哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及到哺乳动物双基因高效筛选表达载体及 其构建方法。
【背景技术】
[0002] 基因工程药物因具有其他药物无法比拟的优点，迅速成为制药产业中引人注目 的焦点，近年来，各国政府将其视为新的经济增长热点并大力支持。CHO细胞（Chinese hamster ovary,中国仓鼠卵巢细胞）表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，被 广泛应用于抗体类蛋白质药物的生产。影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，涉及 CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培 养等。CHO细胞表达体系和外源基因影响mRNA(Messenger RNA)的翻译；表达细胞株的加 压扩增，目的在于增加外源基因的拷贝数，从而提高表达量；筛选基因的应用使获得稳定 的、高表达的单克隆细胞株成为可能[吴海涛，胡云龙，陈松，等，中国生物工程杂志，2004 ; 24(8) :1-5]。构建哺乳动物高效筛选表达载体，是哺乳动物细胞株生产制药的重要研宄内 容。
[0003] 为了获得高效表达的细胞株，需要用携带筛选基因和目的基因的载体，转染 哺乳动物细胞，并使载体随机整合到细胞基因组中，通过加压筛选，获得稳定表达的 细胞株。真核细胞的筛选基因主要包括两类：一类是新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferase, ΝΕΟ)等非扩增基因，它不影响目的基因的拷贝数；另一类是共扩 增基因，如二氢叶酸还原酶（Dihydrcofolate reductase，DHFR)基因、谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase，GS)基因等。G418是一种氨基糖苷类抗生素，通过影响核糖体的 功能阻断蛋白质的合成，当NEO基因整合到基因组后，NEO基因编码的抗性产物新霉素磷酸 转移酶，可以将G418转变成无毒形式，从而使细胞在含G418的培养基中生长。叶酸类似 物氨甲噪呤（Methotrexate，MTX)能抑制二氢叶酸还原酶DHFR活性，导致无法合成四氢叶 酸，将携带目的基因和DHFR基因的质粒转染DHFR缺乏的细胞，在MTX选择压力下，幸存下 来的细胞的DHFR基因得以扩增，带动目的基因的扩增[Looney JE，Hamlin JL. Mol cell Biol，1987 ;7(2) :569-577]。然而，在选择压力下，DHFR临近基因的扩增大小和范围是处于 变化中的，扩增不稳定。谷氨酰胺合成酶扩增系统是新近发展起来的，当细胞在缺乏谷氨酰 胺、加入谷氨酰胺合成酶抑制物（Methionine sulphoximine，MSX)的条件下培养，GS基因 不仅自身进行自我复制，还能够带动外源基因随着GS基因的复制而复制，达到目的基因的 高水平表达[Bebbington CR，Renner G，Thomson S，et al，Biotechnology，1992 ; 10(2): 169-175]，谷氨酰胺合成酶扩增系统具有更高的扩增效率，但是筛选到的细胞生长状态不 佳。
[0004] 对筛选标记进行弱化后，若筛选标记整合到细胞低表达整合位点，则标记基因自 我扩增（复制）拷贝数较低，而细胞株由于低表达量不足以应付较高的压力，从而在筛选 过程中死亡。只有少量筛选标记整合到转录活跃区的细胞，因筛选标记的高倍数扩增而在 较高的压力下存活下来。由于双表达载体的目的基因紧邻筛选标记，筛选标记与目的基因 会整合到染色体同一位点，如果他们同在转录活跃区，从而增加了目的基因的拷贝数，提高 了表达水平。常用的弱化筛选基因的方法包括：对筛选基因进行突变，削弱其表达功能；改 造起始密码子临近序列，弱化基因表达以及弱化启动子的转录。据报道，删除SV40启动子 中的一个72bp重复序列，或删除一个72bp重复序列，并在剩余的72bp重复序列的第5-7 位引入TGG-GTT突变，使得SV40启动子的转录活性降低为野生型的1/1000或1/36 [Zenke M, GrundstromT1Matthes H, et al. ΕΜΒ0, 1986, 5:387-397] 〇
