甘蔗杆状病毒(scbv)增强子及其在植物功能基因组学中的用途
【专利摘要】对新的增强子序列的鉴定在植物功能基因组学中具有重大的效用。已经鉴定了甘蔗杆状DNA病毒(SCBV)转录增强子。该增强子可以用于增加从基因启动子及在激活标签化实验中的转录速率。当将4列SCBV增强子置于玉米醇脱氢酶最小启动子截短形式的上游时，观察到转录中有10倍的增加。描述了使用SCBV转录增强子的方法，以及包含一个或多个该增强子拷贝的嵌合转录调节区、构建体、细胞、组织和微生物。
【专利说明】甘蔗杆状病毒（SCBV)增强子及其在植物功能基因组学中 的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年2月29日提交的美国临时专利申请No. 61/605, 147的权益， 将其通过提述完整并入本文。
[0003] 领域
[0004] 本公开涉及植物分子生物学和遗传工程学领域，并且具体地，涉及可用于调控 (例如增强）植物中基因表达和/或蛋白质生成的多核苷酸分子。
[0005] 共同研究协议的相关方
[0006] 本申请描述且要求保护基于Agrigenetics公司、Mycogen公司、Exelixis植物科 学公司、和Exelixis公司之间的联合研究协议开发的特定主题，其生效期为2007年9月4 曰。
[0007] 发明背景
[0008] -直以来都需要指导、控制或以其他方式调节可转录核酸（例如转基因）表达的 遗传调节元件，例如用在经遗传工程改造的生物体诸如植物中。遗传调节元件通常包括5' 非翻译序列诸如含有转录因子和RNA聚合酶结合位点（一个或多个）、增强子/沉默子元 件、TATA盒和CAAT盒的转录启动区，连同3'聚腺苷酸化序列、转录终止信号、翻译起始和 终止信号、剪接供体/受体序列等等。
[0009] 为了遗传工程学的目的，遗传调节元件通常包含在表达载体或其它经工程改造的 构建体中以调节可操作地连接于该调节元件的转基因的表达。以此种方式使用的启动子的 公知的例子是 CaMV35S 启动子（Nagy 等于：Biotechnology in plant science:relevance to agriculture in the eighties. Zaitlin等Academic Press, Orlando, 1985)、玉米泛素 启动子（Ubi ;Christensen&Quail, Transgenic Research 5:213, 1996)和Emu启动子（Last 等，Theor. Appl. Genet. 81581，1991)，不过还有许多其它启动子也是普通技术人员已知 的。类似地，已经从各种来源分离出用在遗传工程学中的增强子；这些包括花椰菜花叶病毒 (35S CaMV)增强子、玄参花叶病毒（FMV)增强子、花生褪绿条纹病花椰菜花叶病毒（PClSV) 增强子、或紫茉莉（mirabilis)花叶病毒（MMV)增强子。
[0010] 一直以来都需要鉴定出可以用来控制与其可操作地连接的序列（例如在异源核 酸分子诸如载体和其它经工程化改造的构建体中）的表达的遗传调节元件，诸如增强子 域。
[0011] 发明概述
[0012] 本公开描述了新的转录调节区，其包含增强子域和在该增强子域的增强控制下的 转录调节域。所述增强子域包含串联排列的多个（例如2-4个或更多个）拷贝的天然但以 前未得到识别的SCBV增强子。本公开的转录调节区（启动子）相比于缺乏该增强子域的 启动子提供了增强的转录。在一个实例中，公开了一种嵌合转录调节区，其包含显示在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中的SCBV增强子元件的一个或多个拷贝；和与其可操作地 连接的包含RNA聚合酶结合位点和mRNA启动位点的启动子，其中当目的核苷酸序列在所述 嵌合转录调节区的调节性控制下转录时，转录产物的量相比于用包含所述启动子、但不包 含所述SCBV增强子序列的嵌合转录调节区所获得的转录产物的量增加。
[0013] 还提供了包含所描述的转录调节区和待转录的DNA序列的DNA构建体。在一个实 例中，DNA构建体包含所公开的转录启动区，其可操作地连接于可转录的多核苷酸分子，后 者可操作地连接于3'转录终止多核苷酸分子。该DNA构建体为待转录DNA序列的增强的 转录提供条件。还公开了用所公开的构建体转化的转基因植物、植物细胞或组织（诸如双 子叶植物或单子叶植物、植物细胞或组织）。还提供了可以从所公开的转基因植物衍生的植 物种子、果实、叶、根、芽、花、插条、和其它可用在有性或无性繁殖中的繁殖材料、包含Fl杂 交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物及植物产物。本文中还提供了所公开的转 基因植物、植物细胞或组织的生成方法。
[0014] 从下面援引附图展开的详述中，能够更清楚地了解本公开的前述特征和其它特 征。
[0015] 附图简述
[0016] 图1显示了 SCBV启动子的序列（对应于GenBank登录号AJ277091. 1的位 置 6758-7596, "Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng"，通过提述将其以于2010年4月15日呈现在网上的形式完整并入本文）；该序列 也显示在SEQ ID NO: 1中。在本研究中界定的增强子序列从-222延伸至-503,并且在本图 中加有下划线（对应于SEQ ID NO: 1的位置337-位置618)。
[0017] 图2A和2B例示了对SCBV启动子的分析结果。图2A显示了与萤光素酶（LUC)报告 基因融合的SCBV启动子片段，所述各启动子片段含有自转录起始位点上游-839bp、-576bp 和-333bp至转录起始位点下游106bp的序列。图2B显示了用上文质粒和UBI::⑶S报告 构建体共转化的HiII细胞的LUC/GUS活性比的直方图。结果显示，含有自转录起始位点上 游_576bp起的序列的启动子片段所具有的活性是含有起始位点上游839bp的启动子片段 的60%。相比之下，含有自起始位点上游-333bp起的序列的启动子片段所具有的活性仅为 全长启动子（自转录起始位点上游-839bp起）的10%。由此可见,牵涉启动子活性的序列 位于-333bp的上游。
[0018] 图3例示了本文中描述的SCBV增强子元件增强了从玉米Adhl启动子的转录。将 从-503至-222的SCBV启动子序列的1、2和4个拷贝克隆到截短的玉米Adhl启动子上游， 融合至萤火虫萤光素酶基因。为了比较，将4个拷贝的MMV增强子序列、2个拷贝的MMV增 强子和2个拷贝的SCBV启动子克隆到截短的玉米Adhl启动子上游并融合到萤火虫萤光素 酶基因。将这些构建体与UBI::⑶S报告构建体一起轰击到玉米Hi-II悬浮细胞中。含有 1、2和4个拷贝的SCBV增强子的构建体的活性分别是没有任何增强子的截短的Adhl构建 体轰击的细胞的活性的超过5倍、6倍和10倍。4X MMV构建体的活性是截短的Adhl构建 体活性的2. 5倍，且2X MMV 2X SCBV构建体的活性是截短的Adhl构建体活性的6倍。
[0019] 图4显示相比于非转基因（W)对照植物，转基因（T)植物中4XSCBV整合位点附近 ("侧翼基因"）转录本的累积，其使用逆转录和PCR(RT-PCR)分析。显示管家基因 GAPDH的 水平以用于比较。4XSCBV增强子导致其整合处附近基因转录本的累积增加；这种在转录本 累积的增加可能缘于转录速率的增加。
[0020] 图5显示含有4XSCBV: :LfKCS3启动子融合物的PDAB3892,该启动子融合物用来驱 动拟南芥中的构巢曲霉酰基辅酶A △ 9去饱和酶转基因。
[0021] 图6显示含有LfKCS3启动子的PDAB1757,该启动子用来驱动拟南芥中的构巢曲霉 酰基辅酶A Λ 9去饱和酶转基因。
[0022] 图7显示含有Pv菜豆蛋白启动子的pDAB1759,该启动子用来驱动拟南芥中的构巢 曲霉酰基辅酶A Λ 9去饱和酶转基因。
[0023] 图8显示含有拟南芥泛素10启动子的pDAB9381，该启动子用来驱动拟南芥中的黄 色荧光蛋白转基因。
[0024] 图9显示含有构建体转基因插入的转基因植物的饱和脂肪酸表型降低的百分比。
[0025] 序列表
[0026] 如37C. F. R. 1. 822中定义的，对核苷酸碱基使用标准字母缩写且对氨基酸使用三 字母码来显示下面序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列。每个核酸序列仅显示了一条 链，但应理解对被展示的链的任何提述也包括其互补链。核酸序列（在序列表或本文其它 地方中）以标准的5' -3'方向呈现，蛋白质序列以标准的氨基（N)末端至羧基（C)末端方 向呈现。
[0027] SEQ ID NO: 1显示了 SCBV启动子的核酸序列（对应于GenBank登录号AJ277091. 1 的位置 6758_7596，"Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng"，通过提述将其在2010年4月15日呈现在网上的形式完整并入本文）。本文中描 述的增强子元件是从SEQ ID NO: 1的位置337至位置618。
[0028] SEQ ID NO: 2显示来自pDAB3892的构巢曲霉酰基辅酶A Λ 9去饱和酶植物转录单 元（PTU)的核酸序列。
[0029] SEQ ID NO: 3显示来自pDAB3892的膦丝菌素乙酰转移酶PTU的核酸序列。
[0030] SEQ ID NO:4显示来自pDAB1757的构巢曲霉酰基辅酶ΑΛ 9去饱和酶PTU的核酸 序列。
[0031] SEQ ID NO: 5显示来自pDAB1757的膦丝菌素乙酰转移酶PTU的核酸序列。
[0032] SEQ ID NO:6显示来自pDAB1759的构巢曲霉酰基辅酶ΑΛ 9去饱和酶PTU的核酸 序列。
[0033] SEQ ID NO: 7显示来自pDAB1759的膦丝菌素乙酰转移酶PTU的核酸序列。
[0034] SEQ ID NO:8显示来自pDAB9381的黄色荧光蛋白PTU的核酸序列。
[0035] SEQ ID NO:9显示来自pDAB9381的膦丝菌素乙酰转移酶PTU的核酸序列。
[0036] SEQ ID NO: 10显示使用水解探针测定来扩增pat进行分子确认的正向引物的核酸 序列。
[0037] SEQ ID NO: 11显示使用水解探针测定来扩增pat进行分子确认的反向引物的核酸 序列。
[0038] SEQ ID NO: 12显示使用水解探针测定来扩增pat进行分子确认的探针的核酸序 列。
[0039] SEQ ID NO: 13显示使用水解探针测定来扩增TAFFII进行分子确认的正向引物的 核酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 14显示使用水解探针测定来扩增TAFFII进行分子确认的反向引物的 核酸序列。
[0041] SEQ ID NO: 15显示使用水解探针测定来扩增TAFFII进行分子确认的探针的核酸 序列。
[0042] 发明详述
[0043] I.缩写
[0044] 3，UTR3'-非翻译区
[0045] 5，UTR5' -非翻译区
[0046] Adhl醇脱氢酶1
[0047] LfKCS 3Lesquerella fendleri KCS 启动子
[0048] asRNA 反义 RNA
[0049] cDNA 互补 DNA
[0050] dsRNA 双链 RNA
[0051] GAPDH甘油醛3-磷酸脱氢酶
[0052] KB千字节
[0053] kbp千喊基对
[0054] LUC萤光素酶
[0055] miRNA 微小 RNA
[0056] nt核苷酸
[0057] ORF开放阅读框
[0058] PCR聚合酶链式反应
[0059] PAT膦丝菌素乙酰转移酶
[0060] RT-PCR 逆转录及 PCR
[0061] SCBV甘鹿杆状病毒
[0062] siRNA 小干扰 RNA
[0063] ssRNA 单链 RNA
[0064] Tm热解链点
[0065] UTR非翻译区
[0066] II.术语
