一种2,4-二羟基丁酸的生产方法

一种2,4-二羟基丁酸的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备2,4-二羟基丁酸(2,4-DHB)的方法，包括以下连续步骤：将苹果酸，琥珀酰-辅酶A和/或乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A，将之前获得的苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛，和使用DHB脱氢酶将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB。
【专利说明】-种2, 4-二羟基丁酸的生产方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种由苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A生产2, 4-二羟基 丁酸的新方法，该方法通过实现合成途径将苹果酸和/或乙醛酸和/或琥珀酰-辅酶A转 化为苹果酰-辅酶A，将苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛，然后将所述苹果酸-4-半 醛转化为2, 4-二羟基丁酸（2, 4-DHB)。

【背景技术】
[0002] 本发明中提及的羧酸在其盐形式（例如2, 4-二羟基丁酸盐）或酸形式（例如 2, 4-二羟基丁酸）下是等同命名的。
[0003] 2, 4-二羟基丁酸（等同于2, 4-DHB或DHB)是经济效益很可观的化合物。通过调整 适合的pH值，可以在水介质中容易地将DHB转化为α-羟基-Y-丁内酯。α-羟基-Y-丁 内酯是生产在动物营养品中有很大市场的蛋氨酸替代物2-羟基-4-(甲硫基）_ 丁酸酯 (HMTB)的重要前体（US2009/318715)。目前，α-羟基-γ-丁内酯通过多阶段反应衍生自 γ-丁内酯，所述多阶段反应为γ-丁内酯在α位置的卤化，和随后在碱性介质中以羟基取 代卤素原子的反应（US 2009/318715)。
[0004] 由于油价上涨，需要从可再生资源生产DHB。微生物能够将源自生物质的原料，如 糖或有机酸，转化为大量各种不同的化学成分（Werpy&Pet erSen，2004)。随着生物化学和基 因组学信息量的增长，可以修饰微生物以使其能以高产率和产量过量生产自然生成的代谢 中间体（Bailey，1991)。生产微生物的优化经常需要合理的代谢网络工程，以确保其中目标 代谢物的生物合成所需酶的过量表达，并减轻产物的反馈抑制。另外的可能性是使用能催 化目标代谢物生产的新酶系统。
[0005] 代谢工程方法和酶催化需要生化和产生目标代谢物的代谢途径调节方面的详细 知识。关于生产DHB的这些信息是无法获得的。仅有少量研究报道了琥珀酸半醛脱氢酶缺 乏症患者产生2, 4-DHB(Shinka等人2002)，然而没有确定2, 4-DHB生产中涉及的酶反应。 因此，2, 4-DHB的发酵或酶生产需要（i)确定能将易得到的前体转化为2, 4-DHB的热力学可 行途径，（ii)确定或构建途径中能够催化各反应步骤的酶和（iii)在适合的生物生产中， 途径酶的功能表达。
[0006] 本发明目的是为满足这些需求。


【发明内容】

[0007] 因此，本发明的一个目标是生产2, 4-DHB的方法，包括第一步将苹果酸和/或乙 醛酸和/或琥珀酰-辅酶A转化为苹果酰-辅酶A，第二步将苹果酰-辅酶A转化为苹果 酸-4-半醛，和第三步将苹果酸-4-半醛转化为2, 4-DHB。
[0008] 因此，本发明的一个目标是生产2, 4-DHB的方法，其包括第一反应（见图1)，其中 苹果酸通过与具有苹果酰-辅酶A合成酶活性的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[l. 1]，和/ 或其中琥珀酰-辅酶A通过与具有琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酰-辅酶A转移酶活性的酶反 应转化成苹果酰-辅酶A [1. 2]，和/或其中乙醛酸通过与具有苹果酰-辅酶A裂解酶活性 的酶反应转化成苹果酰-辅酶A[1. 3]。在第二反应中[2]，苹果酰-辅酶A通过与具有苹果 酰-辅酶A还原酶活性的酶反应转化成苹果酸-4-半醛。在第三反应中[3]，苹果酸-4-半 醛通过与具有DHB脱氢酶活性的酶反应转化成DHB。更确切地说，反应[3]在生物合成路径 中被具有苹果酸-4-半醛还原酶活性的酶催化。
[0009] 在本发明的另一个方面，生产2, 4-DHB方法的第一步涉及分别具有苹果酰-辅酶 A合成酶（等同于名为苹果酸硫激酶或苹果酸-辅酶A裂解酶（ADP形式）EC 6.2. 1.9)、 琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶（EC2. 8. 3.-)，或苹果酰-辅酶A裂解酶（EC 4. 1. 3. 24)活性，其分别将苹果酸、琥珀酰-辅酶A、或乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A。
[0010] 所述酶已经在利用丝氨酸循环用于甲醛固定的甲醇营养型细菌中被识别 (Chistoserdova 等人，2009 ;Smejkalov<5 等人，2010 ;Vuilleumier 等人，2009);在依赖 乙酸盐同化路径的细菌中被识别，该细菌独立于乙醛酸循环和异柠檬酸裂解酶的活性 (Meister等人，2005);和在利用3-轻基丙酸酯C02-固定循环用于自养生长（Zarzycki等 人，2009)的细菌中被识别。
[0011] 与上述酶共用同源的蛋白质也是本发明的一方面，例如功能性突变或功能性片 段。
