细胞培养基的病毒过滤的制作方法
【专利说明】细胞培养基的病毒过滤
【背景技术】
[0001] 在生物制药行业，病毒学安全是很重要的问题。尽管为了减小风险做出了很多努 力，但是生物制品的包含大规模病毒污染的事件已经在行业内受到广泛关注。具体描述的 事件包含，例如Genzyme于2009年在它的CH0(中国仓鼠卵巢）细胞培养基中检测到水泡 疫病毒属2117污染,该事件阻止了 Ccrczynu、?和Fabrazymc?的生产；以及默克于2010年 在Rotarix?疫苗中检测到猪圆环病毒1污染。一个可能的污染源发生于细胞培养阶段。除 了对生产企业造成的经济压力（一个报告中，估计每10000L生物反应器遭受的污染加上来 自机构的罚款可以导致上亿的损失），这种事件也会给病人带来风险并中断生物制药产品 的制备（Liu et al.，Biotechnol. Prog. 2000, 16, 425-434)。其结果是，监管审查加强，以及 对病毒污染的检测、防止和补救技术的需求也在加强。
[0002] 总体而言，病毒污染可以被分为上游病毒污染和下游病毒污染。下游污染可以通 过使用封闭系统控制，然而，特别是，上游污染难以控制，其甚至难以通过大量的测试检测。 病毒污染也可能源自于在生物制药生产中所使用源自动物的材料。其中，所述生产细胞系 没有外源病毒污染物，而且生产不涉及使用源自动物的材料，但病毒污染物仍然可以通过 细胞培养基进入。例如，合成培养基中可能添加了由含有血清的系统产生的重组生长因子， 然而无蛋白培养基可能包含过滤后的蛋白水解物。然而，病毒污染甚至可发生于整个化合 物成分清楚的培养基中，这是因为大量的培养基成分可能保存在未经灭菌的容器中。传统 的除菌级滤器既没有设计预防病毒污染物，也不能够防范病毒污染物，所以需要使用其他 措施以确保病毒安全性。
[0003] 在生产过程中的一个或多个检查点进行外来病毒的检测是一种标准操作。然而， 对于生物制药产品的病毒污染来说，单独的检测是一种不充分的措施，特别是，病毒污染物 的存在是未预测的、未知的或是一种新兴病毒制剂。这种病毒制剂甚至能够逃脱精心设计 的对大量病毒测序的DNA微阵列的检测。该挑战还包含感染细胞培养基所需的低水平的病 毒污染物以及目前有限的检测试验灵敏度。
[0004] 高滴度的病毒污染物可能不以改变细胞培养参数（例如，超出它们的正常范围的 培养密度、蛋白滴度）的形式而显现。另一方面，感染力试验具有高度特异性，并且每种病 毒需要不同的条件。由于病毒污染，下游设备、流体和产品可能被污染，批次装备、废物处 理、销售丧失和净化会导致百万美元。由于样品的异质性和涉及的生物制药生产过程的大 体积，因此，难以彻底的筛选原材料中的病毒。
[0005] 清除病毒的技术可以被分为两组：灭活和过滤。灭活方法导致病毒感染力不可逆 的损失，然而，过滤方法力图机械性地减少病毒污染物。传统的灭活方法使用暴露于紫外线 (UV)照射、Y照射、加热、低或高pH、或溶剂/清洁剂的方法。例如，UV照射能够有效地且 不可逆地消除病毒活性，但是对于大规模生产可能是无法操作的或者对于成品培养基是不 适合的。高压灭菌法虽然对于热稳定液体是可行的，但是可能改变敏感型的培养基。一种 已知的替代方法是高温短时（HTST)热处理，其虽然不苛刻，但是需要昂贵的设备、自动化 程序和验证程序以维持培养基特征。暴露于低或高pH的方法，对于可能的病毒污染物范围 是不起作用的，其会不利地影响培养基的质量或渗透性。暴露于溶剂/清洁剂的方法，同样 不是一个广谱方法，其仅对含有脂质膜的病毒有效。因此，理想的方法应该在成本考虑和达 到清除原材料病毒的需求之间取得平衡，并能提供一种不影响生长速度或产量的广谱解决 方案。