[0067] 除非另外指出，依照常规用法来使用技术术语。可以在以下出版物中发现分子 生物学中常见术语的定义：Benjamin Lewin, Genes V，由 Oxford University Press 出 版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew 等（编），The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (编),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0068] 为了帮助评估本发明的各种实施方案，提供了对特定术语的下列解释：
[0069] 5'和/或3' ：称核酸分子（诸如DNA和RNA)具有"5'端"和"3'端"，因为将单 核苷酸以使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸根经由磷酸二酯键以某一方向附着于其邻位 的3'氧的方式反应来生成多核苷酸。因此，当多核苷酸一端的5'磷酸未连接于单核苷酸 戊糖环的3'氧时，将其称为"5'端"。当多核苷酸另一端的3'氧未连接于另一单核苷酸戊 糖环的5'磷酸时，将其称为"3'端"。不过内部核酸序列也可以称为具有5'端和3'端，尽 管一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸根附着于其邻位的3'氧。
[0070] 在线性或环状核酸分子中，离散的内部元件被称为"下游"或3'元件的"上游"或 5'端。对于DNA，该术语反映了转录沿着DNA链以5' -3'方向进行。指导所连接基因的转 录的启动子和增强子元件一般位于编码区的5'端或上游。不过，增强子元件即使位于启动 子元件和编码区的3'端也可以施加其影响。转录终止和多聚腺苷酸化信号位于编码区的 3'端或下游。
[0071] 农艺性状：植物的属性，所述属性包括但不限于，植物形态学、生理学、生长和发 育、产量、营养增加、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐受性，都是农艺性状。"改善的农艺性 状"指在农艺性状中可测量的改进，所述农艺性状包括但不限于产量增加，包括在无胁迫条 件下的产量增加和环境胁迫条件下的产量增加。胁迫条件可以包括，例如干旱、阴蔽、真菌 性疾病、病毒性疾病、细菌性疾病、昆虫侵袭、线虫侵袭、冷温暴露、热暴露、渗透胁迫、减少 的氮养分可得性、减少的磷营养可得性和高植物密度。"产量"可以受到许多特性影响，包 括但不限于，植物高度、荚果数目、荚果在植物上的位置、节间数目、荚果破碎的发生率、籽 粒大小、结瘤和氮固定的效率、营养物同化的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植 物体系结构、对倒伏的抗性、种子萌发百分比、幼苗活力、和幼态性状。产量还可以受到下列 因素的影响：萌发（包括在胁迫条件下的萌发）效率、生长速率（包括在胁迫条件下的生长 速率）、穗数目、每穗的种子数目、种子大小、种子组成（淀粉、油、蛋白质）和种子填充的属 性。增加的产量可能起因于对关键的生物化学化合物诸如氮、磷和碳水化合物的改善的利 用，或起因于对环境胁迫诸如冷、热、干旱、盐、和害虫或病原体攻击的改善的应答。在本公 开中使用的重组DNA也可以用于提供这样一种植物，其具有改善的生长和发育，并且作为 植物生长调节物的经修饰的表达或对细胞周期或光合作用途径进行修饰的结果，具有最终 增加的产量。农艺性状以及在植物中改变这类性状的其他例子已在本文中提供并且/或者 会被本领域中的普通技术人员认识到。
[0072] 改变：如本文中使用的这个术语，多核苷酸（例如由本发明的核酸编码的多肽）中 的改变包含多核苷酸序列中的任何缺失、插入和点突变。在此定义中包含对编码多肽的基 因组DNA序列的改变。类似地，术语"改变"可以用于指多肽序列中的缺失、插入和其它突 变。
[0073] 改变生成或表达水平：相比于生成或表达的对照水平，变化（通过增加或降低）核 酸分子或氨基酸分子（例如811?嫩、1^1?嫩、1111?嫩、基因、多肽、肽）的生成或表达水平。
[0074] 扩增：当用于指核酸时，它指增加样品或标本中核酸分子拷贝数的技术。扩增的 一个例子是聚合酶链式反应，其中使从受试者收集的生物学样品与一对寡核苷酸引物在允 许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下接触。所述引物在合适的条件下延伸，与模板解 离，然后重新退火、延伸并解离以扩增核酸的拷贝数。使用标准技术，可以通过电泳、限制 内切酶切割样式、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序，来表征体外扩增的产物。体外 扩增技术的其它例子包括链置换扩增（参见美国专利5, 744, 311);无转录等温扩增（参 见美国专利6, 033, 881);修复链反应扩增（参见WO 90/01069);连接酶链反应扩增（参 见EP-A-320308);缺口填充连接酶链反应扩增（参见美国专利 5,427,930);偶联的连接 酶检测和PCR(参见美国专利6, 027, 889);和NASBA?无 RNA转录扩增（参见美国专利 6, 025, 134)。
[0075] 反义、有义和反基因：DNA具有两条反向平行链，称为正链的5' 一 3'链，和称为负 链的3' 一 5'链。由于RNA聚合酶以5' 一 3'方向添加核酸，DNA的负链在转录期间充当 RNA的模板。由此，RNA转录本将具有与负链互补并等同于正链（除了 U被T取代）的序 列。
[0076] 反义分子是与RNA或DNA的正链特异性可杂交或特异性互补的分子。有义分子是 与DNA的负链特异性可杂交或特异性互补的分子。反基因分子是针对DNA靶物的反义或有 义分子。反义RNA (asRNA)是与有义（编码的）核酸分子互补的RNA分子。
[0077] 反义抑制：该术语指一类基于基因表达（例如宿主细胞基因组或病原体诸如病毒 的基因组的表达）的细胞质、细胞核或细胞器抑制的基因调节，所述抑制是由于细胞中与 所翻译的mRNA的至少一部分互补的RNA分子的存在。
[0078] cDNA(互补DNA):缺少内部非编码区段（内含子）和转录调节序列的DNA片段。 cDNA还可以含有负责相应RNA分子中翻译控制的非翻译区（UTRs)。通常在实验室中通过 自细胞或其它样品所提取的信使RNA的逆转录来合成cDNA。
[0079] 嵌合的或嵌合体：两个或更多个不同的多核苷酸或多肽分子部分的融合的产物。 例如，短语"嵌合序列"和"嵌合基因"指自至少两个异源部分衍生的核苷酸序列。嵌合序 列可以包含DNA或RNA。
[0080] 嵌合转录调节区：一组指导与其可操作地连接的核酸的转录的核酸控制或调节序 列，该组是由不同的多核苷酸来源装配而成。例如，如本文中描述的嵌合转录调节区可以通 过对已知的启动子或其它多核苷酸分子的操作而生成。嵌合转录调节区可以将一种或多种 增强子域与一种或多种启动子组合，例如，通过将第一天然启动子的异源增强子域与具有 其自身调节元件的部分或完整集合的第二启动子融合物。本公开例示地提供了这类嵌合转 录调节区，其含有融合（即可操作地连接）至植物中有活性的启动子的至少一个SCBV增强 子域。
[0081] 构建体：自任意来源衍生的能够进行基因组整合或自主复制的任何重组多核苷酸 分子，诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体、或线性或环状的单链或双 链DNA或RNA多核苷酸分子，其包含其中已经可操作地连接一种或多种可转录的多核苷酸 分子的多核苷酸分子。
[0082] 对照植物：不含有赋予（例如）转基因植物中增强或改变的农艺性状的重组DNA 的植物，例如在为了鉴定转基因植物中增强或改变的农艺性状时，它被用作比较的基线。合 适的对照植物可以是用于生成转基因植物的亲本系的非转基因植物，或至少对于所检查的 特定性状为非转基因的植物（换言之，对照植物可能经过工程改造而含有其它异源序列或 重组DNA分子）。由此，对照植物在一些情况下可以是包含空载体或标志基因，但不含有测 试植物中的重组DNA，或不含有测试植物中的全部重组DNA的转基因植物品系。
[0083] 共抑制：与内源基因具有实质同源性的外来（异源）基因的表达，其产生对该外来 基因和内源基因两者的表达的抑制。
[0084] DNA(脱氧核糖核酸）：DNA是包含大多数生物体（一些病毒具有包含核糖核酸 (RNA)的基因）的遗传材料的长链聚合物。DNA聚合物中的重复单元是4种不同的核苷酸， 其中每一种都包含结合至附着有磷酸根基团的脱氧核糖的4种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧 啶和胸腺嘧啶之一。核苷酸的三联体（称为密码子）编码多肽中的每个氨基酸或终止信号。 术语"密码子"也用于DNA序列所转录的mRNA中的3个核苷酸的相应的（以及互补的）序 列。
[0085] 除非另外说明，任何对DNA分子的提述都包含该DNA分子的反向互补体。除了在 本文中需要单链性的情况外，虽然书面上仅描述了 DNA分子的一条链，但涵盖了双链DNA分 子的两条链。
[0086] 去饱和酶：如本文中使用的术语"去饱和酶"指可以使一种或多种脂肪酸去饱和 (即，导入双键）以生成感兴趣的脂肪酸或前体的多肽。植物可溶性脂肪酸去饱和酶可以区 域特异性方式（regiospecifically)将双键导入饱和的酰基ACP底物中。酰基CoA去饱和 酶以区域特异性方式将双键导入饱和的脂肪酰基辅酶A底物中。该反应涉及通过二电子还 原的二铁中心的分子氧的活化，该二铁中心由形成去饱和酶体系结构中心的四螺旋束进行 配位。在一些实施方案中特别感兴趣的是酰基辅酶ΑΛ 9去饱和酶。
[0087] 脂肪酸：如本文中使用的术语"脂肪酸"指具有不同链长例如从大约C12到C22的 长链脂肪酸（链烷酸），不过更长或更短链长的脂肪酸也是已知的。脂肪酸的结构由符号 x:yAz表示，其中"X"为特定脂肪酸中的碳（C)原子总数，并且"y"为在从该脂肪酸的羧基 端计数的位置" z "的碳链中的双键数目。
[0088] 编码：如果一种多核苷酸分子在其天然状态或当通过本领域中技术人员已知的方 法对其进行操作时，可以被转录生成用于多肽或其片段的mRNA和/或翻译生成多肽或其片 段，则称该多核苷酸编码该多肽。反义链是这类核酸的互补体，并且可以从其推导出编码序 列。
[0089] 增强子域：一种顺式作用的转录调节元件（又称为顺式元件），其赋予对基因表达 的总体控制的一个方面。增强子域可以起着结合转录因子（其为调节转录的反式作用蛋白 因子）的作用。一些增强子域结合超过一种转录因子，并且转录因子可以与超过一种增强 子域以不同的亲和力相互作用。可以通过许多技术来鉴定增强子域，包括缺失分析（从启 动子的5'端或内部删除一个或多个核苷酸）；使用DNase I足迹法的DNA结合蛋白分析、甲 基化干扰、电泳迁移率改变测定、通过连接介导的PCR的体内基因组足迹法、和其它常规测 定；或通过使用常规的DNA序列比较方法与已知的顺式元件基序进行DNA序列比较。可以 对增强子域的精细结构进行进一步研究，其通过对一个或多个核苷酸的诱变（或取代）或 通过其它常规方法。可以通过化学合成或通过从包含这类元件的启动子分离来获得增强子 域，并且可以加以额外的侧翼核苷酸来合成它们，所述侧翼核苷酸含有有用的限制酶位点 来协助后续操作。
[0090] (基因）表达：DNA分子到转录的RNA分子的转录。更一般地，将基因的编码信息 转换成在细胞中存在且运行的结构的过程。表达的基因包括那些笠录成πιΜΔ然后翻译成 蛋白质的，以及那些转录成_但不翻译成蛋白质的（例如siRNA、转运RNA和核糖体RNA)。 由此，靶序列（诸如基因或基因的启动子区）的表达可能导致mRNA、蛋白质或两者的表达。 可以抑制或增强（降低或增加）靶序列的表达。可以将基因表达描述为与时间、空间、发育 或形态学性质以及定量或定性指征有关。
[0091] 基因调节活性：多核苷酸影响可操作连接的、可转录或可翻译的多核苷酸分子的 转录或翻译的能力。分离的具有基因调节活性的多核苷酸分子可以提供可操作连接的、可 转录的多核苷酸分子的时间或空间的表达、或调控其表达水平和速率。分离的具有基因调 节活性的多核苷酸分子可以包含启动子、内含子、前导序列或3'转录终止区。
[0092] 基因沉默：基因沉默指由于但不限于在基因组（DNA)水平上的效应（诸如染色质 重构），或经由对转录本稳定性或翻译的影响在转录后水平上的效应所导致的基因表达的 缺乏（或降低）。目前的证据表明RNA干扰（RNAi)是牵涉转录和转录后基因沉默的主要过 程。
[0093] 由于RNAi在转录和/或转录后水平上施加其影响，据信RNAi可以用于特异性地 抑制来自同一基因的可变转录本。