[0012] 苹果酰-辅酶A合成酶由两个子单元MtkA和MtkB构成。因此，根据本发明，包含 苹果酰-辅酶A合成酶活性的蛋白质指明了所有至少30 %，优选至少50 %和更优选70 %与 下述蛋白质序列一致的多肽：M.petroleiphilum(YP 001022444和YP 001022445)甲基扭 曲杆菌（YP002962851和YP 002962852)的苹果酰-辅酶A合成酶子单元MtkA和MtkB或 M.capsulatus(YP 114179和YP 114180)的两个子单兀SucC和SucD的蛋白质序列。
[0013] 苹果酰-辅酶A裂解酶是同源六聚体且在不是利用乙醛酸循环来进行乙酸同化作 用的细菌中发现（Meister等人，2005)。因此，根据本发明，包含苹果酰-辅酶A裂解酶活 性的蛋白质指明了所有至少30%，优选至少50%和更优选70%与下述蛋白质序列一致的 多肽：甲基扭曲杆菌，荚膜红细菌，或天蓝色链霉菌的苹果酰-辅酶A裂解酶，Mcl的蛋白质 序列。
[0014] 本发明的另一方面，本发明的苹果酰-辅酶A裂解酶由SEQ ID No. 1或其任何突 变所示。
[0015] 琥拍酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶包括两个子单元SmtA和SmtB(Zarzycki 等人，2009) (Friedmann等人，2006)。因此，根据本发明，具有琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸 辅酶A转移酶活性的蛋白质指明所有至少30 %，优选至少50 %和更优选70 %与下述蛋白 质序列一致的多肽：嗜热光合绿丝菌的琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶的子单元 SmtA和 SmtB 的蛋白质序列（由 SEQ ID No. 191 和 SEQ ID No. 193 表示或由 SEQ ID No. 192 和 SEQ ID No. 194 所编码）。
[0016] 更普遍地，本发明意义上的两个蛋白质序列的一致性可以通过本领域技术人员已 知的方法进行识别。这些方法的例子是使用CLUSTALW(Larkin等人，2007)软件（http:// www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/使用网站所不默认参数）或BLAST校准程序 (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi 使用网站所示默认参数）。
[0017] 术语功能性变异包含的酶与在本申请具体描述的序列相比时，可以表现出基本上 的序列修饰而依然保持原有的酶活性。
[0018] 根据本发明，术语功能性片段是指酶的序列与原始的相比可以包括较少的氨基酸 而所述缩短的酶依然保持原有的酶活性。
[0019] 所述酶的可以通过至少一种突变获得改进，所述突变提高了突变酶分别对苹果 酸，琥珀酰-辅酶A，或乙醛酸的活性和/或底物亲和性。
[0020] 在本发明中，"提高了活性和/或底物亲和性"是指酶在突变前
[0021] -不能利用底物，和/或
[0022] -合成反应产物的最大特定收率至少低三倍，和/或
[0023] -具有对苹果酸，琥珀酰-辅酶A或乙醛酸，苹果酰-辅酶A或苹果酸-4-半醛的 亲和性至少低两倍，更优选三倍。
[0024] 苹果酰-辅酶A合成酶和苹果酰-辅酶A裂解酶的活性可以分别通过（SmejkaloW 等人，2010)或（Meister等人，2005)描述的酶测试进行测定。琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果 酸辅酶A转移酶的活性可以通过（Friedmann等人，2006)描述的酶测试进行测定。
[0025] 在更进一步的方面，根据本发明生产2, 4-DHB的方法的第二步涉及一种具有苹果 酰-辅酶A还原酶活性的酶，特征在于，其将苹果酰-辅酶A转化成苹果酸-4-半醛。
[0026] 所述酶能够在具有苹果酰-辅酶A还原酶，琥珀酰-辅酶A还原酶之间被识别，或 被报道3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A (HMG-CoA)还原酶、肉桂酰-辅酶A还原酶或乙醛 脱氢酶活性，或它们能够通过修饰所述的酶获得。
[0027] 丙二酰-辅酶A还原酶（EC 1. 2. 1. 75)和琥珀酰-辅酶A还原酶（EC1. 2. 1. 76) 在拥有经修饰的3-羟基丙酸循环来固定二氧化碳的细菌中被发现（Alber等人，2006 ; Kockelkorn&Fuchs，2009)，和在实施厌氧的琥拍酸降解途径的细菌中被发现（Seedorf 等人,2008 ;Sdhling &Gottschalk, 1993)。在真核生物和一些细菌中，HMG-CoA还原酶 (EC 1.1. 1.38, EC1. 1.1. 88)是异戊二烯生物合成途径的一部分。肉桂酰-辅酶A还原 酶（EC1. 2. 1. 44)是木质素生物合成中涉及的酶（Kawasaki等人，2006)。乙醛脱氢酶（EC 1. 2. 1. 10)在大量多种细菌中被发现，且其催化进入乙醇生产途径或乙醛的解毒步骤。
[0028] 在本法的进一步方面，苹果酰-辅酶A由ID No. 7或SEQ ID No. 10或其任意突变 或任意功能片段所示。
[0029] 因此，根据本发明，具有丙二酰-辅酶A还原酶活性的蛋白质指明了所有至少30% 与超嗜热古菌的丙二酰-辅酶A还原酶，Mcr(SEQ ID No. 7)的蛋白质序列一致的多肽。优 选它们至少50 %和更优选70 %-致。
[0030] 嗜热光合绿丝菌的丙二酰-辅酶A还原酶（SEQ ID No. 189经SEQ ID No. 190编 码）构成了本发明的另一个方面。至少30%与嗜热光合绿丝菌的蛋白质序列一致的多肽也 是本发明的一部分。优选它们至少50%和更优选70%-致。
[0031] 因此，根据本发明，具有琥珀酰-辅酶A还原酶活性的蛋白质指明了所有至少30% 与牙龈卟啉单胞菌的琥珀酰-辅酶A还原酶，SucD(SEQ ID No. 10)或与双官能团的超嗜热 古菌的丙二酰-辅酶A和琥珀酰-辅酶A还原酶Mcr(SEQ ID No. 7)的蛋白质序列一致的 多肽。优选它们至少50%和更优选70%-致。
