专利名称：新的细胞因子zalpha11配体的制作方法
新的细胞因子zaIphal 1配体本申请是申请日为2000年3月9日、申请号为200610103151. 5、发明名称为“新的细胞因子zalphall配体”的发明专利申请的分案申请。
背景技术：
多细胞生物体细胞的增殖与分化是受激素和多肽生长因子控制的。这些可扩散的分子使细胞彼此联系并协同作用形成细胞、组织和器官，并修复受损的组织。激素和生长因子的例子包括类固醇激素(如雌激素、睾酮)、甲状旁腺素、促卵泡激素、白介素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)^l 细胞生成素(EPO)和降钙素。激素和生长因子通过与受体结合影响细胞代谢。受体可以是与细胞内信号途径如第二信使系统结合的整合膜蛋白。其它类别的受体是可溶性分子，如转录因子。细胞因子一般都刺激造血谱系细胞的增殖或分化或参与机体的免疫和炎性反应机制。影响造血的细胞因子的例子包括刺激红血细胞发育的促红细胞生成素(EPO)、刺激巨核细胞谱系细胞发育的血小板生成素(TPO)，以及刺激嗜中性细胞发育的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这些细胞因子可用于恢复贫血、血小板减少和中性白细胞减少病人，或接受肿瘤化疗病人体内的正常血细胞水平。白介素是一个介导包括炎症在内的免疫学反应的细胞因子家族。白介素介导各种炎症病理学过程。对免疫反应极为重要的是T细胞，其产生许多细胞因子并产生针对抗原的适应性免疫。已将T细胞产生的细胞因子分为1型和2型两大类型(Kelso，A. Immun. Cell Biol. 76 :300-317,1998)。1 型细胞因子包括 IL-2、IFN-γ、LT-α，并参与炎性反应、 病毒免疫、细胞内寄生虫免疫和同种异体移植排斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、 IL-10和IL-13，并参与体液反应、蠕虫免疫和过敏反应。1型和2型共有的细胞因子包括 IL-3、GM-CSF和TNF- α。有某些证据提示产生1型和2型的T细胞群体优先迁移到不同类型的发炎组织中。可以用抗原或其它刺激物激活成熟的T细胞，以产生进一步影响T细胞群体命运的细胞因子、生化信号分子或受体。可通过其细胞表面上的受体，包括B细胞受体及其它辅助分子活化B细胞，以完成如生产细胞因子等辅助细胞功能。天然杀伤(NK)细胞与T细胞和B细胞有共同的始祖细胞，并且在免疫监视中发挥作用。占血淋巴细胞约15 %的NK细胞并不表达抗原受体，因此不利用MHC识别作为与靶细胞结合的条件。NK细胞参与识别和杀伤某些肿瘤细胞及病毒感染的细胞。在体内，据信NK 细胞需要活化，但在体外，已证明NK细胞不经活化即可杀死某些类型的肿瘤细胞。已证明的细胞因子家族的体内活性说明了其它细胞因子、细胞因子激动剂及细胞因子拮抗剂的许多临床潜能及对这些分子的需要。本发明提供一种刺激造血细胞谱系细胞的新细胞因子及相关的组合物和方法，以满足这些需要。本发明提供了这类适合于这些和本领域技术人员显而易见的其它用途的多肽。附图简要说明
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图 1 举例显示人 IL-2、人 IL-15、zalphall 配体(SEQ ID NO :2)、人 IL-4、小鼠 IL-2、人GM-CSF和小鼠GM-CSF的多重序列对比。发明的详细描述在详细陈述本发明之前，明确下列术语的定义可能是有帮助的术语“亲和标记物”在本文中是指可连接到第二个多肽上以便为纯化或检测第二个多肽，或者为将第二个多肽连接到底物上而提供位点的多肽片段。原则上，抗体或其它特异性结合剂可利用的任何肽或蛋白质均可用作亲和标记物。亲和标记物包括多组氨酸序列、蛋白 A(Nilsson et al.，EMBO J. 4 :1075,1985 ；Nilsson et al.，Methods Enzymo 1. 198 :3，1991)、谷胱甘肽 S 转移酶(Smith and Johnson, Gene 67 :31，1988)、 Glu-Glu 亲禾口标记物(Grussenmeyer et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :7952-4, 1985)、物质 ρ、Flag 肽(Hopp et al. , Biotechnology 6 :1204_10，1988)、链霉抗生物素结合肽，或其它抗原表位或结合区(总地参见I^ord et al.，Protein Expression and Purification 2:95-107,1991)。编码亲和标记物的DNA可从供应商(如Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)本文所使用的术语“等位变异体”是指占据同一染色体基因座的有任何两个或多个可替换形式的基因。