下 步骤： (1) 种子液制备从试管斜面上用接种针挑取新菌株tl6到斜面培养基（由YM液体培 养基添加1. 5%琼脂制成培养斜面）上，恒温28°C培养2化后接种到装有lOOmL的LB培养 液的H角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得种子液； (2) 发酵液制备将（1)制备的种子液按体积比1%的比例接入发酵培养基，培养条件 是；28°C、初始抑为6. 8?7. 0、摇床转速180 - 2(K)r/min震荡培养30h，制得发酵液。
4. 根据权利要求3所述的道地黄茂固氮菌新菌株tl6发酵液的制备方法，其特征在于， 所述的发酵培养基是由下列质量体积比的成分组成；甘露醇14份，酵母粉5份，M拆〇4 ?7&0 0. 1份，馬册〇4 0. 3-0. 4份，化C1 0. 3-0. 4份，CaCl2 0. 01份，&0 1000份，所配得的培养 基抑6. 8?7. 0。
5. 根据权利要求1所述的道地黄茂固氮菌新菌株tl6的使用的方法是；将含菌浓度为
106ml-i的发酵液浸种化后播种。
【专利摘要】本发明公开了一株道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16，于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9676。本发明详细描述了道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16的形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列测定结果等。经固氮试验表明，本发明道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16的发酵液对道地黄芪有较好的固氮作用，可以有效地为道地黄芪生长提供天然氮源需要，从而对道地黄芪的天然品质提供相应的营养来源。CGMCC No. 967620140918
【IPC分类】C12N1-20, C05F11-08
【公开号】CN104593302
【申请号】CN201510024724
【发明人】唐中伟, 梁建萍, 周然, 薛智权, 李 浩, 李倩
【申请人】山西农业大学, 山西中医学院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月19日