[0032] 苹果酰-辅酶A还原酶活性能够通过实施例2 (见"酶分析"）描述的酶测试进行 测定。
[0033] 所述酶活性可以通过至少一种酶的突变提高，所述突变提高了突变酶分别对苹果 酰-辅酶A的活性和/或底物亲和性或降低了其对天然底物的活性。
[0034] 本发明也包含具有提高活性的经修饰的苹果酰-辅酶A还原酶。
[0035] 根据本发明的苹果酰-辅酶A还原酶在具体方面上与超嗜热古菌的丙二酰-辅 酶A还原酶一致，与野生型酶相比包括至少一个在下列位点中至少一个位点的突变：P111， L152, T154, L202, G203, D204, Y206, D207, K209, T210, T238, T239, D295, R318,其中在所述 位点自然生成的氨基酸被其它19种天然存在的蛋白氨基酸中的任意一种取代，即被丙氨 酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸， 亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或缬氨酸中 任意一种取代。
[0036] 在另一个方面，根据本发明生产2, 4-DHB方法的第三步中涉及DHB脱氢酶，特征在 于其将苹果酸-4-半醛转化成2, 4-DHB，所述酶在生物合成的途径中具有苹果酸-4-半醛还 原酶的活性。
[0037] 已经潜在具有DHB脱氢酶活性的候选DHB脱氢酶可以从作用于C3, C4,或C5化合 物的β-羟酸脱氢酶类中选择。
[0038] 根据本发明再进一步的方面，所述DHB脱氢酶可以是与β -羟酸脱氢酶在结构和 机制上相关的酶，如羟基丙二酸半醛还原酶，琥珀酸半醛还原酶，4-羟丁酸脱氢酶，丙二酸 半醛还原酶，甲基丁醛还原酶，锌型醇脱氢酶，L-苏氨酸-3-脱氢酶，肉桂醇脱氢酶，醇脱氢 酶或高丝氨酸还原酶。
[0039] 本发明也涉及使用以下酶将苹果酸-4-半醛转化成2, 4-DHB :甲基丁醛还原酶或 琥珀酸半醛还原酶（等同命名为4-羟基丁酸脱氢酶）、或醇脱氢酶。
[0040] 在本发明的另一具体方面，DHB脱氢酶与下述酶一致：酿酒酵母的甲基丁醛还原 酶（Yprl)、金属球菌的琥珀酸半醛还原酶、牙龈卟啉菌的4-羟基丁酸脱氢酶（4hbd)，大肠 杆菌的醇脱氢酶（YqhD)。
[0041] 在具体的实施方案中，所述甲基丁醛还原酶由SEQ ID No. 14表示，所述琥珀酸半 醛还原酶由SEQ ID No. 16表示，所述4-羟基丁酸脱氢酶由SEQ ID No. 187表示，所述醇脱 氢酶由SEQ ID No. 185表示。DHB脱氢酶的活性可以通过实施例3 (见"酶分析"）中描述 的酶测试测定。
[0042] 可以通过酶的至少一种突变增加 DHB脱氢酶对于苹果酸-4-半醛的亲和性，所述 突变增加了突变酶对苹果酸-4-半醛的活性和/或底物亲和性和/或其对天然底物的活性 或亲和性至少降低了两倍。
[0043] 根据本发明的DHB脱氢酶在具体方面上与金属球菌的琥珀酸半醛还原酶（SEQ ID No. 16) -致，与野生型酶相比包括至少一个在下列位点中至少一个位点的突变：S40, N43， H39T49, F85, Q108, L281和N305,其中在所述位点自然生成的氨基酸被其它19种天然存在 的蛋白氨基酸中的任意一种取代，即被丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷 氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸， 丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或缬氨酸中任意一种取代。
[0044] 如非排他性实施例中所示，金属球菌的琥珀酸半醛还原酶对（L)-苹果酸-4-半醛 的亲和性通过位点专一突变引入双突变H39R N43H，如SEQ ID No. 36表示的。本发明还包 含简单 H39R 突变（SEQ ID No. 32)和 N43H(SEQ ID No. 34)(实施例 5)。
[0045] DHB脱氢酶能够用于将苹果酸-4-半醛转化成2, 4-DHB，其构成了本发明的另一方 面。
[0046] 基因的核苷酸序列可以调整宿主生物的密码子用法，从而增加异源表达蛋白的产 量。这构成了本发明的进一步方面。
[0047] 编码金属球菌琥珀酸半醛还原酶H39R N43H (如SEQ ID No. 38所示核苷酸序列被 优化用于在大肠杆菌中表达的所述酶）的合成基因的合成也是本发明的进一步方面。
[0048] 在再进一步方面，本发明也涉及核苷酸，且更具体的涉及分离编码苹果酰-辅酶A 合成酶的核苷酸序列。
[0049] 在再进一步方面，本发明涉及分离编码苹果酰-辅酶A裂解酶的核苷酸序列，更具 体的由SEQ ID No. 2所示。
[0050] 在再进一步方面，本发明涉及分离编码苹果酰-辅酶A还原酶的核苷酸序列，更具 体的由 SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 11，或 SEQ ID No. 190 所示。
[0051] 在再进一步方面，本发明涉及分离编码如上所述DHB脱氢酶的核苷酸序列。
[0052] 在另一个方面，所述核苷酸由 SEQ ID No. 15，SEQ ID No. 17，SEQ ID No.37，SEQ ID No. 186 或 SEQ ID No. 188 所示。
[0053] 根据本发明，"核苷酸序列"是指以单或双链形式的DNA或RNA分子，优选是DNA分 子。这里使用的"分离DNA"是指并非天然形成的或原来存在在天然环境中而现在不再存在 的DNA，例如在嵌合基因中编码与其它调控因子有关的序列的DNA，转入到另一个宿主细胞 中的DNA，或与天然存在的DNA序列相比，具有不同核苷酸序列的人工的、合成的DNA序列。