等位变异是通过突变天然产生的，并可导致群体内的表型多态性。 基因突变可能是沉默的(未改变所编码的多肽)，或者可编码已改变了氨基酸序列的多肽。 术语等位变异体还用于代表由基因等位变异体编码的蛋白质。本文所使用的术语“氨基末端”和“羧基末端”代表多肽内的氨基酸位置。当文中的这些术语参照多肽的特定序列或其部分使用时可表示邻近的或相对的位置。例如，多肽内某个位于参照序列羧基末端的序列是定位于参照序列羧基末端的附近，但不一定是在完整多肽的羧基末端。术语“补体/抗补体对”表示在适当条件下形成非共价结合的，稳定配对的不完全相同部分。例如，生物素和抗生物素(或链霉抗生物素)就是补体/抗补体对的原型成员。其它可举例的补体/抗补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、 有义/反义多核苷酸对等。当希望继后解离补体/抗补体对时，该补体/抗补体对最好有 < IO9M-1的结合亲和力。术语“多核苷酸分子的互补体”是指与参照序列相比较，具有互补碱基序列和相反方向的多核苷酸分子。例如，序列5' ATGCACGGG 3'互补于5' CCCGTGCAT 3'。术语“简并核苷酸序列”表示包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比较)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。术语“表达载体”是用于表示线性或环状的DNA分子，其包括编码有用多肽的片段，其中所说的片段可与其转录所需的附加片段可操作地连接。这样的附加片段包括启动子和终止子序列，并且还可包括一个或多个复制原点、一个或多个选择标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体一般是衍生于质粒或病毒DNA，或者可含有两种元件。当术语“分离的”用于多核苷酸时，是表示该多核苷酸已从其天然遗传环境中除去并因而没有其它额外的或不需要的编码序列，而且是以适用于遗传工程化蛋白质生产系统的形式存在。这种分离的分子是从其天然环境中分离的，并包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子没有与之常规联系的其它基因，但可包括天然存在的5'和3'非翻译区如启动子和终止子。鉴定相关区域的方法是本领域技术人员已知的(如参见Dynan and Tijan, Nature 316 :774-78,1985)。“分离的”多肽或蛋白质是见于其天然环境以外的情况下的，如从血液和组织中分离出的多肽或蛋白质。在一优选形式中，分离的多肽基本上没有其它多肽，特别是动物来源的其它多肽。优选的是提供高度纯化形式的，即纯度大于95%，更优选的是纯度大于99% 的多肽。当用于本文时，术语“分离的”并不排除有另外物理形式的如二聚体或另外糖基化或衍生化形式的同种多肽存在。术语“赘生”用于表示细胞时，是指经历新的和异常增生的细胞，特别是在增生为无控制的或进行性的，进而导致赘生物的组织中。赘生性细胞可以是恶性的，即侵入性的和转移的，或良性的。术语“可操作地连接的”是指DNA片段的排布使其功能与预期的目的相一致，例如转录在启动子中起始并通过编码片段进行到终止子。术语“直向同源物”表示从一个种中得到的多肽或蛋白质是从不同种生物体中得到的多肽或蛋白质的功能对应物。直向同源物间的序列差异是物种形成的结果。“共生同源物”是由生物体制得的不同但结构相关的蛋白质。据信共生同源物是通过基因复制产生的。例如，α-球蛋白、β-球蛋白，和肌红蛋白是彼此的共生同源物。“多核苷酸”是从5'到3'末端读出的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并可以是从天然来源分离的，体外合成的，或从天然和合成分子的结合体制备的。多核苷酸的大小以碱基对(“bp”)表示，可以是核苷酸数(“nt”)或千碱基数(“1Λ”)。在上下文允许的情况下，后两个术语可描述单链或双链的多核苷酸。当该术语用于双链分子时，其可代表总长度并将被理解为等同于术语“碱基对”。本领域技术人员应意识到，双链多核苷酸的两条链长度可以稍有不同，并且因受到酶切割而可使其末端是错开的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以是不配对的。“多肽”是由肽键连接的氨基酸残基的聚合物，并且可以是天然产生的或合成产生的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。术语“启动子”是指含有DNA序列的基因的一部分，其用于结合RNA聚合酶并启动转录。启动子序列通常但不总是见于基因的5'非编码区。“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可包括非肽成分，如糖基团。