专利名称：高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及高效分泌表达AcAP5的CHO细胞株。
背景技术：
犬钩虫吸血时，其头腺分泌一种具有抗凝血活性的物质，被称作犬钩虫抗凝血肽 (anticoagulant ρ印tide，AcAPs)。该物质本质是一种蛋白水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间(Pt)、抑制血液凝固以及促进纤维蛋白溶解的作用。AcAPs目前已有AcAP5、AcAP6、 AcAPc2三种重组蛋白。AcAP5由77个氨基酸组成，是Xa因子的高效特异性抑制剂，与Xa 的反应位区在肽37-42 (-C-R-S-R-G-C-)，作用位点在第40位精氨酸和第41位甘氨酸之间。 AcAPs的抗凝血、抗血栓作用有将会成为临床上一种新的抗凝剂和抗血栓治疗药物。目前用CHO表达AcAP5的最高表达量是6mg/L，且无法满足工业化生产。
发明内容
本发明是要解决目前用CHO表达外源基因产物的表达量低，且无法满足工业化生产的问题，提供高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。本发明高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CH0-dhfr_)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株，表达量最高达到12mg/L · 72h。本发明高分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的构建方法，按以下步骤进行—、目的片段双酶切由上海生工公司合成带有信号肽的AcAP5基因序列克隆到T 载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下
成分用量
0.2昭/叫T载体20|iL
IOx MbufFer6|iL
BamHl3 μ
Notl3μL
ddH2028|iL酶切反应条件为37°C放置3小时，然后将酶切产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段；二、质粒载体双酶切用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3. l/V5-His_C，
反应体系如下成分用量
0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μL
IOx MbufFer6|iL
,SawHI3 μ
XhoI3μL
ddH2028|iL酶切反应条件为37°C放置3小时，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，再用 DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；三、DNA片段的连接，反应体系如下
成分用量
0.2μ§/μ 酶切后的质粒载体3|iL
10ng/|iL 插入片段13|iL
IOx T4 DNA 连接酶 buffer2μL
T4 DNA连接酶2|iL连接反应条件为16 °C放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3. 1/ V5-His-C-AcAP5 ；四、细胞培养用含1001^/1胎牛血清、離4、1\肌的DMEM培养基培养二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr—；五、重组质粒转染CHO 将构建好的重组质粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5与质粒 pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent 共转染 CHO-dhfr-细胞，在 24 孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500 μ L/ 孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1 10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基，培养14 16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA 试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养；六、MTX的加压培养以MTX加压筛选，浓度依次为2X10_8mmol/L、lX10_7mmol/L 和5X liTmmol/L，最终得到能够在5X l(Tmmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因序列根据Genbank中犬钩虫(Ancylostoma caninum)的mRNA序列(Aceession :U30795)的原始序列，去掉原始信号肽序列，同时根据表达系统的特点选择CH0-dhft_偏爱密码子。为了使转录和翻译效率最高，同时使表达产物分泌到细胞外，在原始序列5’端加上Kozak序列和信号肽，在原始序列两端分别加上限制性内切酶BamHI和NotI的位点。步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID NO=I所示。步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因中加入的信号肽的基因序列如SEQ ID NO 2 所示。
本发明高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。本发明选用CHO-dhfr—细胞作为宿主细胞，具有以下优点CH0-dhfr_细胞适用于各种蛋白质的分泌表达和胞质内表达；在MTX选择压力下，DHFR基因及该基因两侧的序列可以大量扩增；对培养基的适应性强，可以用无血清的培养基培养；CHO细胞既可进行贴壁培养也可进行悬浮培养；可大量地规模性生产，培养量可达5000L。本发明的CHO细胞株可以高效表达AcAP5，表达量为9 12mg/L · 72h，且可以工业化生产。AcAP5可以抗凝血、抗血栓，其主要抑制凝血因子Xa，直接与Xa的活性中心结合从而特异性抑制Xa，阻断凝血的共同途径，达到抗凝血作用。本发明为犬钩虫抗凝血肽抗凝活性的深入研究和临床应用奠定了基础。
图1为具体实施方式
一中重组质粒DNA的测序图；图2为具体实施方式
一中阳性克隆的RT-PCR产物电泳图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞(CH0-dhfr_)作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株，表达量最高达到12mg/L · 72h。本实施方式高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的构建方法具体如下一、目的片段双酶切由上海生工公司合成带有信号肽的AcAP5基因序列克隆到T 载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下酶切反应条件37°C放置3小时，将酶切产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段。二、质粒载体双酶切用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3. 1/ V5-His-C (购自Invitrogen公司)，反应体系如下
成分 0.2昭/叫T载体 IOx Mbuffer
20μL 6μL 3 |iL 3 |iL 28|iL
BamHl Notl
ddH20成分用量
0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μL
IOx MbufFer6|iL
,SawHI3 μ
XhoI3μL
ddH2028|iL酶切反应条件37°C放置3小时，将酶切产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体。三、DNA片段的连接反应体系如下
成分用量
0.2μ§/μ 酶切后的质粒载体3|iL
10ng/|iL 插入片段13|iL
IOx T4 DNA 连接酶 buffer2|iL
