高盐度驯化提高微藻生长速率和细胞油脂含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明是关于生物质能利用技术，特别涉及高盐度驯化提高微藻生长速率和细胞油脂含量的方法。
【背景技术】
[0002]利用海洋微藻吸收太阳能制取生物柴油等清洁可再生的液体燃料，对于解决石油等化石能源日益短缺和燃烧污染严重的危机和矛盾具有重要意义。微藻生长非常迅速，生理代谢功能强大，光合作用效率很高，利用海水资源并吸收大量CO2进行光合作用，通过绿色清洁的生物化学过程合成富集油脂(Sheehan et al., 1998 ；Huntley et al.，2007)，可转化制取热值高达41MJ/kg的高品位生物柴油，因此能够替代石化柴油应用于交通工具，并且燃烧时不排放SO2等污染气体。据美国研宄机构预测(Benemann et al.，2008)，每平方公里的能源微藻每年生产生物柴油的潜力是36000-150000桶/年，其产油潜力是大豆油(250桶/年)的144-600倍，是麻疯树油(1200桶/年)的30-125倍，是棕榈油(3600桶/年)的15-41倍，故微藻是一种很有发展前景的生物柴油原料。
[0003]但微藻生长速率与油脂富集之间存在很大的相互矛盾，当绝大多数微藻达到最佳生长速率时，其细胞中油脂含量较低；而人为控制生长条件使微藻单位干重的油脂含量增加时，则使得微藻的生长速率和太阳能转化效率明显降低(Dempster et al.，1998)，所以开发生长速率快和油脂产量高的新藻种是关键所在。优势藻株筛选方法主要有三个方面:
(I)天然藻种筛选:美国能源部已经确切证实硅藻属的藻类油脂含量相对其他的藻种油脂含量较高(Sheehan et al.，1998 ;)，天然条件下藻类油脂含量10_30%;经过驯化其中一些微藻的光合生产率已经达到50g.m_2.cf1，含油率达到80%。(2)细胞工程！Zaslavskaia等人(Zaslavskaia et al.，2001)通过基因工程技术将编码葡萄糖转运体的基因引入一种无法进行异养生长的娃藻Phaeodactylum tricomutum细胞中，使其能在黑暗中利用外源葡萄糖进行异养生长并达到100g/L的细胞密度；(3)宏观生长因素调控:美国可再生能源国家实验室、加州大学伯克利分校等主要研宄机构(Sheehan et al.，1998 ；Hu et al.，2008)在实验室条件下研宄开发了多种富含油脂的硅藻和绿藻，在培养基缺氮、缺硅的条件下最高油脂含量达到40-66%，是自然条件下微藻油脂含量的3-12倍。
[0004]目前国际上较多趋向于自然筛选和转基因途径(Jarvis et al.，2008)，对诱变途径也有很大兴趣但鲜见研宄报道。Ben-Amotz等人(Ben-Amotz et al., 1985)证实在高盐度下有些藻种发现有很高的油脂含量，Cohen等人(Cohen et al.，1988)也发现生长在高盐度下的Porphyridium Cruentum藻细胞含有更高比例的亚油酸和花生四稀酸，两者与软脂酸一起是构成贮存甘油三酯的主要脂肪酸，但是高盐度驯化能否提高微藻生长速率目前尚很少文献报道。故如何采用高盐度梯度驯化方法选育出生长速率快和油脂含量高的藻种是一个技术难题，对于开发微藻新能源降低生产成本具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种高盐度驯化提高微藻生长速率和细胞油脂含量的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案是:
[0006]提供高盐度驯化提高微藻生长速率和细胞油脂含量的方法，具体包括下述步骤:
[0007](I)按接种量为5%?10%将微藻液体接种到IL的三角瓶，三角瓶中预先装800mL的培养基；在恒温20?25°C、每天依次光照12h和黑暗12h的条件下通入空气放大培养10?15天，且光照时的光照强度为3500?40001ux ；
[0008](2)取扩大培养后的藻种以5?10%接种量接种到容量为400mL圆柱瓶中，圆柱瓶中的培养基为250?350mL，初始盐度为0%，通入70?90mL/min的空气，培养8?12天后以5?10%的接种量转接入到盐度为0.2?0.4%的培养基中培养8?12天；
[0009](3)取步骤⑵中培养后的藻液以5?10%的接种量转接入到盐度为0.5?0.7%的培养基中培养8?12天，按盐度梯度为0.3%重复上述步骤直至将微藻接种至盐度为2.9?3.1 %的培养基中；
[0010](4)将上述藻种在盐度为2.9?3.1 %的培养基中连续培养3?5代，即获得能快速生长的高油脂含量藻种。
[0011]本发明中，所述培养基的组分比例为:0.15g NaHC03、0.02g KH2P04、0.027g VB1,
1.5X10-6g VB12,0.2g Na2S13.9H20、1.0g NaN03、0.0005g B1tin、ImL 微量元素和 980mL
人工海水。
