专利名称：获得大豆转基因愈伤组织的方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及获得大豆转基因愈伤组织的方法及其培养基。
背景技术：
大豆遗传转化方法有许多，其中以根癌农杆菌介导法和基因枪介导法为主。但是，不管是根癌农杆菌介导法还是基因枪介导法，其遗传转化效率依旧低下，且转化周期长。另一方面，随着大豆EST序列等相关数据的不断丰富以及基因组测序的完成，从大豆中克隆基因会变得更加容易，而对于基因功能验证的需求会更加迫切。低效、费时的大豆遗传转化技术难以满足大豆基因功能验证日益增长的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种获得大豆转基因愈伤组织的方法。本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤以大豆转基因发状根为外植体I，用下述诱导大豆愈伤组织的培养基诱导培养所述外植体I，即得到大豆转基因愈伤组织。所述方法还包括用下述成套培养基中的继代培养基培养大豆转基因愈伤组织的步骤。所述大豆转基因发状根是通过包括如下步骤的方法制备得到( I)以大豆子叶节为外植体II，用含有外源目的DNA的发根农杆菌浸染所述外植体II，得到经过所述发根农杆菌浸染后的外植体II ；(2)将上述步骤⑴得到的经过所述发根农杆菌浸染后的外植体II用共培养基进行共培养，得到共培养后的外植体II ;(3)将上述步骤(2)得到的所述共培养后的外植体II用根诱导培养基进行培养，即得到大豆转基因发状根。所述步骤(2)中所述共培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 ·2H20,MgSO4 ·7Η20,KI,Na2MoO4 ·2Η20、H3BO3'CuSO4 ·5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮、赤霉素、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、蔗糖、琼脂和水；以上成分在所述共培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、乙酰丁香酮 40mg/L、赤霉素 O. 25mg/L、L-半胱氨酸 400mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、鹿糖30mg/L和琼脂7g/L ；所述共培养基的pH值为5. 4 ;
所述步骤(3)中所述根诱导培养基由包括以下成分的物质组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 .2H20、MgS04.7H20、K1、Na2Mo04 .2H20、H3BO3XuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、特美汀、头孢噻肟、羧苄青霉素、蔗糖和水；以上成分在所述根诱导培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、特美汀50mg/L、头孢噻厢100mg/L、羧节青霉素100mg/L和鹿糖30mg/L ；所述根诱导液体培养基的pH值为5. 7。本发明的另一个目的是提供诱导大豆愈伤组织的培养基。本发明所提供的诱导大豆愈伤组织的培养基，由下述质量份的营养成分组成大量元素以NH4NO3计825份、微量元素以KI计0. 83份、铁盐以FeSO4 *7H20计37. 3份、有机成分以烟酸计0. 5份、生长素、6-苄氨基嘌呤0. 5份-1. 0份和蔗糖30份；所述生长素为2，4- 二氯苯氧乙酸1. 0份`-3. 0份或萘乙酸1. 0-3. 0份；所述大量元素由下述质量份的物质组成NH4N03825 份、KN03950 份、KH2P0485 份、CaCl2 2H20 220 份和 MgSO4 7H20 185 份；所述微量元素由下述质量份的物质组成KI 0. 83 份、Na2MoO4 2H20 0. 25 份、H3B036. 2 份、CuSO4 5H20 0. 025 份、MnSO4 .H2O16. 9 份、CoCl2 6H20 0. 025 份和 ZnSO4 7H20 8. 6 份;所述铁盐由下述质量份的物质组成Na2EDTA 2H20 27. 8 份和 FeSO4 7H20 37. 3 份；所述有机成分由下述质量份的物质组成烟酸0. 5份、肌醇100份、盐酸硫胺素0.1份、盐酸吡哆醇0. 5份和甘氨酸2. 0份。所述培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3B03>CuS04 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、生长素、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；所述生长素为2，4_ 二氯苯氧乙酸或萘乙酸；以上成分在所述培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、生长素、6-节氨基嘌呤0. 5mg/L_l. Omg/L和鹿糖30mg/L ;所述生长素为2,4- 二氯苯氧乙酸1. Omg/L-3. Omg/L或萘乙酸1. Omg/L-3. Omg/L。本发明的又一个目的是提供诱导大豆愈伤组织的固体培养基。
本发明所提供的诱导大豆愈伤组织的固体培养基，是由凝固剂和上述诱导大豆愈伤组织的培养基配成的固体培养基。所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为7g/L ；所述凝固剂为琼脂。本发明的又一个目的是提供用于获得大豆愈伤组织的成套培养基。本发明所提供的用于获得大豆愈伤组织的成套培养基，由诱导大豆愈伤组织的培养基和继代培养基独立包装组成；所述诱导大豆愈伤组织的培养基和所述继代培养基均独立包装；所述继代培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 .2H20、MgS04.7H20、K1、Na2Mo04 .2H20、H3BO3XuSO4 .5H20、MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺
素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、N-苯基-N' -1，2，3-噻二唑-5-脲、二硫苏糖醇、蔗糖和水；以上成分在所述继代培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H2016. 9mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸0. 05mg/L、6_节氨基嘌呤0. 9mg/L、N-苯基-N' -1,2, 3-噻二唑-5-脲 0. 2mg/L、二硫苏糖醇 150mg/L 和蔗糖 30mg/L ；
所述继代培养基的pH值为5. 8。利用本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，能快速、简单、高效的获得大豆转基因愈伤组织。在大豆生物技术相关领域尤其在根系生长发育相关基因、抗根部病害基因和耐逆基因的功能验证中具有广泛的应用价值。
图1为将大豆种子用氯气熏蒸消毒。图2为大豆种子在发芽培养基上的发芽情况。图3为大豆子叶节外植体与发根农杆菌在共培养基上共培养。图4为共培养后的外植体在根诱导培养基上诱导得到的大豆转基因发状根。图5为转基因发状根的GUS检测结果，左侧为阴性对照；右侧为GUS阳性转基因发状根。图6为将转基因发状根在诱导培养基上培养得到的转基因愈伤组织。图7为转基因愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、获得大豆转基因愈伤组织
方法I一、获得大豆转基因发状根1、制备大豆子叶节外植体将成熟的大豆种子用氯气熏蒸消毒16小时(图1)，然后将消毒后的种子接种于发芽培养基(B5培养基)上，置于24°C光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养5天(图2)。将大豆幼苗从培养基中剪下，去除种皮，保留3-5mm的下胚轴，沿下胚轴竖直切开两片子叶，剥离胚芽，沿子叶处划伤8-10次，作为待转化的大豆子叶节外植体。2、农杆菌工程菌液的制备及浸染将含有GUS基因的质粒pGFPGUSPlus(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Claudia E. Vickers, Peer M. Schenk, Dongxue Li, etal.pGFPGUSPlus, a new binary vector for gene expression studies and optimisingtransformation systems in plants. Biotechnol Lett, 2007, 29 :1793-1796)通过电转化法转入农杆菌K599 (公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Claudia E. Vickers, Peer M. S chenk, Dongxue Li, et al. pGFPGUSPlus, a newbinary vector for gene expression studies and optimising transformation systemsin plants. Biotechnol Lett, 2007, 29 :1793-1796)，得到含有 GUS 基因的农杆菌 K599 ;将含有GUS基因的农杆菌K599单菌落接种于5ml含卡那霉素(100mg/L)的YEP液体培养基中，28°C、200rpm振荡过夜培养；取Iml菌液加入50ml含卡那霉素(100mg/l)的YEP液体培养基中；28°C、200rpm振荡培养，待菌液的浓度达到OD6tltl = 0. 5后，4°C、3500rpm离心10分钟收集菌体，并将菌体重悬于液体共培养基中至OD6tltl = 0.3,将上步制备好的大豆子叶节外植体浸泡于菌液中浸染30分钟。所述液体共培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3B03>CuS04 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖和水；以上成分在所述液体共培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0.25mg/L、H3B036 .2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、赤霉素(GA3)0. 25mg/L、L-半胱氨酸(L-cysteine) 400mg/L、二硫苏糖醇(DTT) 154mg/L 和鹿糖 30mg/L ；所述液体共培养基的pH值为5. 4。3、大S 子叶节外植体与农杆菌共培养将上述步骤2经过农杆菌浸染后的大豆子叶节外植体用无菌滤纸吸干表面多余的菌液，然后切口向下平铺于表面盖有无菌滤纸的固体共培养基上，置于24°C光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养5天(图3)，得到共培养后的大豆子叶节外植体。所述固体共培养基由以下成分组成
NH4N03、KN03、KH2P04、CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3,CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮(AS)、赤霉素(GA3)、L-半胱氨酸(L-cysteine)、二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖、琼脂和水；以上成分在所述共培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、赤霉素(GA3)0. 25mg/L、L-半胱氨酸(L-cysteine) 400mg/L、二硫苏糖醇(DTT) 154mg/L、鹿糖 30mg/L 和琼脂 7g/L ；所述共培养基的pH值为5. 4。4、转基因发状根的诱导用根诱导液体培养基清洗上述步骤3得到的共培养后的大豆子叶节外植体3次，用无菌滤纸除去表面菌液，将子叶朝下插入根诱导固体培养基(含14mg/L潮霉素作为筛选剂)中，置于24°C光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养2-3周，诱导产生发状根(图 4)。
