用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物生物技术领域，具体涉及用于制备细菌素durancin GL的重组 囷、制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素是一类由核糖体产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在革兰氏阳性和革 兰氏阴性菌中广泛存在，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点。在对化学防腐 剂的安全隐患越来越重视的今天，食品级微生物来源的细菌素作为生物防腐剂的应用符合 消费者对于安全、健康和天然的要求。
[0003] 来源于耐久肠球菌、能够专一'丨生抑制李斯特菌的细菌素durancinGL，在食品工业 中具有重要的潜在应用价值。采用耐久肠球菌发酵制备细菌素durancinGL，发酵液中目标 产物浓度较低，发酵液成分复杂，因此分离有活性细菌素的过程耗时费力，成本高，且纯度 难以保证。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于制备细菌素durancinGL的重组菌，该重组菌构 建方便，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组细菌素durancinGL，菌体裂解 液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素 durancinGL〇
[0005] 本发明的另一目的是提供所述重组菌的制备方法，该方法简单，效率高。
[0006] 本发明的再一目的是提供制备细菌素durancinGL的方法，诱导培养重组菌后，仅 需要通过简单的亲和色谱就能够高效分离重组细菌素durancinGL，水解后除去标签蛋白， 就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现。
[0008] 本发明提供用于制备细菌素durancinGL的重组菌，所述重组菌携带由细菌素 durancinGL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。
[0009] 在本发明中，所述纯化标签通过酶切位点连接在细菌素durancin GL的一端或两 端。
[0010] 优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通 过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。
[0011] 另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而 成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0012] 另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列 如SEQIDN0:3 所示。
[0013] 本发明还提供所述重组菌的制备方法，将由细菌素durancinGL、纯化标签和酶切 位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大 肠杆菌，得到所述重组菌。
[0014] 优选的技术方案中，所述重组载体是将由细菌素durancinGL、酶切位点相连形成 的融合蛋白的编码基因插入表达载体PGEX-6P-1后获得。
[0015] 本发明还提供制备细菌素durancinGL的方法，诱导所述重组菌表达由细菌素 durancinGL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离 心取上清液，采用HisTrapHP柱和GSTrap4B柱分离或者采用GSTrap4B柱分离，收集洗 脱峰，采用肠激酶酶解所述由细菌素durancinGL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋 白，除去酶解液中的纯化标签，得到细菌素durancinGL。
[0016] 本发明巧妙构建了制备细菌素durancinGL的重组菌，在诱导条件下能够高效表 达带有纯化标签的重组细菌素durancinGL，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进 行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancinGL。
[0017] 本发明制备细菌素durancinGL的方法，是通过诱导重组菌表达带有纯化标签的 重组细菌素durancinGL，然后采用亲和色谱分离，水解并除去纯化标签，就能够获得大量、 高纯度、有活性的细菌素，该细菌素的结构和功能与天然durancinGL完全一致。携带有 GST标签和His标签的重组细菌素durancinGL的分离纯化效果显著好于仅含有GST标签 的重组细菌素durancinGL，前者得到的具有活性的细菌素durancinGL的纯度也显著大于 后者所得细菌素durancinGL。
[0018] 以下结合说明书附图对本发明作进一步的描述。
【附图说明】
[0019] 图1为携带有细菌素durancinGL基因的重组表达载体构建过程，其中durAB为 细菌素durancinGL的基因(包括结构和免疫基因），Ptac为乳糖操纵子和色氨酸操纵子的 杂合启动子；GST为GST标签编码基因的缩写，His是His标签编码基因的缩写。
[0020] 图2重组菌1的重组durancinGL粗提液采用HisTrapHP柱分离纯化的色谱图。 图中横坐标为流过色谱柱的流动相体积，单位为mL;纵坐标为流出液在280nm波长下的吸 收值，单位为mAU。箭头所示吸收峰的出现表明重组durancinGL被有效的分离出来。
