ide Sequencing推导出肽段序列，大豆活性肽主要 组分的一级结构如表4所示。
[0068] 由表1?3结果可知：本实施例制得的大豆活性肽中总蛋白含量达到94%以上， 其中分子量在l〇〇〇Da以下的低聚肽占总蛋白的质量百分比达到93%以上，并且富含19种 氨基酸。由表4结果可知：大豆活性肽中含有二肽、三肽、四肽、五肽和六肽，其中以二肽、 三肽、四肽为主，其主要成分包括：QDPQ、ERQ、STPH、EGGAH、VGPQ、DVR、GF等，并且从大豆 活性肽中首次鉴定出的肽包括YE (分子量310. 31Da)、ERQ (分子量431. 50Da)、QDPQ (分 子量 486. 48Da)、EGGAH (分子量 469. 45Da)、PQGAR (分子量 527. 58Da)、AAGGSN (分子量 475. 46Da)。
[0069] 实施例2
[0070] 除酶解处理具体为：向蛋白质含量>90%的大豆分离蛋白中加入9倍的去离子水， 混合均匀后，升温至90?95°C，保温55?60分钟后，降温至50?55°C时，调节蛋白溶液的 pH值为7?8,以每克蛋白质3000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入由木瓜蛋白酶(南宁 庞博生物工程有限公司)和碱性蛋白酶ALKALINE PROTEASE C0NCENTRATE(DSM公司)混合而 成的复合非特异性蛋白酶(其中木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶ALKALINE PROTEASECONCENTRATE 的酶量分别为1000单位和2000单位)，于50?55°C下保温第一酶解处理2. 5小时，制得 第一酶解液；调节第一酶解液的pH值为8?9后，再以每克蛋白质2000单位的酶量向所述 第一酶解液中加入由风味蛋白酶FLAV0URZYME500MG (诺维信公司）和羧肽酶Validase FP Cone. (DSM公司）混合而成的复合特异性蛋白酶(其中风味蛋白酶FLAV0URZYME500MG和羧 肽酶Validase FP Cone.的酶量均为1000单位)，于50?55°C下保温第二酶解处理3小时 后，将酶解液加热到90?100°C，保温15?20min进行灭酶，制得大豆蛋白酶解液外，其它 同实施例1，制得水分含量为1. 5%?5%的淡黄色粉末状大豆活性肽。
[0071] 经检测，本实施例制得的大豆活性肽中分子量在lOOODa以下的低聚肽占总蛋白 的质量百分比达到92%以上，内毒素含量低于50EU/g，其富含表3中的19种氨基酸，此外还 含有表4中的18种一级结构的多肽，基础理化成分及各组分的分子量分布结果分别见表1 和表2。
[0072] 实施例3
[0073] 除酶解处理具体为：向蛋白质含量> 90%的大豆分离蛋白中加入10倍的去离子 水，混合均匀后，升温至95°C，保温35?40分钟后，降温至45?50°C时，调节蛋白溶液 的pH值为7?8,并以每克蛋白质4500单位的酶量向所述蛋白溶液中加入由木瓜蛋白酶 (南宁庞博生物工程有限公司）、菠萝蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司）和碱性蛋白酶 Novozym37071 (诺维信公司）混合而成的复合非特异性蛋白酶(其中木瓜蛋白酶、菠萝蛋白 酶和碱性蛋白酶的酶量分别为1000单位、1500单位和2000单位)，于45?50°C下保温第一 酶解处理3. 5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白质3000单位的酶量向所述第一酶解液 中加入由羧肽酶Validase FP Cone. (DSM公司）和风味蛋白酶MAXZPR0 XF (DSM公司）组 成的复合特异性蛋白酶(羧肽酶Validase FP Cone.和风味蛋白酶MAXZPR0 XF的酶量均为 1500单位)，于45?50°C下保温第二酶解处理2小时后，将酶解液加热到120?130°C，保 温10?15min进行灭酶，制得大豆蛋白酶解液外，其它同实施例1，制得水分含量为1. 5%? 5%的淡黄色粉末状大豆活性肽。
[0074] 经检测，本实施例制得的大豆活性肽中分子量在lOOODa以下的低聚肽占总蛋白 的质量百分比达到92%以上，内毒素含量低于50EU/g，其富含表3中的19种氨基酸，此外还 含有表4中的18种一级结构的多肽，基础理化成分及各组分的分子量分布结果分别见表1 和表2。
[0075] 表1本发明大豆活性肽的基础理化成分
[0076]
【主权项】
1. 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述大豆活性肽添加剂中 分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比> 90%，并且所述低聚肽至少包括 YE、ERQ、QDPQ、EGGAH、PQGAR、AAGGSN 中的一种或多种。
2. 根据权利要求1所述的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述低聚肽还包括STPH、 VGPQ、DVR、GF中的一种或多种。
3. 根据权利要求1所述的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述大豆活性肽添加剂中 内毒素的含量<200EU/g。
4. 根据权利要求1所述的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述大豆活性肽添加剂是 通过依次采用非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解后，经分离纯化制 得的。