根诱导液体培养基由以下成分组成NH4NO3^KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸批哆醇、甘氨酸、特美汀(Timentin)、头孢噻月亏(Cefotaxime)、羧节青霉素(Carbenicillin)、鹿糖和水；以上成分在所述根诱导液体培养基中浓度分别为 NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸 2. 0mg/L、特美汀(Timentin) 50mg/L、头抱噻月亏(Cefotaxime) 100mg/L、羧节青霉素(Carbenicillin) 100mg/L 和鹿糖 30mg/L ；所述根诱导液体培养基的pH值为5. 7。所述根诱导固体培养基是由所述根诱导液体培养基、琼脂和相应筛选剂配成的固体培养基；其中琼脂在根诱导固体培养基中的浓度为7g/L ;相应的筛选剂为潮霉素，潮霉素在根诱导固体培养基中的浓度为14mg/L。二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代培养1、诱导大豆转基因愈伤组织将经⑶S组织化学染色检测验证证实的转基因发状根(图5)的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24°C黑暗条件下培养3周(图6)，得到大豆转基因愈伤组织。实验设3次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。
愈伤组织诱导率=(诱导的根数/产生愈伤组织的根数X 100% )。结果为愈伤组织诱导率为100%。所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 .2H20、MgS04.7H20、K1、Na2Mo04 .2H20、H3BO3XuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4- 二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；以上成分在所述培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036. 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 H2O 16. 9mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 2H2027. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸批口多醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸1. 0mg/L、6_节氨基嘌呤0. 5mg/L和鹿糖 30mg/L ；所述愈伤组织诱导培养基的pH值为5. 8。二、继代培养大豆转基因愈伤组织将得到的大豆转基因愈伤组织转入继代培养基中，置于24°C光照培养箱(16小时光照/8小时黑暗)中培养(图7)，每两周继代一次。所述继代培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H2O, CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺
素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、N-苯基-N' -1,2,3-噻二唑-5-脲(TDZ)、二硫苏糖醇(DTT)、蔗糖和水；以上成分在所述继代培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036. 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 H2O 16. 9mg/L、CoCl2 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA 2H2027. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸批口多醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸0. 05mg/L、6_节氨基嘌呤0. 9mg/L、N-苯基-N' -1,2, 3-噻二唑-5-脲 0. 2mg/L、二硫苏糖醇 150mg/L 和蔗糖 30mg/L ；所述继代培养基的pH值为5. 8。方法II一、获得大豆转基因发状根1、制备大豆子叶节外植体制备大豆子叶节外植体的与方法I相同。
结果与方法I无显著差异。2、农杆菌工程菌液的制备及浸染农杆菌工程菌液的制备及浸染方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。3、大S 子叶节外植体与农杆菌共培养
共培养方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。4、转基因发状根的诱导转基因发状根的诱导方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代培养1、诱导大豆转基因愈伤组织将经⑶S检测验证证实的转基因发状根的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24°C黑暗条件下培养4周，得到大豆转基因愈伤组织。实验设三次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。愈伤组织诱导率=(诱导的根数/产生愈伤组织的根数X 100% )。
结果为愈伤组织诱导率为100%。所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖、琼脂和水；以上成分在所述培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸3. 0mg/L、6_节氨基嘌呤0. 5mg/L、鹿糖30mg/L和琼脂7g/L ；所述愈伤组织诱导培养基的pH值为6. 5。二、继代培养大豆转基因愈伤组织继代培养的方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。方法III一、获得大豆转基因发状根1、制备大豆子叶节外植体制备大豆子叶节外植体的与方法I相同。结果与方法I无显著差异。2、农杆菌工程菌液的制备及浸染农杆菌工程菌液的制备及浸染方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。3、大S 子叶节外植体与农杆菌共培养共培养方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。4、转基因发状根的诱导