[0054] 本发明也涉及嵌合基因，包括功能性相互连接的、在宿主生物中具有功能性的至 少一个启动子，编码本发明定义的苹果酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果 酰-辅酶A还原酶、丙二酰-辅酶A还原酶、琥珀酰-辅酶A还原酶或DHB脱氢酶活性体中 任意一种的多核苷酸，以及在相同宿主生物中具有功能性的终止子元件。首先，嵌合基因可 以包含的多种元件调节转录、翻译和蛋白质的形成，例如编码信号肽或转运肽序列的启动 子，或构建一个多腺苷酸化信号的终止子元件，以及，其次，多核苷酸编码蛋白质。"功能性 相互连接"是指所述嵌合基因的元件以下述方法相互连接，即这些元件中其中一个的功能 受到另个一的影响。举例来说，当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子功能性的连接 所述编码序列。根据本发明，能够使用本领域技术人员的熟知的技术实施嵌合基因的构建 和其多种元件的组装。构建嵌合基因的调控元件的选择主要取决于它们必须在其中发挥作 用的宿主生物，且本领域技术人员能够选择在给定的宿主生物中具有功能的调控元件。术 语"功能性"用来表示给定的宿主生物中能够发挥功能。
[0055] 根据本发明的嵌合基因可以包含的启动子是可构建或者可诱导的。举例来说，在 细菌中用于表达的启动子可以选自下述的启动子。对于在大肠杆菌中的表达，提及可以 由以下组成：lac，trp，lpp，phoA，recA，araBAD，prou，cst-1，tetA，cadA，nar，tac，trc， lpp-lac，Psyn，cspA，PL，PL-9G-50, PR-PL，T7，XPL-PT7, T3-lac，T5-lac，T4 基因 32， nprM-lac，VHb和蛋白质A启动子或Ptrp启动子（W0 99/64607)。对于在革兰氏阳性菌例 如棒状杆菌或链霉菌中的表达，提及可以由以下组成：PtipA或PS1和PS2 (FR91/09870)启 动子或其它在申请EP0629699A2中描述的那些。对于在酵母菌或真菌中的表达，提及可以 由以下组成：K.lactis PLAC4启动子或K.lactis Ppgk启动子（专利申请FR 91/05294)， Trichoderma tefl 或 cbhl 启动子（WO 94/04673)，Penicillium his，csl 或 apf 启动子 (TO 00/68401)和 Aspergillus gla 启动子。
[0056] 根据本发明，嵌合基因也可以包括位于启动子和编码序列之间的其它调控序列， 例如转录激活子（增强子）。
[0057] 同样地，本发明的嵌合基因在具体的实施方案中包括，至少在转录方向上功能性 连接：一个在宿主生物中具有功能的启动子调控序列，一个编码本发明的苹果酰-辅酶A合 成酶、和/或琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅酶A裂解酶、苹 果酰-辅酶A还原酶、和DHB脱氢酶，以及一个在所述宿主生物中具有功能的终止子调控序 列。
[0058] 本发明也涉及克隆和/或表达载体，包括本发明的嵌合基因或本发明的核苷酸序 列。根据本发明的该载体用于改造宿主生物和在这些微生物中表达任意一种下述酶：苹果 酰-辅酶A合成酶、和/或琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅 酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和/或DHB脱氢酶。这样的载体可以是质粒、粘粒、噬 菌体或病毒。优选的，根据本发明的转运载体是质粒。通常，这些载体的主要性质应该是在 宿主生物的细胞中能够保持其自身和自我复制物，尤其是凭借存在复制起点，在其中来表 达苹果酰-辅酶A合成酶、和/或琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果 酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和/或DHB脱氢酶的任意一种。为了使宿主生 物的转化稳定，载体也可以与基因组融为一体。这样载体的选择以及将本发明的嵌合基因 嵌入到这些载体中的技术属于本领域技术人员常识部分。有利地，本发明中使用的载体除 了本发明的嵌合基因外，也包含编码筛选标记的嵌合基因。这些筛选标记能够选择有效转 化的宿主生物，即那些与载体合并的微生物。根据本发明具体的实施方案，能够被转化的宿 主生物是细菌、酵母菌、真菌。在这些可以使用的筛选标记中，提及可以由用于抵抗抗生素 基因的标记，例如潮霉素转磷酸酶基因，组成。其它标记可以是补充营养缺陷型的基因，例 如pyrA，pyrB，pyrG，pyr4, arg4, argB和trpC基因，钥碟呤合成基因或乙酰胺酶基因。在 转化的细胞中也可以涉及编码易于识别酶例如GUS酶的基因，或编码颜料或调控颜料生产 的酶的基因。这样的筛选标记基因在专利申请W0 91/02071，W0 95/06128, W096/38567和 W0 97/04103中具体的描述。
[0059] 本发明也涉及转化的宿主生物，其包含至少一个根据本发明的嵌合基因，该嵌合 基因嵌入到其基因组中或在外部染色体遗传元件例如质粒上实施。在本发明更具体的方 面，该转化的宿主生物包括本发明编码多肽的核苷酸，所述的多肽具有苹果酰-辅酶A合成 酶活性、和/或琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶、和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活 性，或包括编码多肽核苷酸的嵌合基因，该多肽具有苹果酰-辅酶A合成酶活性、和/或琥 珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸辅酶A转移酶和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活性，或包括编码多肽 核苷酸的表达载体，该多肽具有苹果酰-辅酶A合成酶活性、和/或琥珀酰-辅酶A: (L)-苹 果酸辅酶A转移酶和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活性，和/或编码具有苹果酰-辅酶A还 原酶活性多肽的核苷酸，和/或编码具有苹果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸，或嵌合 基因包括编码具有苹果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸，或表达载体包括编码具有苹 果酰-辅酶A还原酶活性多肽的核苷酸，和/或编码具有DHB脱氢酶活性多肽的核苷酸，或 嵌合基因包括编码具有DHB脱氢酶活性多肽的核苷酸，或表达载体包括编码具有DHB脱氢 酶活性多肽的核苷酸。