其中产生蛋白质的细胞可将糖和其它非肽取代基加到蛋白质上，并将随细胞类型而变化。本文中蛋白质是依赖它们的氨基酸主链结构定义的；取代基如糖基团一般不是特定的， 但却可以是存在的。术语“受体”是指与生物活性分子(即配体)结合并介导配体对细胞作用的细胞结合蛋白。膜结合受体的特征是有多个肽结构，包括细胞外配体结合区和通常参与信号转导的细胞内效应区。配体与受体的结合导致受体的构象改变，引起效应区与细胞内其它分子间的相互作用。这种相互作用本身又导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用相联系的代谢过程包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、cAMP产生增加、细胞钙转移、膜脂质转移、 细胞粘着、肌醇脂水解和磷脂水解。一般说来，受体可以是膜结合的、胞质的或核的；单体的 (如甲状腺刺激激素受体、肾上腺素能受体)或多聚的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。术语“分泌信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所说的多肽为较大多肽的一个组分，其指引较大多肽通过合成该多肽的细胞的分泌途径。在瞬时通过分泌途径期间，较大多肽常常被裂解以去除分泌肽。本文使用的术语“剪接变异体”是指从基因转录的另外形式的RNA。剪接变异是通过使用在转录的RNA分子内的或不太常见的是在单独转录的RNA分子之间的可变剪接位点天然产生的，并且可产生几个从同一基因转录的mRNA。剪接变异体可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语剪接变异体在本文中也用于表示由从基因转录的mRNA的剪接变异体编码的蛋白质。用不精确的分析方法(如凝胶电泳)测得的聚合物分子量及长度应被理解为近似值。当这些值用“大约”X或“近似”X表示时，应理解为X的值精确到士 10%。文中所引用的所有文献均全文用作参考。本发明部分地基于发现了一个新的DNA序列，该序列编码具有四螺旋束细胞因子结构的蛋白质。通过本文详细描述的克隆、增殖测定和结合研究，已鉴定出一个编码新的配体多肽的多核苷酸序列，所说的配体对以前描述的孤独受体zalphall有高度特异性。这种称为zalphall配体的多肽配体从活化的人外周血细胞(hPBC，用于筛选⑶3)的产生cDNA 文库中分离的。CD3是淋巴样来源细胞，特别是T细胞所特有的细胞表面标记。在下列实施例中，使用在没有其它生长因子情况下依赖zalphall孤独受体相关联的存活和生长途径的细胞系，筛选编码zalphall配体的cDNA源。用于转染和表达 zalphall受体的优选的生长因子依赖性细胞系是BaFSO^alacios and Steinmetz, Cell 41 :727-734,1985 ；Mathey-Prevot et al.，Mol. Cell Biol.，6 :4133-4135,1986)。 然而，FDC-Pl(Hapel et al. ，Blood 64 :786-790,1984)禾口 M07e(Kiss et al. ，Leukemia 7 235-240,1993)等其它生长因子依赖性细胞系也适用于这一目的。zalphall受体的氨基酸序列表明，所编码的受体属于1类细胞因子受体亚族，其中包括但不只限于IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF和G-CSF等的受体(参见 Cosman, "The Hematopoietin Receptor Super family", Cytokine 5(2) :95-106,1993)。 共同拥有的PCT专利申请US99/22149中充分描述了 zalphall受体。分析zalphall受体 mRNA的组织分布显示，其在淋巴结、外周血白细胞(PBL)、脾、骨髓和胸腺中均有表达。另外，mRNA在衍生于伯基特淋巴瘤的Raji细胞系(ATCC No. CCL-86)中很丰富。受体的组织分布提示预期的zalphall配体的靶是造血谱系细胞，特别是淋巴样始祖细胞和淋巴样细胞。作用于淋巴样细胞的其它已知四螺旋束细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7和IL_15(有关综述可参见 Nicola et al. , Advances in Protein Chemistry 52 :1-65,1999 ；Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76 :300-317,1998)。⑶3+选择的、PMA/离子霉素刺激的人外周血细胞的条件培养基(CM)支持BaF3 细胞的生长(后者表达zalphall受体并依赖于IL-3)。1)未经PMA/离子霉素刺激的细胞或幻未经CD3选择(有或没有PMA/离子霉素刺激)的细胞的条件培养基不支持BaF3/ zalphall受体细胞的生长。对照实验证明，这种增殖活性并不是由于其它已知的生长因子所致，而且这些条件培养基刺激zalphall受体表达细胞增殖的能力可被可溶形式的受体中和。