转基因发状根的诱导方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代1、诱导大豆转基因愈伤组织将经⑶S检测验证证实的转基因发状根的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24°C黑暗条件下培养3周，得到大豆转基因愈伤组织。实验设3次重复，结果取平均值，每个重复设30个外植体。愈伤组织诱导率=(诱导的根数/产生愈伤组织的根数X 100% )。结果为愈伤组织诱导率为100%。所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成
·
NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；以上成分在所述培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、萘乙酸1. 0mg/L、6_节氨基嘌呤1. Omg/L和鹿糖30mg/L。所述愈伤组织诱导培养基的pH值为7. 3。二、继代培养大豆转基因愈伤组织继代培养的方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。方法IV一、获得大豆转基因发状根1、制备大豆子叶节外植体制备大豆子叶节外植体的与方法I相同。结果与方法I无显著差异。2、农杆菌工程菌液的制备及浸染农杆菌工程菌液的制备及浸染方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。3、大S 子叶节外植体与农杆菌共培养共培养方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。4、转基因发状根的诱导转基因发状根的诱导方法与方法I相同。结果与方法I无显著差异。二、大豆转基因愈伤组织的诱导和继代1、诱导大豆转基因愈伤组织
将经GUS检测验证证实的转基因发状根的根尖段作为外植体，放入愈伤组织诱导培养基中，置于24°C黑暗条件下培养4周，得到大豆转基因愈伤组织。实验设三次重复，结果取平均值,每个重复设30个外植体。愈伤组织诱导率=(诱导的根数/产生愈伤组织的根数X 100% )。结果为愈伤组织诱导率为100%。所述愈伤组织诱导培养基由以下成分组成NH4N03>KN03>KH2PO4,CaCl2 2H20,MgSO4 *7H20,KI,Na2MoO4 *2H20,H3BO3^CuSO4 .5H20、MnSO4 H20、CoCl2 6H20、ZnSO4 7H20、Na2EDTA 2H20、FeSO4 7H20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、
盐酸吡哆醇、甘氨酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；以上成分在所述培养基中浓度分别为 NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 2H20 0. 22g/L、MgSO4 7H200. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 *H20 16. 9mg/L、CoCl2 *6H20 0. 025mg/L、ZnS04 *7H20 8. 6mg/L,Na2EDTA *2H20 27. 8mg/L、FeSO4 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇0. 5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、萘乙酸3. 0mg/L、6_节氨基嘌呤1. Omg/L和鹿糖30mg/L。 所述愈伤组织诱导培养基的pH值为7. 3。
权利要求
1.一种获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤 以大豆转基因发状根为外植体I，用权利要求5-9中任一所述的培养基诱导培养所述外植体I，即得到大豆转基因愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于 所述方法还包括用权利要求10中所述的成套培养基中的继代培养基培养大豆转基因愈伤组织的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于 所述大豆转基因发状根是通过包括如下步骤的方法制备得到 (1)以大豆子叶节为外植体II，用含有外源目的DNA的发根农杆菌浸染所述外植体II，得到经过所述发根农杆菌浸染后的外植体II ； (2)将上述步骤(I)得到的经过所述发根农杆菌浸染后的外植体II用共培养基进行共培养，得到共培养后的外植体II ; (3)将上述步骤(2)得到的所述共培养后的外植体II用根诱导培养基进行培养，即得到大豆转基因发状根。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于 所述步骤(2)中所述共培养基由以下成分组成 NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、乙酰丁香酮、赤霉素、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、蔗糖、琼脂和水； 以上成分在所述共培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20·0. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇·0.5mg/L、甘氨酸 2. Omg/L、乙酰丁香酮 40mg/L、赤霉素 O. 25mg/L、L-半胱氨酸 400mg/L、二硫苏糖醇154mg/L、鹿糖30mg/L和琼脂7g/L ； 所述共培养基的pH值为5.4; 所述步骤(3)中所述根诱导培养基由包括以下成分的物质组成 NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、特美汀、头孢噻肟、羧苄青霉素、蔗糖和水； 以上成分在所述根诱导培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20·0. 185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇·0.5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、特美汀50mg/L、头孢噻厢100mg/L、羧节青霉素100mg/L和鹿糖·30mg/L ； 所述根诱导液体培养基的PH值为5. 7。