[0006] 病毒保留过滤提供了适当的平衡。它不会用化学方法改变培养基成分，也适合用 于热敏感型饲料/培养基。此外，由于它以体积排阻原理起作用，因此，病毒保留过滤是一 种广谱解决方案。然而，病毒保留滤膜是很昂贵的（大约每平方米约2000至5000欧元）。 由于所需膜面积的费用，培养基体积过滤的比流速（specific flow rate)低的特征使得该 方法对于适于大规模生物反应器的大规模生产造成了经济负担。例如，其中，病毒过滤以串 联形式连接，以进行无菌级培养基过滤，病毒过滤优选在一个工作日内完成，即在制备大批 量（bulk)培养基后最长2至10小时，以防止大批量培养基的污染。因此，在此关键时间窗 内需要大的过滤面积，但这反过来会增加成本。
[0007] 令人惊异地发现，所述现有技术中的病毒过滤的缺点可通过各自制剂（其为细胞 培养基或细胞培养基的至少一个成分）在病毒过滤器上进行至少大约24小时的过滤来克 月艮，其中，该病毒过滤器具有最大75nm的有效孔径。如果各自制剂所需的体积在较长时间 范围内过滤，例如至少24小时，那么病毒过滤器的容积需要极大地增加。此外，还令人惊异 地发现，通过这种延长时间，可以实现总体病毒滴度的显著降低。这对于细胞培养系统中的 上游病毒清除是特别有益的。
[0008] 因此，本发明的方法通过分别增加生产量和容积来加强病毒过滤的经济效率。根 据本发明所述的方法在容积为至少2000L/m 2时进行，因此，有助于使高容量病毒过滤器的 利用最大化，并降低与之相关的实际成本，并提供了一个适于大规模生产和易于融合到现 存生产过程的解决方案。
[0009] 本发明所述方法的巨大影响和各自病毒过滤器在无菌生产过程中的创造性使用， 特别是无菌制备过程，例如，所使用的细胞培养基和缓冲液可以通过以下实施例的方式来 理解。假设每平方米病毒滤膜的成本为平均大约3000欧元，所用细胞培养基的成本为每升 培养基大约10欧元，那么1000L病毒滤过的培养基的成本为每升培养基13欧元，这使得培 养基制剂的成本增加了 30%。如果可以用一个病毒过滤器膜过滤2000L，那么成本降低到 11. 50欧元。容积的进一步增加，例如超过5000L，则可以把成本降低到每升培养基低于0. 6 欧元，这使得提供的病毒过滤后的培养基的额外成本相当低。因此，通过增加病毒过滤方法 的容积，可显著地降低所使用的病毒过滤器的高成本，特别是对潜在病毒或病毒污染的上 游排除污染的成本。
[0010] 本发明分别全面地阐述了病毒过滤器的高成本和低容积问题。可凭借经病毒过 滤器进行至少大约24小时的病毒过滤来增加病毒过滤器的容积，其中，该病毒过滤器具有 最大75nm的有效孔径。令人惊异地发现，在维持过滤器完整性的同时，所用昂贵的病毒过 滤器的容积可以更好地利用至容积增加2~100倍。虽然容积增加2至3倍对生产过程和 相关生产成本有很大影响，但是根据本发明所述的方法可以实现容积增加至100倍或甚至 更多。这提供了很好的机会，并使得即使使用昂贵的病毒过滤器，病毒清除的成本也变得高 效；因此，昂贵的病毒过滤器可以用于进一步改善细胞培养过程中的病毒安全性，特别是用 于改善细胞培养过程、制药、诊断和/或化妆品和食品过程中的上游病毒清除。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种从制剂中清除病毒污染的方法，其中，该制剂为一种细胞培养 基或细胞培养基的至少一种成分。该方法包含使所述制剂通过最大有效孔径为75nm的病 毒过滤器过滤至少大约24小时。
[0012] 进一步地，本发明涉及使用最大有效孔径为75nm的病毒过滤器用于过滤至少大 约24小时，以清除制剂中的病毒污染物，其中，该制剂为一种细胞培养基或细胞培养基的 至少一种成分。