用肉眼观察培养物和/或用增殖测定法鉴定与⑶3+选择的、PMA/离子霉素刺激的人外周血细胞的CM接触的表达zalphall受体的BaF3细胞的增殖。许多适用的增殖测定法都是本领域已知的，并且包括还原染料如alamarBlue (AccuMed International, Inc. ffestlake, Ohio) ,3-(4,5- 二甲基噻唑 _2_ 基)_2，5_ 二苯基溴化四唑错(Mosman, J. Immunol. Meth. 65 :55-63,1983) ,3-(4,5- 二甲基噻唑-2-基)-5，3-羧甲氧基苯基-2H-四唑错、2，3-双甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-氢氧化四唑错，以及氰二甲苯基-氯化四唑错(其可购自Polysciences，Inc. , Warrington, PA)的测定法；细胞分裂测定法(如检测3H-胸苷的掺入)；染料排除测定法(例如使用萘黑和锥虫蓝)；染料摄入法(使用二乙酰荧光素)；以及铬释放法(一般来说，参见Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，3rd. ed.，Wiley_Liss，1994，该文献引入本文作为参考)。从⑶3+选择的、PMA-和离子霉素刺激的初级人外周血细胞制备cDNA文库。将 CD3+选择的，PMA-和离子霉素刺激的人外周血细胞cDNA文库分成含有多个cDNA分子的集合体，并转染到宿主细胞系如BHK570细胞(ATCC登记号10314)中。在不含外源生长因子的培养基中培养被转染的宿主细胞并收集条件培养基。测定条件培养基刺激被zalphall 受体转染的BaF3细胞的增殖。产生条件培养基的cDNA集合体可刺激BaF3/zalphall受体细胞，因而可据此鉴定所说的cDNA集合体。将此汇集的质粒DNA电穿孔送到大肠杆菌中。 从单个菌落分离cDNA并分别转染到BHK570细胞中。根据BaF3/zalphall受体增殖测定中的阳性结果鉴定阳性克隆，并使用可溶性zalphall受体中和增殖以测试特异性。分离阳性克隆后，序列分析结果表明质粒DNA内所含有的多核苷酸序列是新的。分泌信号序列由氨基酸残基I(Met)至31(Gly)组成，并且成熟的多肽由氨基酸残基 32 (Gln)至 162 (Ser)组成(如 SEQ ID NO 2 所示)。一般说来，推测细胞因子具有四α螺旋结构，其中螺旋A、C和D在配体-受体相互作用中是最重要的，而且在家族成员间是更高度保守的。参照SEQ ID NO :2中所示的人 zalphall配体氨基酸序列，对人zalphall配体、人IL-15、人IL-4和人GM-CSF氨基酸序列进行对比后推测zalphall配体螺旋A是由氨基酸残基41_56限定的，螺旋B是由氨基酸残基69-84限定的，螺旋C是由氨基酸残基92-105限定的，并且螺旋D是由氨基酸残基 135-148限定的(参见SEQ ID NO :2)。结构分析提示A/B环是长的，B/C环是短的，并且C/ D环同样是长的。该环结构导致一个上-上-下-下螺旋组织结构。如
图1中所示，半胱氨酸残基在zalphall配体和IL-15间是绝对保守的。在IL-15和zalphall配体之间保守的半胱氨酸残基相当于SEQ ID而2的氨基酸残基71、78、122和125。某些半胱氨酸残基的保守情况也见于IL-2、IL-4、GM-CSF和zalphall配体中(相当于图1所示SEQ ID NO 2 的氨基酸残基78和125)。始终一致的半胱氨酸方位进一步证实了四螺旋束结构。如图1 中所示，如SEQ ID NO 2中所示的Glu-Phe-Leu序列(残基136-138)在包括IL-15、IL-2、 IL-4, GM-CSF和zalphall配体的家族中也是高度保守的。基于多重序列对比(如图1所示)对zalphall配体所作的进一步分析预示，氨基酸残基44、47和135(如SEQ ID NO :2中所示)在zalphall配体与其相关受体的结合中发挥重要作用。此外，预计的鼠zalphall配体的氨基酸序列与预计的人蛋白质有57%相同。 基于人和鼠zalphall配体序列之间的比较，发现预计编码α螺旋A和D的区域中有充分保守的残基。SEQ ID N0:1中显示了本文所描述的编码zalphall配体多肽区域、结构域基元、残基的相应多核苷酸。对IL-4和IL_2(两者都是与zalphall配体高度相关的)进行了详细的突变分析。 