[0012]本发明中，所述微量元素的组分比例为:1000mL蒸馏水中含有4.35g Na2EDTA,7.3mg Na2MoO4.2H20、12mgCoCl2.6Η20、3.9g FeC6H5O7.5H20、1mg CuSO4.5H20、23mg ZnS04、178mg MnCl2.4H20 和 600mg H3B03。
[0013]本发明中，所述人工海水的组分比例(盐度=3.0% )为:1000mL蒸馏水中含有21.2157g NaCl、3.407g Na2S04、0.3577g KC1、9.3042g MgCl2.6Η20、1.3044g CaCl2、0.0862gKBr,0.0226g H3B03、0.2760g NaF 和 0.0219g SrCl2.6H20。
[0014]本发明中，所述步骤(2)?(4)的培养条件为:人工温室20?30°C，初始pH值为8?10，每天依次光照12h和黑暗12h，且光照时的光照强度为6000?lOOOOlux。
[0015]本发明中，所述微藻液体是指:从自然环境中筛选得到的天然藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体或经过基因改良得到的转基因藻种。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0017]采用高盐度梯度驯化方法，微藻细胞的碳氮代谢途径以及油脂合成途径进行了重建，脯氨酸、ABC转运蛋白、蛋白酶体、谷胱甘肽的代谢通路变化较大，乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)、β -酮脂酰-ACP合酶I和II等关键生物酶表达量上调，从而有效提高了微藻生长速率和细胞富集油脂的能力。高盐度梯度驯化后微藻生长速率增加了 53.8%，细胞内油脂含量增加130.5%。
【附图说明】
[0018]图1为本发明的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述:
[0020]如图1所示的一种高盐度驯化提高微藻生长速率和细胞油脂含量的方法，具体包括下述步骤:
[0021](I)按接种量为5%?10%将微藻液体接种到IL的三角瓶(800mL的培养基)，所述原始藻液包括从自然环境中筛选得到的天然藻种、物理化学诱变得到的藻种突变体、经过基因改良得到的转基因藻种。在恒温20?25°C、光照强度3500?40001ux、每天依次光照12h黑暗12h的条件下通入空气扩大培养10?15天。
[0022](2)取扩大培养后的藻种以5?10%接种量接种到容量为400mL圆柱瓶中，圆柱瓶中的培养基为250?350mL，初始盐度为O %，通入70?90mL/min的空气，在温度为20?30°C，光照强度6000?lOOOOlux，光暗比12h: 12h，初始pH值为8?10的条件下培养8?12天后，以5?10%的接种量转接入至盐度为0.2?0.4%的培养基中，继续以同样的条件培养8?12天。
[0023]所述培养基组成为:0.15g NaHC03、0.02g KH2P04、0.027g VB1U.5 X 1^6gVB12,0.2g Na2S13.9H20、1.0g NaN03、0.0005g B1tinUmL 微量元素和 980mL 盐度为0.2?3.0 %人工海水或去离子水。其中，所述微量元素组成为:100mL蒸馏水中含有 4.35gNa2EDTA、7.3mg Na2MoO4.2H20、12mgCoCl2.6Η20、3.9g FeC6H5O7.5H20、1mgCuSO4.5H20、23mg ZnSO4 U 78mg MnCl2.4H20 和 600mg H3BO30 所述人工海水配方(盐度=3.0 % )为:100mL 蒸馏水中含有 21.2157g NaCl,3.407g Na2S04、0.3577g KCl,9.3042g MgCl2.6Η20、1.3044g CaCl2、0.0862g KBr、0.0226g H3B03、0.2760g NaF和0.0219gSrCl2.6H20o
[0024](3)取步骤⑵中培养后的藻液以5?10%的接种量转接入至盐度为0.5?0.7%的培养基中，在温度为20?30°C，光照强度6000?lOOOOlux，光暗比12h:12h，初始pH值为8?10的条件下培养8?12天。按盐度增量0.3%重复上述步骤直至将微藻接种至盐度为2.9?3.1 %的培养基中。
[0025](4)将上述藻种在盐度为2.9?3.1%的培养基中，温度为20?30°C，光照强度6000?lOOOOlux，光暗比12h:12h，初始pH值为8?10的条件下培养3?5代。即获得能快速生长的高油脂含量藻种。
[0026]下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0027]实施例1
[0028](I)按接种量为5%将菱形藻液体接种到IL的三角瓶(SOOmL的培养基)，在恒温20°C、光照强度35001ux、在每天依次光照12h黑暗12h的条件下通入空气放大培养10天。
[0029](2)取扩大培养后的藻种以5%接种量接种到容量为400mL圆柱瓶中，圆柱瓶中的培养基为250mL，初始盐度为O %，通入70mL/min的空气，在温度为25°C，光照强度80001UX，光暗比12h:12h，初始pH值为9的条件下培养8天后