[0094] 异源的：一种类型的序列，其通常（例如在野生型序列中）不在另一序列邻近处 发现。在一个实施方案中，该序列来自与另一序列不同的遗传来源，诸如病毒或生物体或物 种。
[0095] 杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键杂交，所述氢键包括 Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。一般而言，核酸由含氮碱基组成，所述碱 基为嘧啶（胞嘧啶（C)、尿嘧啶（U)和胸腺嘧啶（T))或嘌呤（腺嘌呤（A)和鸟嘌呤（G))。 这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶对嘌呤的键合被称为碱基配对。更具 体地，A会与T或U键合，而G会与C键合。在RNA分子中，G还会与U键合。互补指在两条 不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基互补。
[0096] 导致特定严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列 的组成和长度而变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度（特别是Na+浓度） 会决定杂交的严格性。关于得到特定严格程度所需要的杂交条件的计算由Sambrook等 (编），Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989，第 9 章和第 11 章论述，其通过提述并入 本文。
[0097] 以下是一组例示性的杂交条件，且并不意图为限制的。
[0098] 非常高的严格件（检测出具有90%序列同一件的序歹Il )
[0099] 杂交：5x SSC在65°C达16小时
[0100] 清洗两次：2x SSC各在室温（RT)达15分钟
[0101] 清洗两次：0· 5x SSC各在65°C达20分钟
[0102] 高严格件（检测Hi具有80%序列同一件或审高的序歹Il )
[0103] 杂交：5x-6x SSC 在 65°C -70°C达 16-20 小时
[0104] 清洗两次：2x SSC各在RT达5-20分钟
[0105] 清洗两次：lx SSC各在55°C -70°C达30分钟
[0106] 低严格件（检测出具有轺讨50%序列同一件的序列）
[0107] 杂交：6x SSC 在 RT 至 55°C达 16-20 小时
[0108] 清洗至少两次：2x-3x SSC各在RT至55 °C达20-30分钟。
[0109] 处于顺式：指示两条序列处于RNA或DNA的同一片段上。
[0110] 处于反式：指示两条序列处于RNA或DNA的不同片段上。
[0111] 工业用农作物：其生长主要供人或动物消耗，或用在工业过程（例如作为用于制 造的脂肪酸的来源或用于生产醇的糖的来源）中的农作物。会理解的是，在许多情况中可 以消耗植物或从该植物生成的产物（例如甜料、油、面粉或粗磨粉（meal));由此，工业用农 作物的一个子集是食物农作物。食物农作物的例子包括但不限于，玉米/谷物、大豆、稻、小 麦、油菜（oilseed rape)、棉花、燕麦、大麦和马铃薯植物。在本文中列出了工业用农作物 (包含食物农作物）的其它例子。
[0112] 干扰或抑制（靶序列的表达）：该短语指小RNA (诸如siRNA或miRNA)或其它分子 可测量地降低携带靶序列的分子的表达和/或稳定性的能力。靶序列可以包括DNA序列， 诸如基因或基因的启动子区，或RNA序列，诸如mRNA。"干扰或抑制"表达涵盖了基因或序列 的终产物例如编码的蛋白质或受靶序列影响的蛋白质、核酸、其它生物分子的表达或功能、 或生物学功能的降低，并且由此包括mRNA转录本或其它靶序列的量或寿命的降低。在一些 实施方案中，小RNA或其它分子指引着染色质修饰，其抑制靶序列的表达。将该短语理解为 是相对的，且并不需要对序列的绝对抑制（阻抑）。因此，在某些实施方案中，干扰或抑制靶 序列的表达需要的是，随着小RNA或其它分子（诸如编码一种或多种小RNA的载体或其它 构建体）的应用，该序列以比应用前低至少5%、低至少10%、低至少15%、低至少20%、低 至少25%、或甚至降低了更多的水平表达。因此，在一些特定的实施方案中，小RNA或其它 分子的应用使靶序列的表达降低了约30 %、约40 %、约50 %、约60 %、或更多。在特定的实 例中，在小RNA或其它分子特别有效的情况下，表达降低了 70%、80%、85%、90%、95%、或 甚至更多。
[0113] 分离的："分离的"生物学组分（诸如核酸、肽或蛋白质）是已经从该组分所天然 存在的生物体细胞中的其它生物学组分（例如其它染色体和染色体外的DNA和RNA、和蛋白 质）实质性分开的、分开产生的、或纯化出来的。因此，已经"分离的"核酸、肽和蛋白质包 含通过标准的纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制 备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。
[0114] 代谢组：单一的生物体、样品、组织、细胞或其它分开的任意部分中存在的相对低 分子量分子（代谢物）的全数。举例而言，代谢组可以包括代谢中间物、激素和其它信号传 导分子和次级代谢物。代表性的代谢组包括在生物学样品诸如植物、植物部分、或植物样 品、或其悬浮液或提取物中发现的代谢物的全数。这类分子的例子包括但不限于：酸和有 关化合物；单、双和三羧酸（饱和的、不饱和的、脂肪族和环状的、芳基的、烷芳基的）；醛酸、 酮酸；内酯形式；赤霉素；脱落酸；醇、多羟基化合物、衍生物和有关化合物；乙醇、苯甲醇、 甲醇；丙二醇、甘油、叶绿醇；肌醇、糠醇、薄荷醇；醛、酮、醌、衍生物和有关化合物；乙醛、丁 醛、苯甲醛、丙烯醛、糠醛、乙二醛；丙酮、丁酮；蒽醌；碳水化合物；单糖、二糖、三糖；生物 碱、胺和其它碱；吡啶（包括烟碱酸、烟酰胺）；嘧啶（包括胞嘧啶、胸腺嘧啶）；嘌呤（包括 鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤/次黄嘌呤、细胞分裂素（kinetin));吡咯；喹啉（包括异喹啉）；吗 啡喃、托烷、cinchonan ;核苷酸、寡核苷酸、衍生物和有关化合物；鸟苷、胞苷、腺苷、胸苷、 肌苷；氨基酸、寡肽、衍生物和有关化合物；酯；酚和有关化合物；杂环化合物和衍生物；批 咯、四吡咯（类咕啉和卟吩/卟啉，有或无金属离子）；黄酮类化合物；喷哚；脂类（包括脂 肪酸和甘油三酯）、衍生物和有关化合物；类胡萝卜素、八氢番茄红素；以及固醇、类异戊二 烯，包括廠（terpene)。
[0115] 微小RNA (miRNA):小的非编码RNA基因产物，长度约21个核苷酸且发现于各种生 物体包括动物和植物中。miRNA在结构上类似于siRNA，但它们是自miRNA基因衍生的高度 组织化的、形成折回的前体转录本产生的。miRNA基因的初始转录本形成发夹结构，其由多 域RNAseIII样的核酸酶DICER和DROSHA(动物中）或DICER-LIKE1 (DCLl ;植物中）加工 以得到miRNA双链体。成熟的miRNA在双链体解旋后被并入到RISC复合物中。植物miRNA 与其RNA靶物以完美或近乎完美的互补性相互作用。
[0116] 核苷酸：术语核苷酸包括但不限于，包含连接至糖的碱基的单体，诸如嘧啶、嘌呤 或其合成的类似物，或者包含连接至氨基酸的碱基的单体，如在肽核酸（PNA)中的。核苷酸 是寡核苷酸/多核苷酸中的一种单体。核苷酸序列指寡核苷酸/多核苷酸中的碱基序列。
[0117] DNA的主要核苷酸是脱氧腺苷5'-三磷酸（dATP或A)、脱氧鸟苷5'-三磷酸（dGTP 或G)、脱氧胞苷5' -三磷酸（dCTP或C)、和脱氧胸苷5' -三磷酸（dTTP或T)。RNA的主要 核苷酸是腺苷5' -三磷酸（ATP或A)、鸟苷5' -三磷酸（GTP或G)、胞苷5' -三磷酸（CTP 或C)、和尿苷5' -三磷酸（UTP或U)。肌苷也是可以整合到DNA或RNA中的核苷酸中的一 种碱基（分别为dITP或ITP)。
[0118] 产油物种（植物的）：在特定器官中（主要在种子中）产生并储存三酰甘油的 植物物种。这类物种包括但不限于，大豆（Glycine max)、油菜籽和油菜（诸如Brassica napus、Brassica rapa 和 Brassica campestris)、向日葵(Helianthus annus)、棉花 (Gossypium hirsutum)、玉米（玉蜀黍(Zea mays))、可可(Theobroina cacao)、红花 (Carthamus tinctorius)、油椰(Elaeis guineensis)、椰树(Cocos nucifera)、亚麻 (Linum usitatissimuin)、菌麻（Ricinus commiunis)和花生（Arachis hypogaea) 〇
[0119] 寡核苷酸：寡核苷酸是通过磷酸二酯键结合的、长度介于约6-约300个核苷酸之 间的多个核苷酸。寡核苷酸类似物指发挥着类似于寡核苷酸的功能但具有非天然存在部分 的化合物。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，诸如改变的糖部分或糖间 连接，诸如硫代磷酸寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能性类似物可以结合RNA或 DNA。
[0120] 可操作地连接：该术语指组件特别是核苷酸序列的并置，从而使组件的正常功能 可以得到实施。由此，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序 列与第二核酸序列是可操作地连接的。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则该启 动子与该编码序列是可操作地连接的。一般地，可操作地连接的DNA序列是连续的，且在必 须连接两个蛋白质编码区时，可操作地连接的DNA序列位于同一阅读框中。"可操作地连接" 于调节序列的编码序列指核苷酸序列的一种配置，其中编码序列可以在该调节序列的调节 性控制（例如转录和/或翻译控制）下表达。
[0121] ORF(开放阅读框）：编码氨基酸而无终止密码子的一系列核苷酸三联体（密码 子）。这些序列通常可翻译成肽。
[0122] 百分比序列同一性：当将参照（"查询"）多核苷酸分子的线性多核苷酸序列与 测试（"受试"）多核苷酸分子（或其互补链）进行最佳联配（具有合适的核苷酸插入、 缺失、或缺口，其总共少于沿比较窗口参照序列的20% )时，前者与后者相比其中等同核 苷酸的百分比。用于对齐比较窗口的最佳序列比对是本领域中技术人员公知的，并且可 以使用工具来进行，诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的 同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法。优选地，利用这些算法的计算 机化执行诸如 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA(作为 GCG? Wisconsin 包 ? (Accelrys Inc.，Burlington, Mass.)的部分可获）来实施这类比较。测试序列和参照序列对齐区段的 "同一性分数"是两条对齐序列间共有的等同组分数目除以参照序列区段中的总组分数目 (即完整的参照序列或参照序列的较小的限定部分）。百分比序列同一性由同一性分数乘 以100代表。一个或多个多核苷酸序列可以与全长多核苷酸序列或其部分比较，或与更长 的多核苷酸序列比较。实质性百分比序列同一性是至少约80%的序列同一性、至少约90% 的序列同一性、或甚至更高的序列同一性，诸如约98%或约99%的序列同一性。
[0123] 植物：任何植物或其后代。该术语还包括植物的部分，包含种子、插条、块茎、果实、 花等。在各个实施方案中，该术语植物指栽植的植物物种，诸如玉米/谷物、棉花、油菜、向 日葵、大豆、高粱、苜蓿、小麦、稻、生成果实和蔬菜的植物、以及草坪和观赏性植物物种。如 本文中使用的，术语植物细胞指植物的结构和生理单元，其由原生质体和周围细胞壁组成。 如本文中使用的，术语植物器官指植物的独特且明显分化的部分，诸如根、茎、叶或胚。