[0013] 此外，本发明涉及制剂在细胞培养、制药、诊断和/或化妆品制品以及食品制品中 的用途，其中，该制剂为根据本发明的任意一种方法所获得的细胞培养基或细胞培养基的 至少一种成分。
[0014] 根据本发明所述的所有方法和用途所使用的容积为至少大约2000L/m2,优选至少 大约3000L/m 2,最优选至少大约5000L/m2。此外，所述制剂需要经过过滤，并且分别进行过 滤至少24小时、或至少大约48小时至大约7个月、或大约72个小时至大约3个月。该过 滤在大约2°C至大约60°C的温度之间，或在大约10°C至大约40°C的温度之间，优选在大约 15°C至大约37°C之间进行。
[0015] 在本发明所有实施方式中，过滤在压力范围为大约lOOmbar至大约4000mbar之 间，优选在大约200mbar至大约3500mbar之间，最优选在大约lOOOmbar至大约3000mbar 之间进行。
[0016] 在本发明的所有实施方式中，所使用的病毒过滤器为病毒污染物实现至少lLog1Q 减少值（LRV)。
[0017] 令人惊异地发现，当过滤程序进行至少大约24小时，病毒过滤器的容积可以大大 增加。通常地，在大批量制剂制备之后，用于细胞培养的制剂例如大批量细胞培养基或缓冲 液在大约2至大约10小时以内分批过滤，以避免制剂被细菌或病毒污染。其结果是，在实践 中，过滤程序中所使用的病毒过滤器的最大容积几乎没有被利用，所述过滤程序在时间框 架为大约2至大约10小时内过滤各自制剂。因此，需要使用过多的过滤面积。相比之下，已 经发现，由于使用本发明所述的方法，在维持过滤完整性的同时，所用昂贵的病毒过滤器的 容积可以被利用至容积增加2~100倍。虽然容积增加2至3倍对生产过程和相关生产成 本有很大影响，但是根据本发明所述的方法可以实现容积增加至100倍或甚至更多。这提 供了很好的机会，并使得即使使用昂贵的病毒过滤器，病毒清除的成本也变得高效；因此， 昂贵的病毒过滤器可以用于进一步改善细胞培养过程中的病毒安全性，特别是用于改善细 胞培养过程、制药、诊断和/或化妆品和食品加工中的上游病毒清除。
[0018] 根据以下特定实施方式和权利要求项的更具体描述，会使本发明特别优选的实施 方式更加明显。
【附图说明】
[0019] 本发明进一步特别优选的说明可参考如附图所示的特定典型实施方式。这些附图 构成说明书的一部分。然而，需要注意的是，这些附图是为了举例说明本发明的实施方式， 因此，不能将其理解为是对实施方式范围的限制。
[0020] 图1表明使用不同的过滤器进行流速可控的病毒过滤的病毒过滤动力学（图1C)， 其中，所述过滤器都结合添加了 3批不同大豆水解液的细胞培养基（Kerry HyP印1510#1、 D0M0 SE50MAF UF#1和 #2)。
[0021] 所使用的过滤器和实验条件（同样见实施例1至实施例4)如下：
[0022] 过滤器 A :Sartorius VirosartCPV，180cm2;在 30 °C 下，流速为大约 30L/ (m2Xhr)；
[0023] 过滤器B :;在30°C下，流速为大约40-60lV(m2Xhr)。
[0024] 过滤进行最多9天或直到超过最大压力2000mbar。图1A表明每单位膜表面积的 过滤体积相对于时间的容积，在大约最低4000L/m 2至大约12000L/m 2的范围内。取决于过 滤器类型，过滤终点的最大压力在大约600mbar至2400mbar (图1B)之间。一般而言，大豆 水解液之间的区别对于容积和最大压力的影响非常地低。
[0025] 图2表明使用不同的过滤器和结合