专利名称：一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法。
背景技术：
尽管转基因技术存在争议，但是转基因植物在农业生产、环境保护、医疗等领域应 用日益广泛。用于构建转基因植物的方法有多种，但是目前最为成熟的方法是经农杆菌介 导的方法。通常，取目的植物外植体诱导出愈伤组织，用于转基因操作。此外，植物的快速繁殖常常需要将植物体的一部分诱导成愈伤组织，愈伤组织再 经再分化步骤形成完整植株，实现植物的快速繁殖。再次，植物愈伤组织可用于种质资源的保存，可将优良品种的植株诱导成愈伤组 织，愈伤组织通过分化形成性状不发生改变的子代，以利于优良品种的传代。最后，黄菖蒲属于一年生挺水植物或岸生植物，多用于人工景观生态系统的构建。 黄菖蒲具有发达的根系，能够吸收重金属，且具有一定的耐污能力。由于黄菖蒲具有较大的 生物量，具有一定的去除水体氮磷和有机污染的能力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易行的黄菖蒲愈伤组织的培养方法， 以使愈伤组织在短时间内得到快速增殖而不需愈伤组织重新诱导，从而为植物转基因提供 大量的材料。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法，它包括如下步骤(1)当黄菖蒲种子胚芽上的愈伤组织直径超过0. 5cm时，将其从种子胚芽上切除， 接种到新鲜的固体继代培养基上，进行继代培养，此后每2周继代培养一次；(2)取出一粒经步骤(1)继代培养的愈伤组织(直径约为0. 5 1cm)在无菌滤纸 上用镊子夹成直径为0. 1 0. 2cm的小块，放入新鲜的培养液中，在25°C、90转/分钟条件 下培养2周，形成愈伤组织悬浮液，将愈伤组织悬浮液按1 30 (ν/ν)接种到新鲜的培养液 中进行继代培养，继代培养周期为2周；(3)当需要使用愈伤组织进行快速繁殖或者转基因时，使用50目孔径的无菌尼龙 膜过滤步骤(2)中的愈伤组织悬浮液，得到的大块愈伤组织(即不能通过50目孔径的愈伤 组织)转接到固体继代培养基上备用(例如后续的快繁或转基因操作)，过滤后剩余的愈伤 组织悬浮液继续按照步骤(2)的方法培养；步骤(1)和(3)中，所述的固体继代培养基组分如下MS培养基，另加终浓度为 30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L 2,4- 二氯苯氧基乙酸(2，4_D)，3g/L琼脂糖；步骤(2)中，所述的培养液组分如下MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖、 500mg/L 的水解酪蛋白、2mg/L 2,4-D ；其中，黄菖蒲种子胚芽上的愈伤组织按如下方法诱导将灭过菌的黄菖蒲种子接种到固体培养基上，置于25°C、黑暗条件下培养2周，诱导出愈伤组织；所述的固体培养基 组分如下MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L2,4-D, 3g/ L琼脂糖。上述黄菖蒲种子按如下方法灭菌(a)采集黄菖蒲种子，手工去除外壳；(b)将步骤(a)处理后的种子置于自来水下冲洗干净；(c)将步骤(b)处理后的种子泡在浓度为0. 01% (ν/ν)的Tween 80水溶液中，搅 拌24 48小时；(d)用蒸馏水冲洗步骤(C)处理后的种子，直到水澄清为止；(e)将步骤(d)处理后的种子放到75% (ν/ν)的酒精中，搅拌90 120秒；(f)将酒精倾倒出去，加入灭菌的蒸馏水，冲洗3 4次；(g)将步骤(f)处理后的上述种子放入30% (ν/ν)的次氯酸钠溶液中，搅拌30 60分钟；(h)将次氯酸钠溶液倾倒出去，用灭菌的蒸馏水冲洗种子6 8次。有益效果本发明中，建立了黄菖蒲愈伤组织的悬浮培养体系，该体系的建立，能 够很好的保存愈伤组织，这种继代培养的方式比固体培养基得到的愈伤组织更加致密，表 面更加光滑，颜色更加均一。