[0124] 更一般地，术语植物组织指在植物体内或培养物中的任何植物组织。该术语包括 完整的植物、植物细胞、植物器官、原生质体、细胞培养物或任何组织成结构和功能性单元 的植物细胞组。
[0125] 多核苷酸分子：来源于基因组或合成的单链或双链DNA或RNA ;即分别的脱氧核糖 核苷酸或核糖核苷酸碱基的聚合物，其从5'端（上游）向3'端（下游）阅读。
[0126] 多肽分子：一种聚合物，其中的单体是通过酰胺键结合在一起的氨基酸残基。当氨 基酸是α -氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，
[0127] 优选L-异构体。如用于本文的，术语多肽或蛋白质涵盖任何氨基酸序列且包括经 修饰的序列诸如糖蛋白。术语多肽特定地意图涵盖天然存在的蛋白质以及那些重组或合成 生成的。
[0128] 转录后基因沉默（PTGS):-种基因沉默形式，其中在转录后发生抑制机制。这可 能导致特定RNA祀物的稳定态水平降低或对翻译的抑制（Tuschl, ChemBiochem, 2:239-245 ，2001)。在文献中，术语RNA干扰（RNAi)和转录后共抑制经常用于指示转录后的基因沉默。
[0129] 启动子：通过识别并结合例如RNA聚合酶II和其它蛋白质（反式作用转录因子） 来启动转录，指导核酸转录的一组核酸控制序列。启动子包括在转录起始位点附近的必要 核酸序列，诸如在聚合酶II型启动子情况下的TATA元件。在最小程度上，启动子通常包括 至少一个RNA聚合酶结合位点且还可以包括一个或多个转录因子结合位点，其应答转录因 子的占据而调控转录。在本文中描述了启动子的代表性例子（和可以装配以产生启动子的 元件）。可以通过启动子的时间、空间、或发育表达模式对其进行定义。
[0130] 植物启动子是在植物细胞中有功能的天然或非天然的启动子。
[0131] 组织特异性、受发育调节的启动子包括-伴大豆球蛋白7Sa启动子和种子特异性 启动子。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子包括来自参与油料种子中脂肪 酸生物合成的蛋白质的启动子和来自植物贮藏蛋白的启动子。此类启动子的实例包括来自 诸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰ACP去饱和 酶、和油质蛋白的可转录核酸分子序列的5'调节区。组织特异性启动子的另一个实例是凝 集素启动子，其对于种子组织是特异性的。
[0132] 蛋白质：由基因表达且由氨基酸构成的生物学分子，例如多肽。
[0133] 原生质体：分离的没有细胞壁的植物细胞，其具有被转化和/或再生成细胞培养 物或全植物的潜力。
[0134] 纯化的：术语"纯化的"不要求绝对纯度，而意图是一个相对的术语。因此，例如纯 化的融合蛋白制备物是其中融合蛋白相比于其生成环境中（例如在细胞中或在生化反应 室中）的蛋白质更富集的。优选地，纯化融合蛋白的制备物从而使该融合蛋白代表制备物 总蛋白含量的至少50%。
[0135] 重组：重组核酸分子具有非天然存在的序列或通过将两个分开的其它序列区段人 工组合而产生的序列。经常通过化学合成，或者更普遍地，通过对分离的核酸区段的人工操 作（例如通过遗传工程改造技术）来完成该人工组合。
[0136] 类似地，重组蛋白是由重组核酸分子编码的重组蛋白质。
[0137] 可调节的启动子：其活性受到某介质（agent)调节（直接或间接地）的启动子，所 述介质诸如转录因子、化学化合物、环境条件或核酸分子。
[0138] 调节基因表达：通过增加或降低影响基因表达的介质的表达、生成或活性来控制 基因表达的过程。所述介质可以是蛋白质诸如转录因子，或者是核酸分子诸如miRNA或 siRNA分子，当与基因或其上游调节序列或由该基因编码的mRNA接触时，其增加或降低基 因表达。
[0139] 调节性序列或元件：这些术语一般指一类多核苷酸分子（诸如DNA分子，具有DNA 序列），其影响或控制可操作地连接的、可转录的多核苷酸分子的转录或翻译及由此的基因 表达。该术语包括启动子、增强子、前导区、内含子、基因座控制区、边界元件/绝缘子、沉默 子、基质附着区（也称为支架附着区）、阻遏子、转录终止子（又称为转录终止区）、复制起 点、着丝粒、和减数分裂重组热点。启动子是在基因5'端附近的DNA序列，其充当RNA聚合 酶的结合位点，并且从此处启动转录。增强子是升高从启动子的转录水平的控制元件，其通 常不依赖于增强子的取向或与启动子间的距离。基因座控制区（LCR)赋予其所连接的基因 组织特异性的或在时间上受调节的表达。LCR不依赖于其相对于基因的位置，但依赖于拷贝 数而发挥功能。据信它们发挥着打开核小体结构从而使其它因子可以结合至DNA的功能。 LCR还可以影响复制时间安排和起点使用。绝缘子（也称为边界元件）是通过阻断周围染 色质的影响来阻止基因转录活化（或失活）的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑制基因表达 的控制元件；它们不依赖于其取向或与基因的距离而作用于基因。基质附着区（MAR，也称 为支架附着区）是结合核支架的DNA内的序列。它们可以影响转录，可能通过将染色体分 开到调节域中。据信MAR介导染色体中更高级的、成环的结构。转录终止子是RNA聚合酶 从模板释放的基因邻近内的区域。复制起点是在细胞分裂的DNA合成或复制阶段期间，开 始DNA复制过程的基因组区。减数分裂重组热点是在减数分裂期间比平常更经常地重新组 合的基因组区。调节区中的特定核苷酸可以发挥多种功能。例如，特定的核苷酸可以是启 动子的一部分并且参与对转录激活子蛋白的结合。
[0140] 在细胞中（例如在植物或植物细胞中）发挥功能的分离的调节元件可用于经由例 如遗传工程改造来修饰植物表型。
[0141] RNA :由磷酸二酯键连接的核糖核酸单体的、通常为线性的聚合物。天然存在的 RNA分子分成三个通常的类，信使RNA (编码蛋白质的mRNA)、核糖体RNA (rRNA，核糖体组 分）、和转运RNA(tRNA，在蛋白质合成期间负责将氨基酸单体转移到核糖体的分子）。信使 RNA包括异核RNA(hnRNA)和结合膜的多核糖体RNA(附着于粗内质网）。总RNA指所有类 型的RNA分子的异质混合物。
[0142] RNA干扰（RNAi):牵涉小RNA (包括miRNA和siRNA)的基因沉默机制经常被称为 属于广义术语RNAi。RNAi的天然功能包括保护基因组免受移动遗传元件诸如转座子和病 毒的侵袭，和调节基因表达。
[0143] RNA干扰导致生物体内基因表达的失活或受到抑制。RNAi可以由两种通常途径之 一触发。第一，其可以由小干扰RNA(siRNA，通常长度为?21个核苷酸并且以各3'端有2 个未配对核苷酸的dsRNA双链体形式投递）的直接细胞投递触发，该小干扰RNA与作为抑 制靶物的RNA具有序列互补性。第二，RNAi可以由其中从所设计、表达的各种类型的基因体 内形成siRNA的数种方法之一触发。这些基因通常表达形成分子内或分子间双链体的RNA 分子（dsRNA)，其由天然的酶（DICER或DCL)加工以形成siRNA。在一些情况下，这些基因 表达形成"发夹"的RM转录本，其具有完美或近乎完美的碱基配对；一些不完美的形成发 夹的转录本产生特定类型的小RNA，称为微小RNA (miRNA)。在任一种通用方法中，siRNA (或 miRNA)充当"指引序列"来指导RNA降解酶（称为RISC)切割靶RNA或使其沉默。在一些情 况下，将诱导RNAi的基因整合到转基因生物体的基因组中是有益的。一个例子是经修饰以 通过诱导RNAi的转基因来抑制特定基因的植物。在大多数目前所实践的方法中，在转基因 植物中通过表达dsRNA(分子内的或发夹，或分子间的，其中两个转录本退火以形成dsRNA) 的转基因来触发RNAi。
[0144] RNA沉默：用于指示基于RNA的基因沉默或RNAi的通用术语。
[0145] 序列同一性：两条核酸序列或两条氨基酸序列之间的相似性表述为序列之间的相 似性或称为序列同一性。序列同一性经常以百分比同一性（或相似性或同源性）衡量；百 分比越高，两条序列就越相似。当使用标准方法对齐时，双特异性融合蛋白的同源物会拥有 相对高的序列同一性程度。
[0146] 用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载 于：Smith 和 Waterman (Adv.Appl.Math.2:482, 1981) ;Needleman 和 Wunsch(J.Mol. Biol.48:443, 1970) ;Pearson 和 Lipman (PNAS.USA 85:2444,1988) ;Higgins 和 Sharp (Gene, 73:237_244, I988) ;Higgins 和 Sharp(CABK)S 5:15I-I53, I989) ;Corpet 等 (Nuc. Acids Res.16:10881-90,1988) ;Huang 等（Comp. Appls Biosci.8:155-65, 1992); 和 Pearson 等（Methods in Molecular Biology 24:307-31,1994)。 Altschul 等（Nature Genet.，6:119-29, 1994)提供了对序列比对方法和同源性计算的详细考量。
[0147] 可以使用比对工具 ALIGN(Myers 和 Miller, CABIOS 4:11-17, 1989)或 LFASTA (Pearson 和 Lipman, 1988)来实施序列比较（Internet Program. O 1996, W. R. Pearson 和 the University of Virginia, "fasta20u63" 版本 2.0u63,发布日 1996 年 12月）。ALIGN将完整的序列彼此间进行比较，而LFASTA比较区域的局部相似性。这些比 对工具及其相应教程可在网络上http://biology. ncsa. uiuc. edu处获得。
[0148] 所公开的双特异性融合蛋白的直向同源物（Ortholog)通常表征为使用设置为缺 省参数的ALIGN，具有与双特异性融合蛋白的氨基酸序列的全长比对计算出的超过75 %的 序列同一性。当用该方法评估时，与参照序列具有甚至更高的相似性的蛋白质会显示增加 的百分比同一性，诸如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、或至少98% 的序列同一性。另外，可以在公开的融合蛋白的一个或两个结合域的全长上比较序列同一 性。在此情况下，百分比同一性基本上类似于就全长序列同一性所论述的百分比同一性。
[0149] 当对完整序列的显著小于全部的部分的序列同一性进行比较时，同源物在10-20 个氨基酸的小窗口上通常会拥有至少80%的序列同一性，并且根据其与参照序列的相似 性，可能具有至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99 %的序列同一性。可以使用LFASTA 来测定这类小窗口上的序列同一'I"生；可以在万维网地址biology, ncsa. uiuc. edu上发现方 法。本领域中的技术人员会领会这些序列同一性范围的提供仅用于指引；在给出的范围外 能够获得非常显著的同源物是完全可能的。本公开不仅提供了上文所描述的肽同源物，还 提供了编码这类同源物的核酸分子。
[0150] 两种核酸分子紧密相关的另一指示是这两种分子在严格条件下彼此杂交。严格条 件是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。一般地，严格条件选择为比特定序列在 限定的离子强度和PH处的热解链点（Tm)低约5°C至20°C。1' 111是50%的靶序列与完美匹 配的探针杂交时的温度（在限定的离子强度和PH下）。核酸杂交条件和严格性的计算可以 在 Sambrook 等（于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York,1989)和 Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology第I部分，第2章，Elsevier, New York, 1993)中发现。在严格条件下与公开的双 特异性融合蛋白序列杂交的核酸分子通常会基于完整的融合蛋白编码序列、完整结合域、 或编码序列的其它选择部分在〇. 2x SSC，0. 1% SDS、于65°C的清洗条件下与探针杂交。