[0060] 在宿主生物中异源表达酶的活性通常会受其溶解性差和内涵体形式的限制。因 此，本发明也涉及嵌合蛋白，其中功能性酶物理形式的融入其它蛋白质或多肽（等同命名 为融合蛋白），来增加在宿主生物中所述酶表达的活性。这样的融合蛋白是本领域已知 的，且通常选自下述非排他性例子：麦芽糖结合蛋白，Mbp，硫氧化还原蛋白，ThrX，谷胱甘 肽-S-转移酶，Gst，转录终止因子，NusA。
[0061] 术语"宿主生物"是指任何根据本发明将嵌合基因、核苷酸、或载体可以植入其中 来生产2, 4-DHB的低等单细胞微生物。优选的宿主生物是微生物，尤其是真菌，例如青霉 菌，曲霉菌和更优选黄曲霉菌，金孢子菌或木霉菌属，酵母菌，具体为肠杆菌、毕赤酵母或裂 殖酵母，最优选为酿酒酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母，杰丁毕赤 酵母，树干毕赤酵母或毕赤酵母，细菌，优选肠杆细菌、梭细菌、芽孢杆菌、链霉菌，链球菌， 甲基杆菌，和棒状杆菌，最优选为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌，丙酮丁醇梭 菌，甲基扭曲杆菌，或乳酸乳球菌。
[0062] 所述宿主生物可以是由糖（例如葡萄糖）天然过度生产苹果酸或琥珀酸的宿主 生物，或经工程化为由糖（例如葡萄糖）过度生产苹果酸或琥珀酸的宿主生物，且其中所 有的可能的膜转运蛋白已经被去除，该膜转运蛋白促进有机酸例如苹果酸、丙酮酸、琥珀酸 和延胡索酸的排出。宿主生物可以是经工程化来过度生产DHB的生物体，且其中所有的可 能的膜转运蛋白已经被去除，该膜转运蛋白促进有机酸例如苹果酸、丙酮酸、琥珀酸和延 胡索酸的排出。促进苹果酸或其它有机羧酸排出的通透酶例子有：来自粟酒裂殖酵母的 Mael (Camarasa 等人，2001) (Grobler 等人，1995)，来自枯草杆菌的 DctA(Groeneveld 等人， 2010)，来自大肠杆菌的Dct 1-4,来自啤酒酵母的Jenl (Akita等人，2000)。对于专家来讲， 也可能基于序列号识别大肠杆菌中的候选通透酶。这些构建将用于保持苹果酸或其它有机 羧酸在细胞内来使其有利于DHB的生产。
[0063] "转化的宿主生物"的表达用于表示宿主生物基因组中或在外部染色体遗传元件 例如质粒合并了根据本发明的至少一种嵌合基因，且因此在细胞内部或培养基中生产苹果 酰-辅酶A合成酶、苹果酰-辅酶A裂解酶、苹果酰-辅酶A还原酶、和/或DHB脱氢酶的 任意一种。为了获得根据本发明的宿主生物，本领域技术人员可以使用很多中已知的转化 方法。
[0064] 这些方法中的一种包括将要转化的宿主细胞与聚乙二醇（PEG)和依照本发明的 载体相接触。电穿孔是另外一种方法，其包括使要转化的细胞和本发明的载体经受电场。另 外的方法包括通过显微注射直接将载体注入细胞或组织。也可以使用"基因枪"方法。其 包含以其上吸附有本发明载体的微粒轰击细胞或组织（美国专利号4, 945, 050)。
[0065] 文献中描述了用于大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌的几种转化细菌的方法。可以使 用接合。对于革兰氏阳性菌，可以使用电穿孔，也可以使用原生质体转化，特别是对于链霉 菌属的细菌。
[0066] 文献中描述了几种转化真菌的方法。EP0260762中描述了用于曲霉菌的以PEG做 的原生质体转化，而W0 00/36120中描述了该方法对绳状青霉种的调整方案。通过限制性 酶介导整合，或REMI的转化也已知，使用农杆菌属细菌的原生质体转化同样已知。文献中 也描述了转化酵母的技术。
[0067] 在进一步方面，本发明涉及2, 4-DHB生产方法，其包括培养转化本发明微生物的 步骤。
[0068] 为生产DHB，各种碳水化合物可以被单独使用或者作为混合物使用，例如葡萄糖， 果糖，蔗糖，糖蜜，麦芽糖，赤糖糊，糖蜜，淀粉水解物（葡萄糖，寡糖），乳糖，麦芽糖，淀粉和 淀粉水解物，纤维素，纤维素水解物，甘油，乙酸和某些烃，油和脂肪如豆油，葵花籽油，花生 油和椰子油，以及脂肪酸，例如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸。这些物质可以被单独使用或作为 混合物使用。
[0069] 各种氮源可以被单独或作为混合物使用来进行商业或中试规模生产，包括无机化 合物如气态氨和氨水，无机酸或有机酸的铵盐，如硫酸铵，硝酸铵，磷酸铵，氯化铵，乙酸铵 和碳酸铵。此外，也可以使用天然含氮有机材料，如大豆水解物，大豆蛋白盐酸水解物（总 氮约7 % )，豆柏，豆饼水解物，玉米浆，酪蛋白水解物，酵母提取物，肉提取物，麦芽提取物， 尿素，蛋白胨和氨基酸。
[0070] 生产过程可以在有氧，厌氧和限制氧条件下进行。其可以作为分批补料过程或按 批次过程进行。
[0071] 可以通过在培养基中培养宿主生物来进行所述2, 4-DHB的生产，培养基中单独的 或者与能够确保生长的其他碳源一起加入了苹果酸（或者其他的有机酸如丙酮酸，琥珀 酸，或延胡索酸）。苹果酸（和其他有机酸）可以被直接加入，或者通过设计两阶段发酵过 程加入，两阶段发酵过程中，苹果酸（或其他有机酸）在第一过程阶段中由过量生产苹果酸 的微生物产生，而2, 4-DHB生产在随后的阶段中由本发明的宿主生物实现。
[0072] 产物的分离和纯化是非常重要的因素，其极大地影响整个过程的效率和产物成 本。产物回收的方法一般包括分别的细胞分离，以及产物纯化，浓缩和干燥步骤。
[0073] 细朐分离