分析小鼠 IL-2 (Zurawski et al. ,EMBO J. 12 :5113-5119,1993)显示，螺旋 A和 C 中的残基对于与IL_2Ri3结合是重要的；关键的残基是ASp34、ASn9i^n Asnici3t5鼠IL-2环Α/Β和螺旋B 内的多个残基对于IL-2Ra结合是重要的，而螺旋D中只有单个残基Gln141是与IL-2Ra结合所必需的。同样，螺旋A和C是IL-4和IL-4Rci (结构上相似于IL-2Rα )间相互作用的位点，并且螺旋D内的残基对IL-2Ra和IL_2相互作用是非常重要的(Wang et al. ,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :1657-1662,1997 ；Kruse et al.，EMBO J. 11 :3237-3244,1992)。具体地说，人IL-4中的突变Tyr124至Asp产生一种拮抗剂，其与IL-4R α但不与IL-2R α结合，因而不能产生信号(Kruse et al.，文献同上，1992)。虽然人和鼠zalphall配体间螺旋A是相对充分保守的，但螺旋C却有较大差异。 两个种的该区域尽管具有占优势的酸性氨基酸，但也有体现zalphall配体与其“β ”型受体间相互作用方面的种特异性的序列差异。zalphall配体环Α/Β和螺旋B在种间是充分保守的；尽管尚未鉴定出相当于IL-2RCI的受体亚单位，但贯穿该区域的保守性提示其在功能上是重要的。人和鼠zalphall配体的D螺旋也是高度保守的。可以通过zalphall配体螺旋D内的突变来设计zalphall受体拮抗剂。这些突变可以包括从残基Gln145(SEQ ID NO 2)截短蛋白质，或者将Gln145或Ile148 (SEQ ID NO :2的；相当于人IL-4中的Tyr124)突变成诸如Ala或Asp的残基。破坏zalphall配体螺旋结构的任何突变均可消除与其受体的结合，并因而抑制信号转导。也根据其组成螺旋的长度对四螺旋束细胞因子进行分组。“长螺旋”形式的细胞因子一般由24-30残基的螺旋组成，其中包括IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生长激素(hGH)。“短螺旋”形式的细胞因子一般由18-21残基的螺旋组成，其中包括IL-2、IL-4和GM-CSF。据信zalphall配体是短螺旋形式细胞因子组的新成员。使用CNTF和IL-6进行的研究证明，可以将CNTF螺旋换成IL-6中的等同螺旋，使嵌合体具有CNTF结合性质。为此，可基于结构同源性确定四螺旋细胞因子的功能区，而不必考虑序列同一性，并且可保持嵌合体内的功能完整性(Kallen et al. , J. Biol. Chem. 274 11859-11867，1999)。因此，可将zalphall配体的螺旋区用于制备嵌合融合分子(特别是与其它短螺旋形式的细胞因子融合)，以确定并调节受体结合特异性。其中特别感兴趣的是用螺旋A和/或螺旋D改造的融合蛋白，以及结合其它短形式细胞因子如IL-2、IL-4、IL-15和 GM-CSF的螺旋和环区域的融合蛋白质。表1中显示包括zalphall配体、IL_2、IL_4、IL-15 和GM-CSF的螺旋A、B、C和D，以及环A/B、B/C和C/D的氨基酸残基。表 权利要求
1.包含与SEQID NO :115中所示的zalphall受体结合的多肽的拮抗剂的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制参与调节造血和免疫功能的细胞的扩充、增殖、活化或分化，其中所述所述多肽由下列多核苷酸编码(a)由SEQID NO 1的核苷酸140-532组成的多核苷酸；(b)编码SEQID NO 2的氨基酸残基32-162的多核苷酸；或(c)与(a)或(b)的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸。
2.权利要求1的用途，其中所述多肽由SEQID NO :2中第32-162位氨基酸残基所示的序列组成。
3.权利要求1或2的用途，其中所述拮抗剂为反义多核苷酸或核酶。
4.权利要求1或2的用途，其中所述拮抗剂为抗体。
全文摘要
本发明涉及zalpha11配体多肽和多肽分子。zalpha11配体是新的细胞因子。该多肽可用于刺激造血细胞的体外和体内增殖和/或发育的方法中。本发明还涉及生产蛋白质的方法，其应用及抗体。
文档编号C12N15/19GK102406937SQ20111030378
公开日2012年4月11日 申请日期2000年3月9日 优先权日1999年3月9日
发明者A·J·奈尔森, A·K·哈蒙德, C·A·斯普里切尔, D·C·福斯特, J·A·格罗斯, J·E·诺瓦克, J·V·约翰斯顿, R·D·霍利, S·R·普里斯奈尔, S·R·迪隆 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司