[0151] 但是由于遗传密码子的简并性，不显示高度同一性的核酸序列也可能编码相似的 氨基酸序列。理解的是，可以使用此简并性来改变核酸序列以生成各编码基本相同的蛋白 质的多种核酸序列。
[0152] 小干扰RNA(siRNA):通过DICER酶（动物中）或DCL酶（植物中）从dsRNA加 工出的约21-25个核苷酸的RNA。初始DICER或DCL产物是双链的，其中两条链通常长为 21-25个核苷酸并且在各3'端含有2个未配对碱基。双链siRNA结构内的单个链被分开， 然后其中一条siRNA通常与多亚基复合物（诱导RNAi的沉默复合物（RISC))结合。siRNA 的典型功能是基于碱基配对互补性指引RISC到达靶物。
[0153] 可转录的多核苷酸分子：任何能够转录成RNA分子的多核苷酸分子。普通技术人 员已知这样的方法，即用于将构建体以某种方式引入细胞，从而使得可转录的多核苷酸分 子被转录成功能性mRNA分子，其被翻译并因此表达为蛋白质产物。还可以构建能够表达 反义RNA分子的构建体，从而抑制特定目的RNA分子的翻译。用于制备并使用构建体及宿 主细胞的常规组合物和方法是本领域中技术人员公知的（参见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版卷 1，2 和 3. Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000)〇
[0154] 转录：通过RNA聚合酶生成作为DNA序列互补拷贝的RNA分子。
[0155] 转录终止区：控制转录本3'端形成的序列。自切割核酶和聚腺苷酸化序列是转录 终止序列的例子。
[0156] 转录性基因沉默（TGS):由与基因启动子区同源且有时和编码区同源的dsRNA 的形成所触发的现象。TGS导致DNA和组蛋白甲基化以及染色质重构，由此导致转录 抑制而非RNA降解。TGS和PTGS都依赖于dsRNA，其被切割成小（21-25个核苷酸）干 扰 RNA(Eckhardt, Plant Cell, 14:1433-1436,2002 ;Aufsatz 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，99:16499-16506, 2002)。
[0157] 转基因：该术语指含有重组遗传材料的植物/真菌/细胞/其它实体或生物体，该 重组遗传材料通常未发现于该类型/物种的实体中（即为异源遗传材料）且是通过人工操 作引入所论述的实体（或该实体的祖系）中的。由此，从其中通过转化引入重组DNA的植 物细胞（经转化的植物细胞）生长出的植物是转基因植物，且该植物的含有引入的转基因 的所有后代（不管是有性或无性产生的）也都是转基因植物。
[0158] 转化：外源DNA进入并改变受体细胞的过程。它可能在自然条件下或使用本领域 中公知的各种方法在人工条件下发生。转化可以依赖于任何已知的用于将外来核酸序列插 入到原核或真核生物宿主细胞中的方法。对方法的选择受到所转化的宿主细胞的影响，并 且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂转染、和粒子轰击。
[0159] 经转化的：经转化的细胞是已经通过分子生物学技术引入核酸分子的细胞。经转 化的细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体 的一部分复制。它们也包括在有限时间段内瞬时表达插入DNA或RNA的细胞。如本文中使 用的，术语转化涵盖了所有可以将核酸分子引入这类细胞中的技术，包括用病毒载体转染、 用质粒载体转化、和通过电穿孔引入裸DNA、脂转染和粒子枪加速。
[0160] 转座子：能够在基因、染色体或基因组内部转移位置或移动的核苷酸序列诸如 DNA或RNA序列。
[0161] 转基因植物：含有插入到其核基因组或细胞器基因组的外来（异源）核苷酸序列 的植物。
[0162] 转基因：通过转化技术插入到一种或多种宿主细胞的核酸序列。
[0163] 载体：引入到宿主细胞中由此生成经转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包含 允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可以包含一种或多种治疗性 基因和/或可选择的标志基因以及本领域中已知的其它遗传元件。载体可以转导、转化或 感染细胞，由此使得细胞表达其天然的那些以外的核酸和/或蛋白质。任选地，载体包括帮 助实现核酸进入细胞的材料，诸如病毒颗粒、脂质体、蛋白质外壳等。
[0164] 除非另外解释的，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领 域的普通技术人员通常的理解相同的含义。除非上下文另外清楚指出的，单数的术语"一个 / 一种/该"包含复数所指对象。类似地，除非上下文另外清楚指出的，词"或/或者"意图 包含"和/及/以及"。因此"包含A或B"意味着包含A或B，或A和B。还应理解的是，对 核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子质量值都是大概的， 并且提供以用于描述。尽管可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文中所描 述的那些的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。本文中所提述的所有出版 物、专利申请、专利和其它引用都通过提述完整并入。在有冲突的情况下，参照本说明书内 容，包括对术语的解释。另外，材料、方法和实施例仅为例示性的并且不意图限制。
[0165] III.对数个实施方案的概述
[0166] 本公开描述了新的转录启动区，其包含增强子域以及在该增强子域的增强控制下 的转录调节域。所述增强子域包含串联排列的多个（例如2-4个或更多个）拷贝的天然但 以前未识别的SCBV增强子。本公开的转录调节区（启动子）相比于缺乏该增强子域的启动 子提供了增强的转录。在一个实施方案中，公开了嵌合转录调节区，其包含在SEQ ID N0:1 的位置337至位置618中显示的SCBV增强子元件的一个或多个拷贝；以及可操作地与其连 接的包含RNA聚合酶结合位点和mRNA启动位点的启动子，其中当在所述嵌合转录调节区的 调节性控制下转录目的核苷酸序列时，转录产物的量相比于用包含所述启动子、但不包含 所述SCBV增强子序列的嵌合转录调节区所获得的转录产物的量增加。在一些实施方案中， 嵌合转录调节区包含从植物病毒基因、细菌基因、真菌基因、植物核基因、植物核外基因、无 脊椎动物基因或脊椎动物基因的上游区获得的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是 种子特异性的。
[0167] 还提供了包含所描述的转录调节区和待转录的DNA序列的DNA构建体。在一些实 施方案中，公开了一种DNA构建体，其包含转录启动区，所述转录启动区可操作地连接于可 转录的多核苷酸分子，而后者可操作地连接于3'转录终止多核苷酸分子。在一个实施方案 中，所述可转录的多核苷酸分子赋予其中表达该多核苷酸分子的植物农艺性状。在另一个 实施方案中，所述可转录的多核苷酸分子赋予表达该多核苷酸分子的植物以修饰的脂肪酸 谱。在最后一个实施方案中，所述可转录的多核苷酸分子赋予表达该多核苷酸分子的植物 以降低的饱和脂肪酸谱。
[0168] 还提供了转基因植物。在一个实施方案中，转基因植物由公开的DNA构建体稳定 转化。在一些实施方案中，所述转基因植物是双子叶植物。在其它实施方案中，所述转基因 植物是单子叶植物。在一个具体的实施方案中，所述转基因植物是玉米植物。在另一个具 体的实施方案中，所述转基因植物是拟南芥植物。
[0169] 进一步提供了公开的转基因植物的种子。在一个实施方案中，所述种子包含公开 的DNA构建体。
[0170] 甚至还进一步提供了转基因植物细胞或组织。在一个实施方案中，转基因植物细 胞或组织包含公开的嵌合转录调节区。在一些实施方案中，所述植物细胞或组织衍生于双 子叶植物。在其它实施方案中，所述植物细胞或组织来自单子叶植物。在一个具体的实施 方案中，所述植物细胞或组织来自玉米植物。在另一个具体的实施方案中，所述转基因植物 是拟南芥植物。
[0171] 还提供了生成公开的转基因植物、植物细胞、种子或组织的方法。在一些实施方案 中，所述方法包括用公开的DNA构建体转化植物细胞或组织。
[0172] 进一步提供了可从公开的转基因植物衍生的植物细胞、果实、叶、根、芽、花、种子、 插条和其它在有性或无性繁殖中有用的再生材料、包括Fl杂交种的后代植物、雄性不育植 物和所有其它植物和植物产物。
[0173] 还公开了包含在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中显示的SCBV增强子元件 的一个或多个拷贝的玉米植物细胞或拟南芥植物细胞、组织或植物。在一个实施方案中，玉 米植物细胞或拟南芥植物细胞、组织或植物包含在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中 显示的SCBV增强子元件的一个或多个拷贝，其中所述SCBV增强子元件的一个或多个拷贝 被插入到玉米植物细胞或拟南芥细胞、组织或植物基因组的随机位置处。在一些实施方案 中，相比于在不存在SCBV增强子时目的核苷酸序列的转录，SCBV增强子赋予在其调节性控 制下的目的核苷酸序列的增强的转录。
[0174] IV. SCBV增强子及其用途
[0175] 本公开提供了来自甘蔗杆状DNA病毒（SCBV)基因组的以前未识别的增强子区，该 增强子可用于增强转录效率，这可能导致在该增强子控制下的DNA序列的转录增强。特别 感兴趣的是可能具有与宿主相同的遗传起源或外来起源的基因序列（天然存在的序列（有 义和反义方向）或合成制备的序列）的增强的转录。受试增强子包含以前未识别的天然 SCBV增强子域（其序列在SEQ ID NO: 1中位置337至618处提供）的两个或更多个拷贝。 该增强子包含串联排列的增强子域序列的至少2个拷贝，在一些实施方案中3个或4个或 更多个拷贝。
[0176] 还涵盖了同源增强子。不意图以任何方式受到限制的，代表性的同源序列可 以包含那些来自其它SCBV启动子的，例如来自不同的SCBV分离物，诸如那些记载于 Braithwaite等（Plant Cell Rep. 23:319-326, 2004 ;通过提述完整并入本文）或美国专利 5, 994, 123 (通过提述完整并入本文）中的。
[0177] 天然的增强子包含在其天然环境中处于启动子上游并且在其约600bp内的DNA 序列。取mRNA的起始核苷酸作为0,含有增强子的序列是从约-50至约-1，OOObp，通常从 约-50至-950bp，一般包含约-100至-SOObp。增强子域是顺式作用的，且期望地位于待增 强的转录启动序列的约10, OOObp内，通常约2, OOObp内，更通常地邻近于或位于该转录启 动序列的约1，OOObp内。增强子相对于转录启动序列可以处于任一方向，并且相对于其所 增强的启动子位于其上游或下游，不过通常在上游。
[0178] 本公开的增强子域可以与很多种启动序列一起使用，所述启动序列包括天然发现 的在增强子控制下的启动子（例如处于顺式位置（邻近且同源的））以及通常不与特定增 强子关联的那些（例如异源的）。增强子域和转录启动域可以来自相同或不同的界、科或 种。感兴趣的物种包括原核生物和真核生物，诸如细菌、植物、昆虫、哺乳动物等。组合包括 所描述的SCBV(病毒的）增强子域（一个或多个）与以下物种的结构基因的转录启动区的 组合：SCBV的宿主（例如来自甘蔗）、另一种植物物种（例如来自相同或不同的科）、昆虫、 脊椎动物、细菌、真菌等。
[0179] 本公开还涵盖了 DNA构建体，其包含受试转录启动区以及在该转录启动区控制下 的待转录的DNA序列。所述DNA序列可以包含天然的开放阅读框，其包含转录的5'和3'侧 翼序列。或者，其可以由于编码RNA分子或其部分的互补体而包含反义序列。当构建体包 含编码蛋白质的开放阅读框（ORF)时，获得增强的转录启动速率，其通常提供该基因的多 肽表达产物的增加量。当构建体包含反义序列时，与野生型互补的RNA的增强的转录抑制 了野生型mRNA的表达，由此降低多肽表达产物的量；可以预见的是，所讨论的野生型mRNA 可以对应于宿主细胞的天然mRNA或病原体诸如病毒或真菌的mRNA。