5.诱导大豆愈伤组织的培养基，由下述质量份的营养成分组成 大量元素以NH4NO3计825份、微量元素以KI计O. 83份、铁盐以FeSO4 ·7Η20计37. 3份、有机成分以烟酸计O. 5份、生长素、6-苄氨基嘌呤O. 5份-1. O份和蔗糖30份；所述生长素为2，4- 二氯苯氧乙酸1. O份-3. O份或萘乙酸1. O份-3. O份； 所述大量元素由下述质量份的物质组成ΝΗ4Ν038 2 5 份、ΚΝ03950 份、ΚΗ2Ρ0485 份、CaCl2 · 2Η20 220 份和 MgSO4 · 7Η20 185 份；所述微量元素由下述质量份的物质组成KI O. 83 份、Na2MoO4 · 2Η20 O. 25 份、Η3Β036· 2 份、CuSO4 · 5Η20 O. 025 份、MnSO4 · H2O16. 9 份、CoCl2 · 6Η20 O. 025 份和 ZnSO4 · 7Η20 8. 6 份; 所述铁盐由下述质量份的物质组成Na2EDTA · 2Η20 27. 8 份和 FeSO4 · 7Η20 37. 3 份； 所述有机成分由下述质量份的物质组成 烟酸O. 5份、肌醇100份、盐酸硫胺素O.1份、盐酸吡哆醇O. 5份和甘氨酸2. O份。
6.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于 所述培养基由以下成分组成NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · Η20、CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、生长素、6-苄氨基嘌呤、蔗糖和水；所述生长素为2，4_ 二氯苯氧乙酸或萘乙酸； 以上成分在所述培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20 0.185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036 . 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 ·Η20 16. 9mg/L、CoCl2 ·6Η20 0. 025mg/L、ZnS04 ·7Η20 8. 6mg/L,Na2EDTA ·2Η20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸吡哆醇 0.5mg/L、甘氨酸2. Omg/L、生长素、6-节氨基嘌呤O. 5mg/L_l. Omg/L和鹿糖30mg/L ;所述生长素为2,4- 二氯苯氧乙酸1. Omg/L-3. Omg/L或萘乙酸1. Omg/L-3. Omg/L。
7.诱导大豆愈伤组织的固体培养基，是由凝固剂和权利要求5或6所述的培养基配成的固体培养基。
8.根据权利要求7所述的固体培养基，其特征在于 所述凝固剂在所述固体培养基中的浓度为7g/L ； 所述凝固剂为琼脂。
9.根据权利要求5-8中任一所述的培养基，其特征在于所述培养基的pH值为5. 8—7. 3.
10.用于获得大豆愈伤组织的成套培养基，由权利要求5-9中任一所述的培养基和继代培养基独立包装组成；所述权利要求5-9中任一所述的培养基和所述继代培养基均独立包装； 所述继代培养基由以下成分组成NH4NO3' KNO3> KH2PO4' CaCl2 · 2H20、MgSO4 · 7H20、K1、Na2MoO4 · 2H20、H3BO3> CuSO4 · 5Η20、MnSO4 · H2O, CoCl2 · 6Η20、ZnSO4 · 7Η20、Na2EDTA · 2Η20、FeSO4 · 7Η20、烟酸、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、甘氨酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸、6-苄氨基嘌呤、N-苯基-N' -1，2，3-噻二唑-5-脲、二硫苏糖醇、蔗糖和水； 以上成分在所述继代培养基中浓度分别为NH4NO3O. 825g/L、KNO3O. 95g/L、KH2PO4O. 085g/L、CaCl2 · 2H20 0. 22g/L、MgSO4 · 7H20 0.185g/L、KI 0. 83mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 25mg/L、H3B036. 2mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 025mg/L、MnSO4 · H2O 16. 9mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2EDTA · 2H20 27. 8mg/L、FeSO4 · 7H20 37. 3mg/L、烟酸 0. 5mg/L、肌醇 100mg/L、盐酸硫胺素 0. lmg/L、盐酸批口多醇O. 5mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸O. 05mg/L、6_节氨基嘌呤O. 9mg/L、N-苯基-N' -1,2, 3-噻二唑-5-脲 O. 2mg/L、二硫苏糖醇 150mg/L 和蔗糖 30mg/L ； 所述继代培养基的PH值为5. 8。
全文摘要
本发明公开了获得大豆转基因愈伤组织的方法及其培养基。本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，包括以下步骤以大豆转基因发状根为外植体I，用诱导大豆愈伤组织的培养基诱导培养所述外植体I，即得到大豆转基因愈伤组织。利用本发明所提供的获得大豆转基因愈伤组织的方法，能快速、简单、高效的获得大豆转基因愈伤组织。在大豆生物技术相关领域尤其在根系相关基因和耐逆基因的功能验证中具有广泛的应用价值。
文档编号C12N5/04GK103031269SQ201110304260
公开日2013年4月10日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者韩天富, 曹东, 侯文胜, 吴存祥 申请人:中国农业科学院作物科学研究所