同时，悬浮培养建立后，愈伤组织可以不断增殖，形成很多小块 的愈伤组织，使愈伤组织数量迅速得到扩大。从而避免愈伤组织的从头诱导，节省时间，成 本。另，新鲜的黄菖蒲种子只在秋季能够采集到。老的种子往往附生大量微生物，对实验造 成较大的困难。建立本发明的悬浮培养体系之后，可以避免因种子问题产生的困境。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 黄菖蒲种子的灭菌。秋季采集黄菖蒲种子，手工方法去除种子外表皮。然后将种子用自来水冲洗干净。 将冲洗干净的种子放在2L的大烧杯中，加入约500mL的蒸馏水，并在水中加入0. 01% (ν/ ν)的Tween 80，放入搅拌子，在磁力搅拌机上温和搅拌24小时。次日，取出种子，用蒸馏水 冲洗，直到水澄清为止。将种子放到75% (ν/ν)的酒精中，不断搅拌，灭菌约90秒，小心倾 出酒精，加入灭菌的蒸馏水，冲洗3 4次，每次不短于5分钟；然后将种子放入30% (ν/ν) 的次氯酸钠溶液中，不断搅拌，灭菌30分钟，倾去次氯酸钠溶液，用灭菌的蒸馏水冲洗种子 6 8次，每次不短于5分钟。实施例2 愈伤组织的诱导。将灭菌过的种子放到灭菌过的滤纸上，吸干种子表面的水；然后将种子接种到装有20mL MS固体培养基(其中加入终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L2, 4-D，3g/L琼脂糖的培养瓶中，每培养瓶可接种3粒种子；将培养瓶置于黑暗条件下，25°C培 养约2周时间，即可诱导出愈伤组织。实施例3 愈伤组织的培养。(1)当愈伤组织直径达到0. 5cm时，将其从种子胚芽上切除，接种到新鲜的固体继代培养基上(MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L2，4-D， 3g/L琼脂糖，进行继代培养，此后每2周继代培养一次。(2)取出一粒愈伤组织(直径约为0. 5 1cm)在无菌滤纸上用镊子夹成小块(直 径约为0. 1 0. 2cm)，放入新鲜的培养液(MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/ L的水解酪蛋白，2mg/L 2，4-D中，25°C，90转/分钟下培养2周，形成愈伤组织悬浮液，将愈 伤组织悬浮液按1 30 (ν/ν)接种到新鲜的培养液中进行继代培养，继代培养周期为2周。(3)当需要使用愈伤组织进行快速繁殖或者转基因时，使用50目孔径的无菌尼龙 膜过滤步骤(2)中的愈伤组织悬浮液，得到的大块愈伤组织转接到固体继代培养基上备用 (例如后续的快繁或转基因操作)，过滤后剩余的愈伤组织悬浮液继续按照步骤(2)的方法 培养。例如，按照步骤(2)的方法将小块愈伤组织放入新鲜的培养液，在25°C，90转/分钟 下培养一周后，此时已有一些大块愈伤组织在培养液中形成，如果这时需要使用愈伤组织 进行快速繁殖或者转基因等操作，可用50目孔径的无菌尼龙膜过滤出大块的愈伤组织并 转接到固体继代培养基上培养备用，过滤去除掉大块愈伤组织后的愈伤组织悬浮液继续放 置在25°C，90转/分钟下再培养一周，之后再将愈伤组织悬浮液按步骤(2)中的继代培养 方法培养。在之后的继代培养过程中，如果有大块的愈伤组织形成，此时可随时使用50目 孔径的无菌尼龙膜过滤出大块的愈伤组织并转接到固体继代培养基上培养备用，过滤去除 掉大块愈伤组织后的愈伤组织悬浮液继续进行继代培养。通过上述培养方法，在1-2月内，500mL悬浮培养体系(初始仅需一粒直径5mm左 右的愈伤组织)可以形成30到50粒直径为1 2mm的愈伤组织。实施例4 先按实施例1和2的方法进行种子的灭菌和愈伤组织的诱导，一粒种子仅能形成 一粒愈伤组织，且愈伤组织经继代培养1-2月之后方能长到2 3mm左右。在实际操作中，单子叶植物愈伤组织的诱导具有一定的困难，脱分化较难，出愈率较低。因此，愈伤组织的诱导实际操作存在着大量的问题。另外，黄菖蒲种子外表皮难以去 除，且含有大量的附生菌，次氯酸钠甚至升汞也难以完全进行灭菌，本发明中的灭菌方法中 将种子用含有0.01% (ν/ν)的TweenSO的水浸泡之后，可以提高灭菌的效率，但是愈伤组织 诱导过程中灭菌任然是愈伤组织诱导的首要问题。对于以上困难，实施实例3能够有效避免愈伤组织的重复诱导，从而提高效率，节 约了成本。