[0180] 在各个实施方案中，待转录的DNA序列包括：基因（例如来自植物、动物、细菌、病 毒或真菌）的蛋白质编码序列，其可以包含：编码蛋白质产物的天然的开放阅读框；自基因 编码的mRNA衍生的互补DNA(cDNA)序列；产生期望的编码序列的合成DNA ;自天然基因的 外显子衍生的蛋白质编码序列，诸如通过外显子连接产生的开放阅读框；和/或其任意两 种或更多种的组合。附着于这些序列的是合适的转录终止/聚腺苷酸化序列；来自编码初 始RNA产物（由外显子和内含子组成）的天然基因（例如来自植物、动物、细菌、病毒或真 菌）的序列（例如真核生物的天然的聚合酶II和聚合酶III转录的基因）；编码特定的RNA 或蛋白质产物的合成的DNA序列；通过诱变（诸如定点诱变）和/或其它遗传工程改造技 术从已知的编码序列（例如天然的基因序列）修饰而来的DNA序列；通过连接DNA片段实 现的上述任意种的嵌合体，包括编码融合蛋白的嵌合体；和/或编码RNA分子或其部分的互 补体的DNA序列。
[0181] 植物中增强的转录可以在增强植物特征性蛋白质（内源的-即正常发现于野生型 宿主中）或来自其它遗传来源的那些蛋白质（外源的-即正常未发现于野生型宿主中）的 生成中发挥作用。要从本文中所描述的增强子和嵌合转录调节区表达的序列类型的例子包 括：脂肪酸修饰蛋白；反义或小的抑制性RNA(用于基因抑制）；营养上重要的蛋白质；生长 促进因子；对特定环境条件下生长的植物给予保护的蛋白质，例如赋予对金属、盐或其它毒 性抗性的蛋白质；胁迫有关的蛋白质，其给予对极端温度、冷冻等的耐受；赋予植物对害虫 或感染有关的保护的蛋白质，例如给予对细菌、真菌或其它微生物感染抗性，或者对昆虫捕 食（例如苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis)毒素）或其它无脊椎动物或脊椎动物抗性的 蛋白质；具有植物以外的医学重要性例如抗微生物、抗肿瘤等的化合物；具有特定商业价 值的蛋白质或其它化合物；蛋白质，例如代谢途径（例如用于生成多酚化合物或其它次级 代谢物的途径）的酶的水平升高；对植物宿主具有结构性价值的产物的水平升高；等等。转 录的目的序列长度会是至少约8bp、至少约12bp、至少约20bp，且可以是一千或几千个碱基 对（kbp)。
[0182] V.构建体
[0183] 本公开的构建体通常含有嵌合转录调节区，其包含所提供的SCBV增强子元件的 一个或多个拷贝，所述一个或多个拷贝可操作地连接于启动子（通常至少含有RNA聚合酶 结合位点和mRNA启动位点），而该区域可操作地连接于可转录的多核苷酸分子，该分子可 操作地连接于3'转录终止多核苷酸分子。另外，构建体可以包括但不限于来自植物基因的 3'非翻译区（3'UTR)的另外的调节性多核苷酸分子（例如3'^1?以增加1111?嫩的1111?嫩稳定 性，诸如马铃薯的PI-II终止区或者章鱼碱或胭脂碱合酶3'终止区）。构建体可以包括但 不限于mRNA多核苷酸分子的5'非翻译区（5'UTR)，其可能在翻译启动中起着重要作用并且 还可以是植物表达构建体中的遗传组件。例如，已经证明自热激蛋白基因衍生的不翻译的 5'前导多核苷酸分子增加植物中的基因表达（参见例如美国专利5, 659, 122和5, 362, 865， 其中每个都通过提述完整并入）。如该构建体中存在的这类额外的上游和下游调节性多核 苷酸分子可以自相对于构建体上的其它元件为天然的或异源的来源衍生。
[0184] 因此，一个实施方案是包含嵌合转录调节区的构建体，该转录调节区本身包含在 SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中显示的SCBV增强子元件的一个或多个拷贝（例如2 个、3个、4个或更多个拷贝），所述拷贝可操作地连接于启动子，该启动子可操作地连接于 可转录的多核苷酸分子，从而当将该构建体引入到植物细胞中时，指导所述可转录的多核 苷酸分子以期望的水平和/或在期望的组织或发育模式转录。在一些实例中，所述可转录 的多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，且嵌合转录调节区提供功能性mRNA分子的转 录，所述mRNA分子从构建体翻译并表达为蛋白质产物。在另一个实施方案中，所述可转录 的多核苷酸分子包含基因的反义区，且嵌合转录调节区影响反义RNA分子或其它类似的抑 制性RNA的转录，从而抑制靶宿主细胞中特定目的RNA分子的表达。
[0185] 本公开的更多的构建体例子包括双Ti质粒边界DNA构建体，其具有从根癌土壤杆 菌（Agrobacterium tumefaciens)分离出的 Ti 质粒（包含 T-DNA)的右边界（RB 或 AGRtu. RB)和左边界（LB或AGRtu. LB)区，其与由土壤杆菌细胞提供的转运分子一起，使得T-DNA 能够整合到植物细胞的基因组中。该构建体还可以含有提供细菌细胞中的复制功能和抗生 素选择的质粒骨架DNA区段，例如，大肠杆菌（Escherichia coli)复制起点诸如ori322、具 有广泛宿主范围的复制起点诸如oriV或oriRi、以及用于可选择标志的编码区诸如Spec/ Strp，其编码赋予对壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰转移酶（aadA)，或庆大 霉素（Gm，Gent)可选择标志基因。对于植物转化，代表性的宿主细菌菌株包括根癌土壤杆 菌ABI，C58,或LBA4404 ;然而，也可以使用植物转化领域中的技术人员已知的其它菌株。
[0186] 期望能够鉴定在种子特异性组织内以高水平表达酰基辅酶ΑΛ9去饱和酶的启动 子。植物酰基辅酶ΑΛ9去饱和酶是可溶的。它位于质体基质中，并使用被酯化成ACP(主 要是硬脂酰-ACP)的新合成脂肪酸作为底物。这与其它Λ-9去饱和酶形成对照，其它Λ-9 去饱和酶位于内质网膜（ER,或微粒体）中，并使用被酯化成CoA的脂肪酸作为底物，并且使 棕榈酸和硬脂酸等饱和脂肪酸去饱和。美国专利5, 723, 595和6, 706, 950涉及植物去饱和 酶。
[0187] 在植物中表达微生物Λ-9去饱和酶基因是本领域公知的。已经将酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) Δ -9去饱和酶基因导入烟草叶组织中（Polashcok, J. 等，FASEB J 5:A1157(1991)，且其在该组织中表观表达。此外，在番茄中表达了这种基 因。见 Wang 等，J. Agric Food Chem. 44:3399-3402 (1996);和 C. Wang 等，Phytochemistry 58:227-232(2001)。虽然对于烟草和番茄两者都报道了某些不饱和物的若干增加和某 些饱和物的若干降低，但烟草和番茄都不是油料作物。还有人将这种酵母基因导入欧洲 油菜（Brassica napus)中（参见美国专利5, 777, 201)。已有人将另一种来自构巢曲霉 的真菌Λ-9去饱和酶导入加拿大油菜中，实现了种子油中饱和脂肪酸的降低（参见US 20080260933A1)。在这种情况下，在种子油中硬脂酸的消耗￠1-90%)比更丰富的棕榈酸 脂肪酸的消耗（36-49% )更多。因此，优先作用于饱和物的酰基辅酶ΑΛ-9去饱和酶将实 现总饱和物的进一步降低。
[0188] 油类，无论是植物还是动物来源的，其特征都主要取决于碳原子和氢原子的数目， 以及构成脂肪酸链的双键的数目和位置。大多数衍生自植物的油类由不同量的棕榈酸 (16:0)、硬脂酸（18:0)、油酸（18:1)、亚油酸（18:2)和亚麻酸（18:3)脂肪酸组成。常规地， 棕榈酸和硬脂酸被指定为"饱和的"，因为它们的碳链被氢原子饱和，因而不具有双键；它们 含有最大可能数目的氢原子。然而，油酸、亚油酸、和亚麻酸为在其中分别具有一个、两个、 和三个双键的18碳的脂肪酸链。油酸通常被视为单不饱和脂肪酸，而亚油酸和亚麻酸被视 为多不饱和脂肪酸。美国农业部将"无饱和物"或"没有饱和物"的产品定义为具有按重量 计小于3. 5%的总饱和脂肪酸的产品（相比于脂肪酸的总量）。
[0189] 脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸（16:0)，其显现出高效延伸而形成硬脂酸 (18:0)。当仍在质体中时，饱和脂肪酸随后可以通过称为酰基ACP Λ-9去饱和酶的酶导入 一个或多个碳-碳双键而被去饱和。具体地说，硬脂酸可以经由质体Λ-9去饱和酶迅速去 饱和而产生油酸（18:1)。事实上，棕榈酸也可以经由质体Λ-9去饱和酶去饱和为棕榈油 酸（16:1)，但这种脂肪酸在大多数植物油中仅以微量（0-0.2% )存在。因此，质体中脂肪 酸合成的主要产物为棕榈酸、硬脂酸、和油酸。在大多数油中，油酸是主要的合成的脂肪酸， 因为饱和脂肪酸以低得多的比例存在。
[0190] 随后在质体外的细胞质中植物脂肪酸的去饱和似乎仅限于油酸，其可被微粒体去 饱和酶去饱和为亚油酸（18:2)和亚麻酸（18:3)，微粒体去饱和酶作用于被酯化为磷脂酰 胆碱（PC)的油酰基底物或亚油酰基（Iineoleoyl)底物。此外，取决于不同的植物，油酸可 通过延长（达到20:1，22:1，和/或24:1)或通过添加官能团而被进一步修饰。然后，这些 脂肪酸连同饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸可被装配成甘油三酯。
[0191] 因而，一个实施方案是包含嵌合转录调节区本身的构建体，所述转录调节区包含 可操作地连接于启动子的如SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中所示的SCBV增强子元 件的四个拷贝，所述启动子可操作地连接于包含酰基辅酶ΑΛ-9去饱和酶的可转录的多核 苷酸分子。其中，当将该构建体引入到植物细胞中时，所述酰基辅酶ΑΛ-9去饱和酶以期望 的水平和/或以期望的组织或发育模式表达，由此降低植物细胞和/或期望组织中饱和脂 肪酸的百分比。
[0192] 还涵盖了包含至少一个SCBV增强子元件（任选地，在嵌合转录调节区的背景 中）的构建体，该构建体是激活标签化构建体。激活标签化是一种在全基因组规模随 机并强烈上调基因，然后可以筛选并选择特定表型的方法。已知在各种激活标签化构 建体类型中可用的组件；参见例如：Walden等，Plant Mol. Biol. 26:1521-8, 1994(描 述了一种用于活化烟草细胞培养物中基因从而允许细胞在缺乏植物生长激素的情况 下生长的活化 T-DNA 标签构建体）；Miklashevichs 等，Plant J. 12:489-98, 1997 ; Harling 等，EMBO J. 16:5855-66,1997 ;Walden 等，EMBO J. 13:4729-36,1994(报告 了从T-DNA标签侧翼的植物基因组序列分离并推定牵涉植物生长激素应答的基因）； Schell 等，TrendsPlant Sci. 3:130, 1998 (论述了对一组相关研究的调查）；Kardailsky 等，Science286:1962-1965, 1999(描述了激活T-DNA标签并筛选植物中的早期开花表 型）；Koncz 等，Proc Natl Acad Sci U S A 86 (21) :8467-71, 1989(描述了使用土壤杆 菌基因5启动子（pg5)进行的激活标签化，该启动子仅在增殖细胞时有活性并且必须插 入到直接临近于植物基因以影响其表达）；Wilson等，Plant Cell8:659-671，1996(利 用修饰的Ds转座子进行的激活标签化，所述转座子携带CaMV 35S启动子和nos: :hpt 选择盒）和Schaffer等，Cell 93:1219-1229, 1998(例示了同一系统，其用于上 调临近的植物基因，从而导致优势的功能获得性突变1996);和Weigel等，Plant Physiology, 122:1003-1013, 2000(例示了可用于筛选成百上千个经转化的植物的形态学 表型的激活标签化载体）。
[0193] VI.用于转录增强的核苷酸序列