[0005] 构建一个或多个基因的高表达载体，通常是将较强的顺式作用元件集中到一个载 体中启动外源基因表达，以提高重组蛋白的产量。真核细胞的启动子，主要有猴空泡病毒 SV40 (Simian vacuolating virus 40，SV40)、人巨细胞病毒 CMV (cytomegalovirus，CMV)、 人延伸因子EF-Ια (elongation factors 1α，EF-Ια，Ια是延生因子的亚基编号）启 动子，前者主要用于选择基因的表达，后面两个可以高效的表达重组蛋白。EF-Ια启动 子是目前最强的启动子之一，在细胞的不同时期表达都很高[Sunghoi Hong, Dong-Youn Hwangl，Soonsang Yoon，et al, Molecular Therapy, 2007; 15 (9) ,1630 - 1639]。巨细胞病 毒CMV(cytomegalovirus，CMV)启动子（pCMV)即早期启动子，仅在S期（细胞周期中的DNA 合成期）激活，应用这类启动子表达外源蛋白需要宿主细胞不停增殖，这不利于连续持久 大规模培养宿主细胞。而人延伸因子1 α亚基启动子（pEF-1 α )不受细胞周期限制，且启 动子强度高于PCMV，有利于大规模外源蛋白的生产[来大志，翁少洁，于长明，等，生物化学 与生物物理进展，2004 ;31 (2) :118-126]。因此本发明表达载体中目的基因采用了 EF-Ia 强启动子，以期得到较高外源蛋白的表达。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中阳性克隆率低、筛选周期长、目的蛋白表达量 低等不足之处，提供了哺乳动物双基因高效筛选表达载体及其构建方法。由于许多哺乳动 物细胞有内源的DHFR和GS基因，如果只用单一的DHFR或GS系统来筛选，筛选过程中高表 达细胞的阳性率较低，筛选基因的联合使用，可以使筛选时细胞的阳性率增高。由于GS和 DHFR都是共扩增基因，如果利用GS-DHFR共同或者分别加压筛选，可以结合DHFR和GS系 统的优点并克服二者的缺点，双筛选标记的同时应用使目的基因扩增的拷贝数更高，大大 提高目的基因的表达量，可以构建更高效的表达载体。同时，由于哺乳动物细胞不含内源的 NEO抗性基因，如果联合GS、NEO基因构建双表达系统的载体共同作用细胞，可以有效利用 GS的扩增功能和NEO的筛选系统的特点，快速获得高效表达的细胞株。本发明构建了两种 携带不同筛选基因的哺乳动物细胞表达载体PGD和pGN。这两种载体的所有筛选基因都采 用了弱化的SV40的启动子，所有外源基因都用了强的外源基因启动子pEFl a，两种载体都 采用了两种筛选标记（p⑶使用了 GS和DHFR双筛选标记，而pGN则使用了 GS和NEO双筛 选标记），这两种高表达质粒可以针对不同要求而使用。上述两种载体的使用可以使得外源 基因的表达量更高，也易于筛选到高表达的细胞克隆并缩短了筛选时间。因此使用所述载 体筛选高表达单克隆细胞，具有速度快、阳性克隆率高、目的蛋白表达量高等特点。
[0007] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] 哺乳动物双基因高效筛选表达载体包含载体P⑶和载体PGN ;所述载体P⑶和所 述载体PGN均包含双筛选基因，所述载体pGD的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS基因和 二氢叶酸还原酶DHFR基因；所述载体pGN的双筛选基因包括谷氨酰胺合成酶GS筛选基因 和新霉素磷酸转移酶NEO基因；所述双筛选基因的启动子均进行了弱化；所述双筛选基因 的目的基因表达框均含有强启动子。
[0009] 优选地，所述双筛选基因启动子的弱化采用缺失突变SV40启动子的方法。
[0010] 更加优选地，所述筛选标记包含弱化的SV40启动子控制的GS基因、DHFR基因或 NEO基因。
[0011] 更加优选地，所述强启动子用于启动外源基因的表达，所述强启动子采用PEF-I α 强启动子。
[0012] 更加优选地，所述目的基因表达框依次含有EF-Ια强启动子、目的基因以及 polyA多聚腺苷酸尾巴序列。
[0013] 更加优选地，所述哺乳动物双基因高效筛选表