5重量份的 MgS04 *21120、0. 5重量份的CaCl2 *2H20、7. 5重量份的PEG6000、2. 5重量份的琼脂和1000重 量份的蒸馏水。
[0048] 对比例1
[0049] -种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
[0050] 步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表 面，在58°C下培养18h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重 量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量 份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
[0051] 步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在 58°C环境中，转速200rpm/min条件下培养12h;增殖培养基由以下重量份的材料组成：7. 5 重量份的胰蛋白胨、7. 5重量份的大豆蛋白胨、7. 5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和 1〇〇〇重量份的蒸馏水；
[0052] 步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，将步骤2)所得菌液加到筛选培 养基中，在58°C下培养24h;筛选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3 重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、0. 05重量份的KH2P04、0. 5重量份的MnS04*H20、 0. 5重量份的MgS04? 2H20、0. 5重量份的CaCl2 ? 2H20、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸 馏水；
[0053] 步骤4)芽孢诱导：将步骤3)筛选培养基表面形成芽孢聚集体的菌种刮取出，放入 产孢培养基中，在58°C环境中，转速150rpm/min条件下培养12h后，改变温度至40°C，继续 培养12h，最终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重 量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0. 05重量份的NaCl、0. 5重量份的MnS04 ?&0、0. 5 重量份的MgS04 5重量份的CaCl2 *2H20、7. 5重量份的PEG6000、2. 5重量份的琼脂 和1000重量份的蒸馏水。
[0054] 对比例2
[0055] -种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤：
[0056] 步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表 面，在58°C下培养18h后，此时菌种长出菌苔；活化培养基由以下重量份的材料组成：10重 量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、15重量 份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
[0057] 步骤2)菌体增殖：将上步得到的含菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在 58°C环境中，转速200rpm/min条件下培养12h;增殖培养基由以下重量份的材料组成：7. 5 重量份的胰蛋白胨、7. 5重量份的大豆蛋白胨、7. 5重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和 1〇〇〇重量份的蒸馏水；
[0058] 步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖 无菌滤纸5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在58°C下培养24h;筛选培养基由以 下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份的牛肉浸膏、 0. 05重量份的KH2P04、0. 5重量份的MnS04?H20、0. 5重量份的MgS04? 2H20、0. 5重量份的 CaCl2 ? 2H20、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水；
[0059] 步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的第3张或第4张无菌滤纸放入产孢培养基中， 在58°C环境中，转速150rpm/min条件下培养12h后，改变温度至40°C，继续培养12h，最 终得到嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢；产孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋 白胨、3重量份的酵母提取物、0. 05重量份的NaCl、0. 5重量份的MnS04 ?H20、0. 5重量份的MgS04 ? 2H20、0. 5重量份的CaCl2 ? 2H20、2. 5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
[0060] 下表是按照实施例1?3及对比例1和2的方法进行生产的参数结果：
[0061]
【主权项】
1. 一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括以下步骤： 步骤1)菌种活化：以嗜热脂肪地芽孢杆菌为菌种，将菌种接种于活化培养基表面，在 50?60°C下培养12?24h后，所述菌种长出菌苔；所述活化培养基由以下重量份的材料组 成：10重量份的胰蛋白胨、5重量份的大豆蛋白胨、5重量份的酪蛋白胨、5重量份的氯化钠、 15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水； 步骤2)菌体增殖：将含所述菌苔的活化培养基加入到增殖培养基中，在50?60°C环 境中，转速100?250rpm/min条件下培养12h ;所述增殖培养基由以下重量份的材料组成： 5?10重量份的胰蛋白胨、5?10重量份的大豆蛋白胨、5?10重量份的酪蛋白胨、1?5 重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水； 步骤3)菌体筛选：在无菌平皿中加入筛选培养基，并在筛选培养基的表面覆盖无菌滤 纸1?5张，将步骤2)所得菌液加到无菌滤纸上，在50?60°C下培养24h ;所述筛选培养 基由以下重量份的材料组成：1?5重量份的酪蛋白胨、1?5重量份的酵母提取物、1?5 重量份的牛肉浸膏、〇. 01?〇. 1重量份的KH2P04、0. 1?1重量份的MnS04，H20、0. 1?1重 量份的MgS04 ? 2H20、0. 01?1重量份的CaCl2 ? 2H20、10?20重量份的琼脂和1000重量份 的蒸馏水； 步骤4)芽孢诱导：将步骤3)中的无菌滤纸放入产孢培养基中，在50?60°C环境中， 转速100?200rpm/min条件下培养12h后，改变温度至30?50°C，继续培养12h，得到嗜 热脂肪芽孢杆菌的芽孢；所述产孢培养基由以下重量份的材料组成：1?5重量份的酪蛋白 胨、1?5重量份的酵母提取物、0. 01?0. 1重量份的NaCl、0. 1?1重量份的MnS04 ? H20、 〇? 1?1重量份的MgS04.21120、0. 01?1重量份的CaCl2 .2H20、5?10重量份的PEG6000、 0. 5?5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
2. 根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，在所述 活化培养基、增殖培养基、筛选培养基和产孢培养基中用HC1或NaOH调节pH在7. 0?7. 3 之间。
3. 根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，所述增 殖培养基由以下重量份的材料组成：7. 5重量份的胰蛋白胨、7. 5重量份的大豆蛋白胨、7. 5 重量份的酪蛋白胨、3重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
4. 根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，所述筛 选培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、3重量份 的牛肉浸膏、〇. 05重量份的KH2P04、0. 5重量份的MnS04 ?%0、0. 5重量份的MgS04 dKCKO. 5 重量份的CaCl2 ? 2H20、15重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
5. 根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，所述产 孢培养基由以下重量份的材料组成：3重量份的酪蛋白胨、3重量份的酵母提取物、0. 05重 量份的 NaCl、0. 5 重量份的 MnS04 ?%0、0. 5 重量份的 MgS04 *21120、0. 5 重量份的 CaCl2 *2H20、 7. 5重量份的PEG6000、2. 5重量份的琼脂和1000重量份的蒸馏水。
6. 根据权利要求1所述的制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，其特征在于，在步骤 3)中无菌滤纸的数量为5张，且选取第三张或第四张滤纸放入步骤4)的产孢培养基中。
【专利摘要】本发明公开了一种制备嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢的方法，包括步骤：菌种活化、菌体增殖、菌体筛选和芽孢诱导；其中，在菌体筛选时在培养基表面覆盖有1～5张无菌滤纸，在芽孢诱导时在培养基中加入5～10重量份的PEG6000。本发明通过改进培养基的配方及培养条件，可在短时间内大批量制备芽孢，且培养基成分廉价易得，工艺条件简单、生产周期短，整个制备工艺一个批次耗时在90小时内，本案提供了一种简单的培养方法和工业化发酵培养的路线，它诱导生产的芽孢纯度高，含量可达1×109个/mL，芽孢转化率大于98％。
【IPC分类】C12R1-07, C12N3-00
【公开号】CN104593315
【申请号】CN201510003938
【发明人】尹焕才, 田晶晶
【申请人】中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月6日