[0194] 用于通过纳入如本文中提供的构建体进行转录增强的例示性可转录的多核苷酸 分子包括，例如来自靶物种以外的多核苷酸分子或基因或者起源于或存在于相同物种中的 基因，但通过遗传工程改造方法而非经典的繁殖或育种技术纳入到受体细胞中的多核苷酸 分子或基因。多核苷酸分子的类型可以包括但不限于，已经存在于靶植物细胞中的多核苷 酸分子、来自另一种植物的多核苷酸分子、来自不同生物体的多核苷酸分子、或外部生成的 多核苷酸分子，诸如含有基因的反义信息的多核苷酸分子或编码转基因的人工的、合成的、 或经修饰的版本的多核苷酸分子。
[0195] 在一个实施方案中，将如SEQ ID NO: 1的位置337至618中显示的多核苷酸分子 (或其两个或更多个拷贝）（例如在嵌合转录启动区的背景中）纳入到构建体中，从而使得 所描述的SCBV增强子序列（或两个或更多个这类序列的系列）可操作地连接于可转录的 多核苷酸分子，所述可转录的多核苷酸分子是有农艺意义的基因或其它表达序列（更一般 地，目的核苷酸序列）。如本文中使用的，术语"有农艺意义的基因"指包括但不限于如下 的可转录的多核苷酸分子：提供与植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养改善、疾病 或害虫抗性、或环境或化学耐受性有关的期望属性的基因。期望表达有农艺学利益的基因， 例如，从而赋予农艺学上重要的性状。对农作物植物提供有益的农艺性状的有农艺学利益 的基因可以是，例如一种或多种赋予表达该基因的植物以下益处的序列：除草剂抗性（参 见例如美国专利 6, 803, 501 ;6, 448, 476 ;6, 248, 876 ;6, 225, 114 ;6, 107, 549 ;5, 866, 775 ; 5, 804, 425 ;5, 633, 435 ;5, 463, 175 ;以及美国公开 US20030135879 和 US20030115626)、增 加的产量（参见例如美国专利USRE38, 446 ;美国专利6, 716, 474 ;6, 663, 906 ;6, 476, 295 ; 6, 441，277 ;6, 423, 828 ;6, 399, 330 ;6, 372, 211 ;6, 235, 971 ;6, 222, 098 ;5, 716, 837)、 昆虫控制（参见例如美国专利 6, 809, 078 ;6, 713, 063 ;6, 686, 452 ;6, 657, 046 ; 6, 645, 497 ；6, 642, 030 ；6, 639, 054 ；6, 620, 988 ；6, 593, 293 ；6, 555, 655 ；6, 538, 109 ； 6, 537, 756 ；6, 521, 442 ；6, 501, 009 ；6, 468, 523 ；6, 326, 351 ；6, 313, 378 ；6, 284, 949 ； 6, 281, 016 ；6, 248, 536 ；6, 242, 241 ；6, 221, 649 ；6, 177, 615 ；6, 156, 573 ；6, 153, 814 ； 6, 110, 464 ；6, 093, 695 ；6, 063, 756 ；6, 063, 597 ；6, 023, 013 ；5, 959, 091 ；5, 942, 664 ； 5, 942, 658, 5, 880, 275 ;5, 763, 245 ;5, 763, 241)、真菌疾病抗性（参见例如美国专利 6, 653, 280 ；6, 573, 361 ；6, 506, 962 ；6, 316, 407 ；6, 215, 048 ；5, 516, 671 ；5, 773, 696 ； 6, 121，436 ;6, 316, 407 ;6, 506, 962)、病毒抗性（参见例如美国专利 6, 617, 496 ; 6, 608, 241 ;6, 015, 940 ;6, 013, 864 ;5, 850, 023 ;5, 304, 730)、线虫抗性（参见例如美国 专利6, 228, 992)、细菌疾病抗性（参见例如美国专利5, 516, 671)、植物生长和发育（参 见例如美国专利6, 723, 897 ;6, 518, 488)、淀粉产生量（参见例如美国专利6, 538, 181 ; 6, 538, 179 ;6, 538, 178 ;5, 750, 876 ;6, 476, 295)、改进的油产生量（参见例如美国专 利6, 444, 876 ;6, 426, 447 ;6, 380, 462)、高油产生量（参见例如美国专利6, 495, 739 ; 5, 608, 149 ;6, 483, 008 ;6, 476, 295)、改进的脂肪酸含量（参见例如美国专利6, 828, 475 ; 6, 822, 141 ；6, 770, 465 ；6, 706, 950 ；6, 660, 849 ；6, 596, 538 ；6, 589, 767 ；6, 537, 750 ； 6, 489, 461 ;6, 459, 018)、纤维产生量（参见例如美国专利 6, 576, 818 ;6, 271，443 ; 5, 981，834 ;5, 869, 720)、高蛋白产生量（参见例如美国专利6, 380, 466)、果实成熟（参见 例如美国专利5, 512, 466)、改善的可消化性（参见例如美国专利6, 531，648)、改善的味 道（参见例如美国专利6, 011，199)、低棉子糖（参见例如美国专利6, 166, 292)、增强的 动物和/或人营养（参见例如美国专利6, 723, 837 ;6, 653, 530 ;6, 541，259 ;5, 985, 605 ; 6, 171，640)、环境胁迫抗性（参见例如美国专利6, 072, 103)、期望的肽（例如药学的或可 分泌的肽）（参见例如美国专利6, 812, 379 ;6, 774, 283 ;6, 140, 075 ;6, 080, 560)、改进的加 工性状（参见例如美国专利6, 476, 295)、工业酶生产（参见例如美国专利5, 543, 576)、氮 固定（参见例如美国专利5, 229, 114)、杂交种子产生（参见例如美国专利5, 689, 041)、生 物聚合物（参见例如美国专利USRE37, 543 ;美国专利6, 228, 623 ;5, 958, 745和美国公开 此.旧20030028917)和生物燃料生产（参见例如美国专利5,998,700)。在上文所列出的专 利和公开申请中描述的遗传元件、方法和转基因通过提述并入本文。
[0196] 或者，可转录的多核苷酸分子可以通过编码导致内源基因表达受到靶向抑制（经 由例如反义、抑制性RNA(RNAi)、或共抑制介导的机制）的反义的或RNA分子来影响上文提 述（或其它）的植物属性或表型。RNA还可以是催化性RNA分子（核酶），其被工程改造以 切割期望的内源mRNA产物。因此，任何编码影响目的表型、生化或形态学变化的转录RNA分 子的可转录的多核苷酸分子都可以受益于由本文中提供的序列和构建体实现的转录增强。
[0197] 可以将描述的SCBV增强子或包含其一个或多个拷贝的嵌合转录调节区组入到 具有一个或多个标志基因的构建体（任何可以以某种方式筛选其表达或打分的可转录 的多核苷酸分子）中，并在瞬时或稳定的植物分析中测试以提供对稳定的转基因植物中 调节元件的基因表达样式的指征。在这类实施方案的实施中使用的标志基因包括但不 限于，编码以下蛋白质的可转录的多核苷酸分子：β -葡糖醛酸糖苷酶（记载于美国专利 5, 599, 670的⑶S)和绿色荧光蛋白（记载于美国专利5, 491，084和6, 146, 826的GFP)、 赋予抗生素抗性的蛋白质、或赋予除草剂耐受性的蛋白质。本领域中已知可用的抗生素 抗性标志，包括那些编码赋予对卡那霉素抗性（nptll)、潮霉素 B抗性（aph IV)、链霉素 抗性、或壮观霉素抗性（aad，spec/strep)和庆大霉素抗性（aac3和aacC4)的蛋白质 的。已经证明转基因植物对其耐受性并且可以应用本发明的方法的除草剂包括但不限 于：草甘膦（glyphosate)、草胺膦（glufosinate)、磺酰脲类（sulfonylureas)、咪唑啉酮 类（imidazolinones)、溴苯臆（bromoxynil)、茅草枯（dalapon)、cyclohezanedione、原 口卜啉原（protoporphyrinogen)氧化酶抑制剂、和isoxasflutole除草剂。编码牵涉除草 剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域中已知的，并且包括但不限于编码2, 4-D降 解酶（记载于WO 2007/053482A2或美国专利7, 838, 733的aad-12)的多核苷酸分子；编 码5-烯醇丙酮酰莽草酸（enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶（EPSPS，记载于美国专利 5, 627, 061，5, 633, 435, 6, 040, 497和美国专利5, 094, 945中用于草甘膦耐受性）的多核 苷酸分子；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰转移酶（记载于美国专利5, 463, 175 的GOX和记载于美国公开No. 20030083480的GAT)的多核苷酸；编码溴苯腈腈水解酶 (Bxn，记载于美国专利4, 810, 648用于溴苯腈耐受性）的多核苷酸分子；记载于Misawa 等（Plant J.4:833_840，l993)和 Misawa 等（Plant 1 6:481-489，1"4)中用于编码对 达草灭（norflurazon)耐受性的八氢番茄红素去饱和酶（crtl)的多核苷酸分子；记载于 Sathasiivan等（Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990)中编码用于对磺酰脲除草剂耐受 性的乙酰羟酸合酶（AHAS，又称为ALS)的多核苷酸分子；编码降解麦草畏的酶加氧酶（记 载于美国专利公开US20030135879和US20030115626,用于麦草畏耐受性）的多核苷酸 分子；和编码草胺膦和双丙氨膦（bialaphos)耐受性的多核苷酸分子（记载于DeBlock 等 EMBO J. 6:2513-2519, 1987 中的 bar 基因）、记载于 Wohlleben et al·，（1988)Gene 70:25-37中的pat基因、或记载于美国专利申请2007/086813中的DSM-2基因）。本公开的 调节元件可以表达编码以下酶的可转录多核苷酸分子：膦丝菌素（phosphinothricin)乙 酰转移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基葡糖苷磷酸转移酶、羟苯基丙酮酸脱氢酶、潮霉素磷酸转 移酶、新霉素磷酸转移酶、茅草枯脱齒素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸酯合酶、草 甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰转移酶。
[0198] 可以将含有至少一个可操作地连接于标志基因或其它目的核苷酸序列的SCBV增 强子（例如在嵌合转录调节区的背景中）的构建体投递到组织（例如经转化的）中，并且通 过依赖于所转录的标志或序列的合适机制来分析该组织。当将调节元件可操作地连接于稳 定植物中有农艺学利益的基因时，可以将这类定量或定性分析用作工具来评估该调节元件 的潜在表达谱。在瞬时测定法中可以使用标志基因；在瞬时测定法中测试标志基因表达的 方法是本领域中普通技术人员已知的。已经报告了使用多种植物、组织和DNA投递系统的 标志基因的瞬时表达。例如，瞬时分析系统包括但不限于，在使用任何感兴趣的植物物种的 任何瞬时植物测定法中经由对组织的电穿孔或粒子轰击进行的直接基因投递。这类瞬时系 统会包括但不限于，对来自多种组织来源的原生质体的电穿孔或对感兴趣的特定组织的粒 子轰击。本公开涵盖了任何瞬时表达系统评估调节元件的用途，所述调节元件可操作地连 接于任何可转录的多核苷酸分子，其包括但不限于标志基因或有农艺学利益的基因。预想 通过合适的投递系统在瞬时中测试的植物组织的例子包括但不限于，叶基组织、愈伤组织、 子叶、根、胚乳、胚、花组织、花粉、和表皮组织。
[0199] VII.植物转化