[0074] 可以使用超滤和离心来从发酵培养基中分离细胞。高培养基粘度使得从发酵培养 基中分离细胞变得复杂。因此，我们可以加入添加剂如无机酸或碱的盐，或者加热培养液以 优化细胞分离。
[0075] 产物回收
[0076] 多种离子交换色谱方法可以用于在去除生物质之前或之后分离DHB。这些包括依 照其等电点使用初级阳离子交换树脂促进产物分离。通常，以溶液填充树脂，而随着洗脱液 pH值的增加（如通过加入氢氧化铵），保留的产物被单独洗脱。另外的可能性是以固定的 或仿移动的树脂床来使用离子交换树脂。可能需要联合不同的色谱步骤以达到足够的产品 纯度。与昂贵的结晶步骤相比上述纯化方法更经济，在终产物形式方面也提供额外的优势 和灵活性。
[0077] 产物浓缩和干燥
[0078] 纯化过程也可能包括干燥步骤，其可以包含适合的干燥工具如喷雾造粒机，喷雾 干燥器，筒式烘干机，回转烘干机，隧道式烘干机。可以通过使用多功能浓缩器或薄膜蒸发 器，以130°C蒸汽在减压下加热发酵液来获得浓缩DHB溶液。
[0079] 通过优化宿主生物代谢网络中的碳通量再分配和通过确保DHB途径三种酶NADPH 和ATP的充足供应，可以确保DHB的高效生产。通常通过缺失或者减少竞争的自然发酵途 径来促进碳通量引导进入所需的代谢途径以及NAD(P)H辅助因子的供应。非排他性的例子 为：
[0080] -通过阻碍乙醇的形成（通过缺失丙酮酸脱羧酶）来优化酿酒酵母中苹果酸的生 产（Zelle 等人，2008 ;Zelle 等人，2010)。
[0081] -通过阻碍乳酸的形成（如缺失IdhA)，乙酸的形成（如缺失pta，ackA)，乙醇的形 成（如缺失adhE)，甲酸的形成（如缺失pf 1B，focA)，丙酮酸的氧化（如缺失poxB)，苹果 酸的降解（如缺失maeB和scfA)，琥珀酸的形成（如缺失frdBC)，甲基乙二醛的形成（缺 失mgsA)来优化大肠杆菌中的琥拍酸或苹果酸生产（Jantama等人，2008a) (Jantama等人， 2008b) (Lin 等人，2005) (Zhang 等人，2011) (Sanchez 等人，2005a)。
[0082] -缺失磷酸葡萄糖异构酶pgi来开通穿过磷酸戊糖途径的碳通量，增加 NADPH对于 生物合成反应的可用度（Auriol等人,2011)。
[0083] 增加有机酸生产碳通量和ATP供应的另一种可能方式是磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)/丙酮酸/草酰乙酸的分支节点工程化（综述于（Sauer&Eikmanns 2005))。确保从 磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸碳通量增加的代谢工程化策略的非排他性例子为：
[0084] -通过阻碍丙酮酸激酶的作用和增加 PEP羧化激酶的活性来优化酿酒酵母中苹果 酸的生产（Zelle等人，2010)。
[0085] -通过增加天然或异种表达的PEP羧化酶，PEP羧化激酶，或丙酮酸羧化酶的活性， 来优化大肠杆菌中琥拍酸的生产（Millard等人，1996) (Sanchez等人，2005) (Zhang等人， 2011)。
[0086] 在使用PEP消耗磷酸转移酶系统（PTS)进行葡萄糖初始磷酸化步骤的大肠杆菌和 其他细菌中，增加有机酸生产碳通量和ATP供应的另一种可能方式为缺失PTS系统的基本 元件（例如ptsl或ptsG) (Lin等人，2005) (Zhang等人，2009)。在携带有PTS系统缺失突 变的突变体中，为确保进一步的葡萄糖摄入，必须保证另外的葡萄糖摄入系统（如GalP)的 活性。
[0087] 增加有机酸生产中进入所需途径的碳通量的另一种可能方式是柠檬酸和乙醛酸 循环工程化。非排他性例子为：
[0088] -通过增加异柠檬酸裂解酶活性（缺失转录阻遏子iclR)来优化大肠杆菌中琥珀 酸的生产（Lin 等人，2005) (Sanchez 等人，2005a)。
[0089] -通过缺失异柠檬酸脱氢酶，和/或琥珀酸脱氢酶来优化琥珀酸的生产（Lin等人， 2005)。
[0090] 增加苹果酸、乙醛酸和乙酰-辅酶A反应基质进入DHB生产途径的另一种可能方 式是稀释天冬氨酸转氨酶（aspC，tyrB)，延胡索酸酶（fumABC)，延胡索酸还原酶（frdBC)苹 果酸合成酶（aceB)和乙醒酸还原酶（ghrAB)。
[0091] 在另一个新陈代谢环境下，仅仅通过克雷伯氏循环和乙醛酸支路生产2, 4-DHB前 体苹果酸是可能的。这样的环境要求细胞基质和细胞膜限制的苹果酸脱氢酶mdh和mqo分 别缺失。该方法主要避免碳通量潜在的流失成天冬氨酸及其衍生物。
[0092] 增加2, 4-DHB生产中进入所需途径的碳通量的另一种可能方式是在生产生物中 表达适合的丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合成酶。大肠杆菌的天然丙酮酸脱氢酶和柠檬酸合成酶 被细胞内高NADH浓度抑制，这使得这些酶在厌氧条件下活力较低。在大肠杆菌中，对NADH 不敏感的丙酮酸脱氢酶突变体的表达导致了厌氧条件下乙酰-CoA的过量生产和发酵终产 物之间改变的碳通量再分配（乙酸，乳酸，乙醇，甲酸和丙酮酸）（Wang等人2010)。对NADH 不敏感的枯草芽孢杆菌柠檬酸合成酶的异种表达增加了工程化的大肠杆菌菌株中琥珀酸 的生产（Sanchez等人，2005)。结合上述突变，使用适合的丙酮酸脱氢酶和朽 1檬酸合成酶 (NADH敏感或不敏感的），能调整厌氧和有氧条件下乙醛酸与柠檬酸循环反应和发酵途径 之间的碳通量再分配。
[0093] 增加通过DHB途径的碳通量的另一种可能方式是缺失可能降解途径中间体苹果 酰-辅酶A，或4-苹果酸半醛的酶促反应。可能降解苹果酸半醛的候选酶是琥珀酸半醛脱 氢酶（sad，gabD)，以及其他能以末端醛基氧化短链和中链的碳链分子的脱氢酶。另外，已 知苹果酰-辅酶A可以被柠檬酸合成酶降解。