[0021] 图3HisTrapHP柱或GSTrap4B柱一步分离纯化重组细菌素durancinGL的 SDS-PAGE电泳结果。泳道1为重组菌1的重组细菌素durancinGL粗提液，泳道2为重组 菌1的重组细菌素durancinGL粗提液经HisTrapHP柱一步分离纯化得到的重组细菌素 durancinGL，泳道3为重组菌2的重组细菌素durancinGL粗提液经GSTrap4B柱一步分 离纯化得到的重组细菌素durancinGL。图中箭头所示的条带为目标蛋白所在的位置，其余 条带为杂蛋白。
[0022] 图4经HisTrapHP柱和GSTrap4B柱两步纯化获得的重组菌1的重组细菌素 durancinGL的SDS-PAGE电泳结果。泳道2为蛋白质Marker,从上到下各条带分子量依次 为 97.4kDa,66.2kDa,43kDa,31kDa。
[0023] 图5是重组细菌素durancinGL切除纯化标签后的活性检测结果。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法； 下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0025] 下面以pGEX-6p_l载体为例，对本发明作进一步的详细说明。pGEX-6P-l载体(可 以通过商业途径购买获得）由本实验室保藏，PGEX-6P-1载体携带有GST标签的编码基因。
[0026] 实施例1 1、细菌素durancinGL基因的克隆 根据GenBank数据库中细菌素durancin GL基因的序列（HQ696461. 1)，设计引物durl (SEQIDN0:5)：5/-ggg agg caa tta tat gaa gaa aaa att tgt tag tat t_3'和dur2 (SEQIDN0:6) :5'-CCAgTgCCCCCATAAACTATACACCC-3'，从耐久肠球菌 41D(是 已经公开的细菌)中扩增细菌素durancin GL的基因片段，该片段由结构基因和免疫基因组 成，序列如SEQIDNO: 1所示。
[0027] 细菌素durancinGL的基因也可以采用化学合成的方法制备。
[0028] 2、细菌素durancinGL基因片段的序列验证 将扩增的durancinGL基因片段回收，然后和pEASY-BluntSimpleCloningVector(购自北京全式金生物技术有限公司）连接，获得重组质粒pEASY/durAB。连接过程中，插入 片段与线性载体物质的量之比约为7:1，连接温度为25°C。将重组质粒pEASY/durAB，转化 到Transl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，挑选阳性克隆，过夜培养 后送上海生物工程有限公司测序，序列与预期相同。
[0029] 3、构建重组菌 (1)构建重组菌1 重组菌1表达由GST标签、His标签、肠激酶酶切位点和细菌素durancinGL相连形成 的重组细菌素durancinGL。重组细菌素durancinGL的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。 重组菌1的构建过程如下。
[0030] 第一步，构建重组表达载体，具体过程见图1。
[0031] 以pEASY/durAB质粒为模板，设计上游引物GST1和下游引物GST2，扩增由HiS 标签、肠激酶酶切位点和durancinGL的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物 GST1带His标签和肠激酶酶切位点的编码基因，GST1的序列（SEQIDN0:7)为：5'-CTG GGATCCCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGGCAACTTATTATGGAAATGGTGTTTATTG-3，；下游 引物GST2 序列（SEQIDN0:8)为：5'-AAACTCGAGTTTAACTCCAAATACCGATAGACGCCCATCC CC-3，。
[0032] 使用I和沿oI分别双酶切pGEX-6p_l载体和融合基因PCR产物，胶回收线 性载体和PCR产物，按照插入片段与线性载体物质的量之比约为3:1的比例在16°C进行连 接反应，连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性重组子，双酶切鉴定序列正确的重组表达载体命 名为pGEX-6p-l/durAB。
[0033] 第二步，构建重组菌1。将重组表达载体pGEX-6p_l/durAB转化大肠杆菌表达菌株 Rosetta(DE3)，得到重组菌1。
[0034] (2)构建重组菌2 重组菌2表达由GST标签、肠激酶酶切位点和细菌素durancinGL相连形成的重组细 菌素durancinGL。重组细菌素durancinGL的氨基酸序列如SEQIDN0:3所示。重组菌2 的构建过程如下：以pEASY/durAB质粒为模板，设计上游引物GST01和下游引物GST2,扩增 由肠激酶酶切位点和durancinGL的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物GST01 带肠激酶酶切位点的编码基因，GST01的序列（SEQIDN0:9)为：5'-CTGGGATCCGACGACGAC GACAAGGCAACTTATTATGGAAATGGTGITTAITG-3 ^ ;下游引物GST2 的序列同上。融合基因PCR 扩增片段和pGEX-6p-l载体经I和通oI双酶切后，进行连接。鉴定正确后，重组载 体命名为pGEX-6p-l/durAB-GST，转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)表达菌株，获得重组菌2。
[0035] (3)构建重组菌3 重组菌3表达由His标签、肠激酶酶切位点和细菌素durancinGL相连形成的重组细 菌素durancinGL。重组细菌素durancinGL的氨基酸序列如SEQIDN0:4所示。重组菌 3的构建过程如下：以pEASY/durAB质粒为