一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物芽孢诱导领域，具体涉及一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的 方法，特别涉及一种可用于大规模生产的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法。
【背景技术】
[0002] 嗜热脂肪芽孢杆菌为革兰阳性菌，需氧或兼性厌氧，利用葡萄糖产酸不产气。嗜热 脂肪芽孢杆菌可产芽孢，最佳生长温度为55-60°C，最高生长温度为65-75°C，属于嗜热菌。 中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)收藏编号为CICC:10267,即ATCC:7953。
[0003] 嗜热脂肪芽孢杆菌所产芽孢无致病性、无热原、无毒。其芽孢对一定灭菌因子有 确定的抗力，尤其对压力蒸汽的抗力强于大多数微生物，因此在我国，欧洲，美国，日本等地 作为热力灭菌生物指示剂的标准菌株。嗜热脂肪芽孢杆菌含有多种抗药性隐蔽质粒，因此 在国标GB/T4789. 27-2008中规定了运用嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法检测鲜乳中的抗生素含 量。嗜热脂肪芽孢杆菌及抗生素残留检测方法（专利号：2009100662870,公开了一种利用 嗜热脂肪芽孢杆菌检测抗生素的方法）。嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢因其特性，在消毒检验监 测领域的应用越来越广泛。因此对芽孢生成机理及诱导条件等方面的工作需要继续深入。
[0004]目前，现有技术中，已经可以实现对嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢进行小剂量的制备， 但在大规模量产时，却存在许多技术障碍：1)如何在固态的培养基上简便高效地刮取大量 的高活性高产率的菌株；2)如何开发出一款成本低廉，适合大批量生产的诱导产孢培养 基。
【发明内容】
[0005] 针对上述不足之处，本发明的目的是提出一种成本低廉，操作简便，可大规模制备 嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法。
[0006] 本发明的技术方案概述如下：
[0007] 一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表 面，在50?60°C下培养12?24h后，所述菌种长出菌苔；所述活化培养基由以下重量份的 材料组成：1〇重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的 氯化钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
[0009] 步骤2)菌体增殖：将含所述菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在50? 60°C环境中，转速100?250rpm/min条件下培养12h ;所述增殖培养基由以下重量份的材 料组成：5?10重量份的胰蛋白胨、5?10重量份的大豆蛋白胨、5?10重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
[0010] 步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无 菌滤纸1?5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50?60°C下培养24h;所述筛选培 养基由以下重量份的材料组成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、1? 5重量份的牛肉浸膏、0. 01?0. 1重量份的KH2P04、0. 1?1重量份的MnS04 ?H20、0. 1?1 重量份的MgS04 ? 2H20、0. 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、10?20重量份的琼脂和1000重量 份的蒸馏水；
[0011] 步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50?60°C环境 中，转速100?200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30?50°C，继续培养12h，得到 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；所述产孢培养基由以下重量份的材料组成：1?5重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的酵母提取物、0. 01?0. 1重量份的NaCl、0. 1?1重量份的MnS04 ?H20、 〇? 1?1重量份的MgS04.21120、0. 01?1重量份的CaCl2 .2H20、5?10重量份的PEG6000、 0. 5?5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
[0012] 优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，在所述活化培养基、增殖 培养基、筛选培养基和产孢培养基中用HC1或NaOH调节pH在7. 0?7. 3之间。
[0013] 优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，所述增殖培养基由以下 重量份的材料组成5重量份的胰蛋白胨、7. 5重量份的大豆蛋白胨、7. 5重量份的酪蛋白 胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
[0014] 优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，所述筛选培养基由以下 重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、 0. 05重量份的KH2P04、0. 5重量份的MnS04 ?H20、0. 5重量份的MgS04 ? 2H20、0. 5重量份的 CaCl2 ? 2H20、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
[0015] 优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，所述产孢培养基由以下 重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0. 05重量份的NaCl、0. 5 重量份的MnS04 ?H20、0. 5重量份的MgS04 ? 2H20、0. 5重量份的CaCl2 ? 2H20、7. 5重量份的 PEG6000、2. 5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
[0016] 优选的是，所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，在步骤3)中无菌滤纸的 数量为5张，且选取第三张或第四张滤纸放入步骤4)的产孢培养基中。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明通过改进培养基的配方及培养条件，可在短时间内 大批量制备芽孢，且培养基成分廉价易得，工艺条件简单、生产周期短，整个制备工艺一个 批次耗时在90小时内，本案提供了一种简单的培养方法和工业化发酵培养的路线，它诱导 生产的芽孢纯度高，含量可达1X109个/mL，芽孢转化率大于98%。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书 文字能够据以实施。
[0019] 本案提出一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
[0020] 步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表 面，在50?60°C下培养12?24h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料 组成：1〇重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化 钠、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
[0021] 步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在 50?60°C环境中，转速100?250rpm/min条件下培养12h;增殖培养基由以下重量份的材 料组成：5?10重量份的胰蛋白胨、5?10重量份的大豆蛋白胨、5?10重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水；
[0022] 步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无 菌滤纸1?5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50?60°C下培养24h;筛选培养 基由以下重量份的材料组成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、1?5 重量份的牛肉浸膏、〇. 01?〇. 1重量份的KH2P04、0. 1?1重量份的MnS04，H20、0. 1?1重 量份的MgS04 ? 2H20、0. 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、10?20重量份的琼脂和1000重量份 的蒸馏水；
[0023] 步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50?60°C环境 中，转速100?200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30?50°C，使其在低温下能够 形成休眠体，以提高芽孢转化的速率，继续培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢；产 孢培养基由以下重量份的材料组成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、 0? 01?0? 1重量份的NaCl、0. 1?1重量份的MnS04 ?H20、0. 1?1重量份的MgS04 ? 2H20、 0? 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、5?10重量份的PEG6000、0. 5?5重量份的琼脂和1000 重量份的蒸馏水。
[0024] 芽孢的培养对培养体系的pH值有较严格的要求，因此在活化培养基、增殖培养 基、筛选培养基和产孢培养基中，它们的pH值应被限制，可用HC1或NaOH调节使其pH稳定 在7. 0?7. 3之间。
[0025] 本方法中所用的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母提取物和牛肉浸膏均是市 售的成熟商品，它们具有多种购买渠道，且都具有清楚明确的成分组成。其中，胰蛋白胨的 CAS号为91079-40-2,可购自Sigma-Aldrich试剂公司，产品编号17293。大豆蛋白胨的 CAS号为91079-46-8,