[0094] 增加宿主生物中2, 4-DHB产率的另一种可能方式是缺失降解DHB的代谢反 应。DHB是苹果酸酶的竞争性抑制物，因此，具有对该酶的活性位点的竞争性高亲和性 (Rognstad&Katz，1979)。因此，2, 4-DHB可以被其他酶识别并可能被降解。这些酶可以被识 别并从宿主生物中缺失。
[0095] 当2, 4-DHB生产是基于加入苹果酸或其他有机酸时，生产2, 4-DHB的微生物应该 功能性表达能促进苹果酸（或其他有机酸如丙酮酸，琥珀酸等）摄入的膜输送蛋白。
[0096] 本发明的转化的宿主生物可以进一步包括额外的合成DHB的途径，所述宿主生物 包括至少一个嵌合基因，该基因与基因组融为一体或在外部染色体遗传元件中实施，该嵌 合基因例如：编码苹果酸激酶的质粒或包含编码苹果酸激酶核苷酸的嵌合基因或包含编码 苹果酸激酶核苷酸的表达载体，和/或编码苹果酸半醛脱氢酶的核苷酸或包含编码苹果酸 半醛脱氢酶核苷酸的嵌合基因或包含编码苹果酸半醛脱氢酶核苷酸的表达载体，和/或编 码DHB脱氢酶的核苷酸、包含编码DHB脱氢酶核苷酸的嵌合基因或包含编码DHB脱氢酶核 苷酸的表达载体。所述酶在国际申请专利W0 2012/056318中描述。
[0097] 下面的实施例举例说明了本发明。这些实施例仅是为了举例说明的目的，而不应 被解释为以任何方式限制本发明的范围。

【专利附图】

【附图说明】
[0098] 图l(i)描述了将（L)-苹果酸、琥珀酰-辅酶A或乙醛酸转化为（L)-2, 4-二羟基 丁酸（2, 4-DHB)的反应流程。
[0099] 图2附图显示了（顶部图表）对苹果酸半醛的活性，（中间图表）对琥珀酸半醛 的活性，（底部图表）与野生型酶相比酶特异性的改变，通过对于苹果酸半醛和琥珀酸半醛 的突变体活性比除以对于苹果酸半醛和琥珀酸半醛的野生型活性比的对数表示。（正值表 示特异性改变偏向于苹果酸半醛）。
[0100] 图3DHB路径酶以不同的组合培育2mM乙酰-辅酶A、2mM乙醛酸、2mM NADPH后，色 谱图显示DHB的存在（反应1 :苹果酰-辅酶A裂解酶（lSOyg/mL Me-Mcl)，苹果酰-辅酶 A 还原酶（100yg/mL St-Mcr)，和苹果酸半醛还原酶（100yg/mL Ms-SSAred H39R N43H); 反应2 :与反应1相同但使用100 μ g/mL Pg-SucD的苹果酰-辅酶A还原酶；对照1 :与反 应1相同但不使用苹果酰-辅酶A还原酶；对照2 :与反应1相同但不使用苹果酸半醒还原 酶） 实施例
[0101] 实施例1 :苹果酰-辅酶A裂解酶活性的演示
[0102] 含有编码苹果酰-辅酶A裂解酶野生型基因的质粒的构建：在外链甲基杆菌 (Arps等人，1993)和荚膜红细菌（Meister等人，2005)中编码苹果酰-辅酶A裂解酶mcl基 因的DNA序列使用GENEius软件（Eurofins)优化用于在大肠杆菌中的表达。优化的序列通 过Eurofins MWGOPERO.N?合成，分别在起始密码子的上游限制性位点添加 Nhel和EcoRI 在终止密码子下游添加 mcl，这能够使用T4DNA连接酶（Biolabs)使合成DNA片段的克隆体 直接进入pET28a+载体（Novagen)。绑定产品转运入大肠杆菌DH5a细胞中扩充，且使用标 准基因协议（Sambrook等人，1989)分离质粒pET28-Mex-mcl (来自外链甲基杆菌表达苹果 酰-辅酶A裂解酶）和pET28-Rca-mcl (来自荚膜甲基球菌表达苹果酰-辅酶A裂解酶）。 表1中列出了利用mcl蛋白质序列和相应的天然和合成DNA序列的NCBI和Integrated Genomics著录信息。
[0103]

【权利要求】
1. 一种制备2, 4-二羟基丁酸（2, 4-DHB)的方法，其包括以下连续步骤： a) 第一步将苹果酸和/或琥珀酰-辅酶A和/或乙醛酸转化为苹果酰-辅酶A， b) 第二步将之前获得的苹果酰-辅酶A转化为苹果酸-4-半醛， c) 第三步用DHB脱氢酶将苹果酸-4-半醛转化为2, 4-DHB。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)经酶催化，该酶分别具有苹果酰-辅酶A 合成酶、琥珀酰-辅酶A: (L)-苹果酸-辅酶A转移酶和/或苹果酰-辅酶A裂解酶活性。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述酶由SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 193和SEQ ID No. 195中任意一个或其任意突变或片段所示。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中所述酶被由SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 194和 SEQ ID No. 196或其任意突变或片段定义的任意一种核苷酸编码。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)经具有苹果酰-辅酶A还原酶活性的 酶催化。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中通过酶的至少一个突变获得所述苹果酸半醛脱氢 酶，所述突变提高了突变酶对苹果酰-辅酶A的活性和/或底物的亲和性。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述苹果酰-辅酶A还原酶与野生型酶相比包 括在至少一个以下位点的至少一个突变：Pill，L152, T154, L202, G203, D204, Y206, D207， K209, T210, T238, T239, D295, R318,其中在所述位点自然占据的氨基酸被其它19种天然存 在的蛋白氨基酸的任意一种取代，即被丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷 氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸， 丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，或缬氨酸的任意一种取代。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述苹果酰-辅酶A还原酶由SEQ ID No. 202所 /_J、1 ο