权利要求
一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法，其特征在于它包括如下步骤(1)当黄菖蒲种子胚芽上的愈伤组织直径超过0.5cm时，将其从种子胚芽上切除，接种到新鲜的固体继代培养基上，进行继代培养，此后每2周继代培养一次；(2)取出一粒经步骤(1)继代培养的愈伤组织在无菌滤纸上用镊子夹成直径为0.1～0.2cm的小块，放入新鲜的培养液中，在25℃、90转/分钟条件下培养2周，形成愈伤组织悬浮液，将愈伤组织悬浮液按1∶30(v/v)接种到新鲜的培养液中进行继代培养，继代培养周期为2周；(3)当需要使用愈伤组织进行快速繁殖或者转基因时，使用50目孔径的无菌尼龙膜过滤步骤(2)中的愈伤组织悬浮液，得到的大块愈伤组织转接到固体继代培养基上备用，过滤后剩余的愈伤组织悬浮液继续按照步骤(2)的方法培养；步骤(1)和(3)中，所述的固体培养基组分如下MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸，3g/L琼脂糖；步骤(2)中，所述的培养液组分如下MS培养基，另加终浓度为30g/L的蔗糖、500mg/L的水解酪蛋白、2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸。
2.根据权利要求1所述的黄菖蒲愈伤组织的培养方法，其特征在于黄菖蒲种子胚芽 上的愈伤组织按如下方法诱导将灭过菌的黄菖蒲种子接种到固体继代培养基上，置于 25°C、黑暗条件下培养2周，诱导出愈伤组织；所述的固体培养基组分如下MS培养基，另加 终浓度为30g/L的蔗糖，500mg/L的水解酪蛋白，2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸，3g/L琼脂糖。
3.根据权利要求2所述的黄菖蒲愈伤组织的培养方法，其特征在于黄菖蒲种子按如下 方法灭菌(a)采集黄菖蒲种子，手工去除外壳；(b)将步骤(a)处理后的种子置于自来水下冲洗干净；(c)将步骤(b)处理后的种子泡在浓度为0.01%(ν/ν)的Tween 80水溶液中，搅拌 24 48小时；(d)用蒸馏水冲洗步骤(c)处理后的种子，直到水澄清为止；(e)将步骤(d)处理后的种子放到75%(ν/ν)的酒精中，搅拌90 120秒；(f)将酒精倾倒出去，加入灭菌的蒸馏水，冲洗3 4次；(g)将步骤(f)处理后的上述种子放入30%(ν/ν)的次氯酸钠溶液中，搅拌30 60 分钟；(h)将次氯酸钠溶液倾倒出去，用灭菌的蒸馏水冲洗种子6 8次。
全文摘要
本发明公开了一种黄菖蒲愈伤组织的培养方法当黄菖蒲种子胚芽上的愈伤组织直径超过0.5cm时，将其从种子胚芽上切除，接种到新鲜的固体继代培养基上，进行继代培养，此后每2周继代培养一次；取出一粒愈伤组织在无菌滤纸上用镊子夹成小块，放入新鲜的培养液中，在25℃、90转/分钟条件下培养2周，形成愈伤组织悬浮液，将愈伤组织悬浮液按1∶30(v/v)接种到新鲜的培养液中进行继代培养，继代培养周期为2周；当需要使用愈伤组织进行快速繁殖或者转基因时，使用50目孔径的无菌尼龙膜过滤愈伤组织悬浮液，得到的大块愈伤组织转接到固体继代培养基上备用，过滤后剩余的愈伤组织悬浮液继续培养。本发明工艺简单，愈伤组织诱导迅速。
文档编号A01H4/00GK101816287SQ20101016298
公开日2010年9月1日 申请日期2010年5月5日 优先权日2010年5月5日
发明者华海峰, 张全兴, 李丽观, 杜宏伟, 杨柳燕, 武俊, 肖 琳, 许超, 陈洪龄 申请人:南京大学;江苏九久环境科技有限公司