5. 根据权利要求4所述的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述非特异性蛋白酶选自 木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选 自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种或两种。
6. 权利要求1至5任一所述的大豆活性肽添加剂在细胞无血清培养上的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞包括CHO细胞、Vero细胞、 HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。
8. 权利要求1至5任一所述的大豆活性肽添加剂在促进细胞增殖、提高细胞活力和/ 或增强细胞产物表达上的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞包括CH0细胞、Vero细胞、 HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。
10. -种无血清培养基，其特征在于，包括权利要求1至5任一所述的大豆活性肽添加 齐U，所述大豆活性肽添加剂在所述无血清培养基中的浓度为〇. 〇1?20g/L。
11. 权利要求1至5中任一所述的大豆活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤： 1) 首先采用非特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行第一酶解处理，制得第一酶解液；然 后采用特异性蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解处理，制得大豆蛋白酶解液； 2) 将所述大豆蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳滤和 超滤，制得大豆活性肽；其中所述微滤采用孔径为50?500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截 留分子量为100?300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000?13000道尔 顿的滤膜进行。
12. 根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述非特异性蛋白酶的酶量为每 克蛋白2000?6000单位，其中包括0?1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500?2000单位酶 量的碱性蛋白酶、500?2000单位酶量的中性蛋白酶和0?1500单位酶量的菠萝蛋白酶 中的两种或多种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000?3000单位，其中包括500? 2000单位酶量的羧肽酶和1000?2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。
13. 根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将大豆分离 蛋白与水混合制成蛋白溶液后，以每克蛋白2000?6000单位的酶量向所述蛋白溶液中加 入所述非特异性蛋白酶，于40?60°C下第一酶解处理1. 5?4. 5小时，制得第一酶解液；再 以每克蛋白2000?3000单位的酶量向所述第一酶解液中加入所述特异性蛋白酶，于40? 60°C下第二酶解处理2?3小时后，灭酶，制得大豆蛋白酶解液。
14. 根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述微滤具体包括：先 采用孔径为200?500nm的滤膜对所述离心上清液进行第一微滤，制得第一微滤液，然后采 用孔径为50?200nm的滤膜对所述第一微滤液进行第二微滤，制得第二微滤液。
15. 根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述纳滤具体包括：采 用截留分子量为1〇〇?300道尔顿的卷式膜将经所述阳离子交换后的离心上清液浓缩至蛋 白质含量为5?10%后进行洗滤，使经洗滤后的离心上清液中无机盐的含量< 5% ;再将经 洗滤后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为20?40%。
【专利摘要】本发明提供一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂，所述大豆活性肽添加剂中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括YE、ERQ、QDPQ、EGGAH、PQGAR、AAGGSN中的一种或多种。本发明的大豆活性肽添加剂可以与多种基础培养基进行复配，用于对多种动物细胞进行无血清培养，其不仅大大降低了细胞培养基的成本，减少了动物源成分所带来的污染等问题，还能够促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物的表达。
【IPC分类】C12N5-071, C07K1-34, C07K1-18, C12P21-06, C07K1-36
【公开号】CN104593317
【申请号】CN201310531178
【发明人】蔡木易, 林峰, 刘艳, 张海欣, 谷瑞增, 鲁军, 魏颖
【申请人】中国食品发酵工业研究院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2013年10月31日