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述酶被核苷酸SEQ ID No. 201编码。
10. 根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是丙二酰-辅酶A还原酶，或琥珀酰-辅 酶A还原酶。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述酶通过修饰具有丙二酰-辅酶A还原酶或 琥珀酰-辅酶A还原酶活性的酶获得。
12. 根据权利要求10或11所述的方法，其中所述酶由SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8,或 SEQ ID No. 191的任意一个或其任意突变或片段所示。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述酶被SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10,或SEQ ID No. 192定义的核苷酸中的任意一个或其任意突变或片段编码。
14. 根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤c)被具有DHB脱氢酶活性的 酶催化。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述酶是甲基丁醛还原酶、琥珀酸半醛还原酶、 4_羟基丁酸脱氢酶、或醇脱氢酶。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述酶由SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 16，SEQ ID No. 32, SEQ ID No. 34, SEQ ID No. 36, SEQ ID No. 187 或 SEQ ID No. 189 或其任意突变所 /_J、1 ο
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述酶被SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 33, SEQ ID No. 35, SEQ ID No. 37, SEQ ID No. 188, SEQ ID No. 190 定义的核苷酸中的任 意一个或其任意突变或片段编码。
18. 根据权利要求1-17任一项所述的方法，其中步骤a)，b)和c)通过异体表达至少 一种酶的经修饰微生物进行，该酶表现如步骤a)，b)和c)中描述的酶活性。
19. 根据权利要求1-17任一项所述的方法，其中步骤a)，b)和c)在相同的微生物中 进行。
20. -种用于提高2, 4-DHB生产的经修饰微生物，其中所述微生物表达的基因用于编 码酶，该酶具有的酶活性是催化权利要求1-17任一项中定义的步骤a)，b)和c)必须的。
21. 根据权利要求20所述的微生物，所述微生物是细菌，其优选为肠杆细菌、梭细菌、 芽孢杆菌、链霉菌，链球菌，甲基杆菌，和棒状杆菌，最优选为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨 酸棒状杆菌，丙酮丁醇梭菌，甲基扭曲杆菌，或乳酸乳球菌，或酵母菌，所述酵母菌优选酵母 科酵母，毕赤酵母，和裂殖酵母，最优选酿酒酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，马克斯 克鲁维酵母，杰丁毕赤酵母，树干毕赤酵母或毕赤酵母。
22. 根据权利要求20或21所述的微生物，其中至少一种酶活性的表达增强，该酶选自 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸羧化酶、异柠檬酸裂解酶，丙酮酸 羧化酶、和己糖转运体通透酶，和/或至少一种酶活性的表达降低，该酶选自乳酸脱氢酶、 醇脱氢酶、乙酸激酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸裂解酶、延胡索酸还原酶、 延胡索酸酶、2-氧戊二酸脱氢酶、丙酮酸激酶、苹果酸酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸-甲酸裂解酶、琥珀酸半醛脱氢酶、糖-运输磷酸 转移酶、天冬氨酸转氨酶、乙醛酸还原酶，苹果酸合成酶，或丙酮醛合成酶。
23. 根据权利要求22所述的微生物，所述微生物是大肠杆菌过度表达至少一种选自以 下的基因：大肠杆菌的PPc，pck，aceA，galP ;来自构建乳酸乳球菌的pycA，和/或缺失了至 少一种选自以下的基因：ldhA，adhE，ackA，pta，poxB，focA，pflB，sad，gabABC，sfcA，maeB， ppc，pykA，pykF，mgsA，frdABCD，sucAB，ptsl，ptsG，pgi，fumABC，aldA，lldD，iclR，aceB， aspC，ghrAB〇
24. -种2, 4-DHB的生产方法，包括以下步骤： -在适当的培养基中培养如权利要求15-18中任一权利要求所述的经修饰的微生物， -在所述培养基中回收2, 4-DHB。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述2, 4-DHB进一步纯化。
【文档编号】C12N9/02GK104254612SQ201380022158
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2012年4月26日
【发明者】托马斯·瓦尔特, 克莱芒蒂娜·德雷赛尔, 伊莲娜·科迪尔, 让-玛丽·弗朗索瓦 申请人:安迪苏法国联合股份有限公司