T4 DNA连接酶2|iL连接反应条件16°C放置过夜，连接反应产物转化感受态细胞E.coli ToplO (购自天津天有利科技有限公司)，采用菌落PCR的方法筛选阳性菌落，并进一步提取重组质粒 DNA进行测序，测序结果表明无碱基的错误，未改变载体阅读框，方向相同(如图1)。BamHI、 NotI和DNA连接酶购自NEB公司。四、细胞培养二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CH0-dhfr_由哈尔滨医科大学病理教研室赠予，用含100mL/L胎牛血清(FBS)、NAA、1 XHT的DMEM培养基(购自GIBCO公司)培养。五、重组质粒转染CHO 将构建好的重组质粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5与质粒pDCHlPll混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent (购自 Invitrogen 公司)共转染 CHO-dhfr-细胞，在 24 孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II， 500 μ L/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II (不含HT、NAA) ImL,继续培养 48h，用ELISA试剂盒(购自R&D公司)鉴定阳性转染的细胞按1 10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基(不含HT、NAA,但含0. 75mg/L的G418 (购自上海浩然生物技术有限公司)，100mL/L的FBS)，培养14 16d后有阳性克隆形成(因培养基中不含HT，故存活细胞为成功共转染的细胞)；然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12 孔板，经ELISA试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养。六、MTX的加压培养待细胞长成单层，取培养3d的上清用ELISA试剂盒检测，以 MTX (氨甲喋呤)加压筛选，浓度依次为2 X l(T%mol/L、1 X 10"7mmol/L和5 X 10"7mmol/L,最终得到能够在5X 10_7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
本实施方式的阳性克隆的RT-PCR鉴定试验，具体方法为收集MTX加压筛选后的细胞，以TRIzoI进行细胞总RNA的提取，RNA反转录后以Pl和P2为引物进行PCR扩增，PCR 反应条件为95°C预变性5min ；94°C 30s,51°C 30s, 72°C 30s，共30个循环；再72°C最终延伸 5min。上游引物P1 5 ‘ -AGTGCGGCGAGAACGAGTGG-3 ‘下游引物P2 5 ‘ -CGATGACGGTGTCGCGGTAGAA-3 ‘试验结果如图2所示，泳道1为DNA marker,泳道2为阳性克隆的RT-PCR产物，泳道3为未转染的细胞。对未转染pcDNA3. l/V5-His-C-AcAP5和pDCHlPll的CHO细胞进行扩增后无条带。由于CHO细胞自身并无AcAP5 mRNA形式存在，所以未转染细胞无相应片段被扩增。而稳定转染的细胞株中扩增出295bp的片段，表明目的片段已完整的整合到CHO 细胞中，有目的基因的转录。重组AcAP5蛋白表达水平的检测试验，具体方法为分别对2 X 10_8mmol/L、 1 X liTmmol/L和5 X liTmmol/L三个不同浓度MTX加压培养后的细胞株培养72h，之后取培养液上清，用ELISA试剂盒测定重组AcAP5蛋白含量。检测结果如下
权利要求
1.高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株，具体方法按以下步骤进行一、目的片段双酶切由上海生工公司合成带有信号肽的AcAP5基因序列克隆到T载体上，将T载体用BamHI和NotI进行双酶切，反应体系如下成分用量·0.2昭/叫T载体20|iLIOx MbufFer6|iLBamHl3 μ Notl3μLddH2028|iL酶切反应条件为37°C放置3小时，然后将酶切产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段；二、质粒载体双酶切用BamHI和NotI双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C,反应体系如下成分用量·0.2(^g/|iL pcDNA3.1/V5-His-C20μLIOx MbufFer6|iLBamHl3 μ XhoI3μLddH2028|iL酶切反应条件为37°C放置3小时，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，再用 DNAGEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的质粒载体；三、DNA片段的连接，反应体系如下成分用量·0.2μ§/μ 酶切后的质粒载体3|iL10ng/|iL 插入片段13|iLIOx T4 DNA 连接酶 buffer2|iLT4 DNA连接酶2|iL连接反应条件为16°C放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3. l/V5-His-C-AcAP5 ；四、细胞培养用含1001^/1胎牛血清、離4、1\肌的DMEM培养基培养二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CH0-dhfr_ ；五、重组质粒转染CHO将构建好的重组质粒pcDNA3. l/V5-His-C_AcAP5与质粒 pDCHlPll 混合，使用 Lipofeetmine 2000Reagent 共转染 CH0_dhff 细胞，在 M 孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFM II，500 μ L/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS的CHO-S-SFM II，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1 10传代，24h细胞贴壁后更换为选择性培养基，培养14 16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经ELISA 试剂盒测定对阳性克隆中10株高表达的细胞克隆进行扩大培养；六、MTX的加压培养以MTX加压筛选，浓度依次为2Xl(T8mmol/L、lXl(T7mmol/L和 5X 10_7mmol/L，最终得到能够在5X 10_7mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
2.根据权利要求1所述的高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因的序列如SEQ ID N0:1所示。
3.根据权利要求1所述的高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于步骤一所述带有信号肽的AcAP5基因中加入的信号肽的基因序列如SEQ ID NO :2所7J\ ο
4.权利要求1所述高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，涉及高效分泌表达AcAP5的CHO细胞株。本发明是要解决目前用CHO表达外源基因产物的表达量低，且无法满足工业化生产的问题。高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，利用二氢叶酸还原酶缺陷型中华仓鼠卵巢细胞作为宿主细胞，经筛选、扩增后得到稳定、高效表达AcAP5的细胞株。本发明的CHO细胞株可以高效表达AcAP5，表达量最高达到12mg/L·72h，且可以工业化生产。用于抗凝血、抗血栓。
文档编号C12N5/10GK102358893SQ201110304079
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月10日 优先权日2011年10月10日
发明者付海燕, 余琼, 刘威, 张巍 申请人:黑龙江大学