[0200] 可以使用任何植物转化方法将含有如本文中描述的增强子元件（或其多个拷 贝）或嵌合转录调节区的植物转化构建体引入植物中。在本发明的实践中，用于通过将 植物表达构建体引入到植物基因组中来转化植物的方法和材料可以包括任何公知且经 过证明的方法，包括电穿孔（例如美国专利5, 384, 253)、微粒轰击（microprojectile bombardment)(例如美国专利 5, 015, 580 ;5, 550, 318 ;5, 538, 880 ;6, 160, 208 ;6, 399, 861 ; 和6, 403, 865)、土壤杆菌介导的转化（例如美国专利5, 824, 877 ;5, 591，616 ;5, 981，840 ; 和6, 384, 301)、和原生质体转化（例如美国专利5, 508, 184)。对本领域中的技术人员明显 的是，可以利用并修改许多转化方法学以从任意数量的感兴趣的靶作物生成稳定的转基因 植物。
[0201] 用于转化双子叶植物的特定方法是本领域中的技术人员已知的。举例而 言，已经描述了许多农作物的转化和植物再生方法，所述农作物包括但不限于，拟南 芥（Arabidopsis thaliana)、棉花（Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、花生 (Arachis hypogaea)和芸苔属（Brassica)的成员。
[0202] 类似地，用于转化单子叶植物的具体方法也是本领域中的技术人员已知 的。举例而言，已经描述了许多农作物的转化和植物再生方法，所述农作物包括但 不限于，大麦（Hordeum vulgarae);玉米（玉蜀黍）；燕麦（Avena sativa);野茅 (orchard grass) (Dactylis glomerata);稻（Oryza sativa，包括籼稻和粳稻品种）； 高粱（Sorghum bicolor);甘鹿（甘鹿属（Saccharum)的种）；高羊茅（tall fescue) (Festuca arundinacea);草坪草（turfgrass)物种（例如 Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum);小麦（Triticum aestivum)、和苜猜（Medicago sativa)〇
[0203] 可以对经转化的植物分析感兴趣的基因的存在以及由本文中描述的嵌合转录调 节区赋予的表达水平和/或谱。本领域中的普通技术人员可使用众多用于分析经转化植物 的方法。例如，用于植物分析的方法包括Southern和Northern印迹分析、基于PCR(或其 它基于核酸扩增的方法，诸如Invader?或Taqman?测定法）的方法、生化分析、表型筛 选方法、田间评估、和免疫诊断测定法（例如用于蛋白质的检测、定位、和/或定量）。
[0204] 已经在玉米和拟南芥中证明了使用所描述的SCBV增强子的增强的基因表达， 但预期该增强子在其它植物物种中起作用，所述植物可能包括双子叶植物以及单子叶植 物。具有4个SCBV上游区拷贝的增强子元件提供了本文中研究的组合的最高表达水 平。更少或更多的上游区拷贝、以及与来自其它来源的增强子元件的组合也可以提供调 控基因表达的优点。同样的激活子、构建体和办法可能可以用于其它农作物物种，所述农 作物物种由于其基因组序列可获或正在进展中可以对其鉴定基因（包括高粱（Sorghum bicolor)、小麦(Triticum aestivum)、大麦（Hordeum vulgare)、粟（Foxtail millet) (Setaria italica)、甘鹿(Saccharum offic inarum)、巨芒(Miscanthus giganteus)), 或者可以通过后续基因组测序努力或可能的染色体同线性来对其鉴定'活化基因'（包 括燕麦（Avena sativa)、黑麦（Secale cereale)、珍珠粟（Pennisetum glaucum)、龙爪 稷（Finger millet) (Eluesine coracana)、黍稷（Proso millet) (Panicum miliaceum)、 Teff millet (Eragrostis tef))，或用于其基因组序列可获或正在进展中的模式草物种 (包括紫色假燕麦（Brachypodium distachyon)、狗尾草（Green bristlegrass) (Setaria viridis))〇
[0205] 提供以下实施例以例示某些具体特征和/或实施方案。不应将这些实施例理解为 限制本发明为所描述的具体特征或实施方案。 实施例
[0206] 实施例1
[0207] 对包含甘蔗杆状病毒（SCBV)启动子的增强子元件的序列的鉴定
[0208] 本实施例例示了对包含SCBV启动子增强子元件的序列的鉴定。
[0209] 首先通过瞬时表达测定法检查自SCBV基因组（GenBank登录号AJ277091，并由 Geijskes等，Arch. Virol.，147:2393-2404, 2002描述）衍生的启动子片段以确定该启动 子序列的哪些区域含有增强子元件序列。在启动子分析研究中，将自SCBV启动子（SEQ ID NO: 1)衍生的多个片段克隆到萤火虫荧光素酶（LUC)报告蛋白的编码区上游，所述各 片段含有从转录起始位点（定义为+1位置）-839至+106bp (质粒pSCBV839)、从-576至 +106bp (质粒pSCBV576)、以及从-333至+106bp (质粒pSCBV333)的序列。由胭脂碱合酶 (Nos) 3'UTR区的一个拷贝终止转录（如公开在GenBank登录号V00087. 1(其通过提述据此 完整并入）的碱基1847-2103以及图1中的）。通过用粒子轰击将它们转化到玉米Hi-II悬 浮细胞（在下面实施例2中有具体描述）中并监测LUC报告基因的活性来测试这些构建体 的瞬时转录活性。通过将等摩尔量的质粒DNA (含有SCBV = LUC构建体）和参照质粒的DNA 共转化来标准化各实验中的萤光素酶活性，所述参照质粒携带由驱动GUS ( β -葡糖醛酸糖 苷酶）编码区表达的玉米泛素 I (ubil)基因启动子（如公开于美国专利5, 510, 474,其通过 提述完整据此并入；基本上GenBank登录号S94464. 1的碱基7-1990,其通过提述完整据此 并入）和终止表达的玉米Per53'UTR终止子组成的构建体（如公开于美国专利6, 699, 984， 其通过提述完整据此并入；例如构建体ubil :GUS)。轰击后两天，从经转化的细胞分离总蛋 白并通过发现于例如（Maliga 等，Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)的方法来测量 LUC 酶活性 (表达为萤光素酶单位（LU)/mg蛋白）和⑶S酶活性（表达为⑶S活力单位（⑶)/μ g蛋 白）。通过将LUC水平对⑶S水平标准化为LU/mg蛋白：⑶/ μ g蛋白的比率，来比较三种 SCBV = LUC构建体中测试启动子的相对活性。瞬时测试结果显示LUC活性随着轰击的质粒 DNA浓度的增加也线性增加，提示LUC活性与转录本水平相关。进一步地，含有转录起始位 点上游-576bp至下游+106bp的序列的SCBV启动子片段具有全长启动子片段（此处定义 为含有起始位点上游_839bp至下游+106bp的序列）66% ±2%的活性。相比之下，含有 转录起始位点上游_333bp至下游+106bp的序列的SCBV启动子片段仅具有全长启动子片 段17% ±1 %的活性。因此，对应于大部分SCBV启动子活性的序列位于从转录起始位点 起-333bp的上游。
[0210] 检查了 SCBV启动子序列的能够增强异源最小启动子序列驱动的转录的部分。如 由这些实验限定的，增强子元件被操作性鉴定为短（200-300bp)的顺式作用DNA序列（缺 乏TATA盒），当在瞬时或稳定转化系统中对其进行测试时，在将其置于异源最小启动子序 列的5'附近时，以可重复且可测量的方式增加异源最小启动子的表达活性。此外，增强子 元件的串联重复比其单拷贝提供了更高的异源最小启动子表达活性水平。在本实施例中利 用的异源最小启动子元件包含玉米醇脱氢酶I(Adhl)基因启动子（对应于GenBank登录号 X04049的碱基997-1202,其通过提述完整并入本文）从-100至+106的碱基。
[0211] 将两个自SCBV启动子衍生的片段克隆到包含最小玉米Adhl启动子及与之融合的 编码区（编码萤火虫萤光素酶（LUC)蛋白）的序列的5'端，所述片段包含相对于转录起始 位点从-503至-222bp和从-758至-222bp的序列。如上文所描述的通过Nos 3' UTR终 止嵌合基因的转录。转化玉米Hi-II悬浮培养细胞，其通过用携带LUC和GUS构建体的质 粒DNA进行粒子轰击，并如上文所述测量和比较酶活性。相对于没有加入SCBV序列的最小 Adhl启动子，包含具有置于最小Adhl启动子5'端的-503至-222序列或-758至-222序 列的LUC构建体的质粒分别显示出多6倍和多4倍的LUC活性。因此，在SCBV启动子的这 些片段中的序列增强了由异源玉米启动子介导的转录活性。
[0212] 通过将-502至_222bp序列的1个、2个或4个拷贝克隆到融合于LUC编码区的最 小玉米Adhl启动子5'端来测试-503至-222bp SCBV增强子区的多拷贝增加由最小Adhl 启动子介导的表达的能力（图3A)。将携带该构建体（以及具有参照ubil:GUS构建体的 质粒DNA)的质粒DNA轰击到玉米Hi-II悬浮培养细胞中，并如上文所述测量和比较LUC和 GUS活性。相对于用缺乏SCBV增强子序列的类似的最小Adhl启动子构建体轰击的细胞，用 含有SCBV增强子序列的1个、2个或4个拷贝的构建体轰击的细胞分别具有超过5倍、6倍 和10倍更多的LUC活性（图3B)。
[0213] 包含SCBV启动子（如SEQ ID NO: 1中提供的）的-502至-222bp的核酸碱基编 码转录活化活性，该活性赋予植物启动子更好的表达属性。进一步地，通过堆积包含SCBV 启动子（如SEQ ID NO: 1中提供的）的-502至-222bp的碱基的多个串联拷贝来增加转录 活化活性。再进一步地，还可以进一步检查和利用本文中提供的方法和试剂来提供保持转 录活化活性的更短的序列，或者可以在新的组合中与其它转录激活子元件和植物启动子组 合。
[0214] 实施例2
[0215] 玉米Hi-II悬浮培养细胞中SCBV = LUC和ubl:⑶S构建体的瞬时表达测试
[0216] 本实施例描述了玉米Hi-II悬浮培养细胞中SCBV = LUC和ubl:⑶S构建体的瞬时 表达测试。
[0217] 通过用按上文所描述的构建的携带LUC和⑶S构建体的质粒DNA进 行粒子轰击转化玉米Hi-II悬浮培养细胞（Armstrong等，]\&^666]161:.(]〇〇卩· Newslett. ,65:92-93, 1991)，并测量和比较酶活性。使用QiAfilter?质粒Maxi试剂盒 (Qiagen, Germantown, Maryland)来大量制备质粒DNA，并使用标准的分子方法来分析其数 量和质量。
[0218] 用于轰击的玉米Hi-II悬浮培养细朐的制各.在H9CP+培养某中于28°C在黑暗 中，在125rpm的振荡器上维持Hi-II细胞（H9CP培养基由以下组成：MS盐4. 3gm/L、蔗糖 3%、酪蛋白氨基酸 200mg/L、肌醇 100mg/L、2,4-D 2mg/L、NAA 2mg/L、1000X MS 维生素 ImL/ L、L-脑氨酸 700mg/L、和椰子汁（coconut water) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 62. 5mL/ L，pH 6.0)。在轰击前，将2日龄的Hi-II培养物转移到G-N6培养基（CHU N6培养基 3. 98g/L、CHU N6 维生素 lmL/L (两种 CHU 组分都来自 PhytoTechnology Laboratories?, 1^1^^&，1?)、肌醇10011^/1、2,4-0 211^/1和蔗糖3%，？!16.0)中并允许其生长24小时。在 轰击当日，将G-N6生长的细胞（2. 5gm细胞）转移到置于G-N6培养基（含有0. 5M D-山梨 糖醇和0. 5M D-甘露醇）上的无菌Whatman No. 1滤纸盘（55mm)，并温育4小时。使用经渗 透调节过的细胞进行轰击。
[0219] 具有质粒DNA的金颗粒的制各和轰击测定法.用70%乙醇清洗金颗粒（1 μ m直 径，BioRad，Hercules，CA) 10分钟，然后用无菌水清洗3次。将颗粒以120mg/mL的浓度分 散到50%甘油中。对于一个典型实验，将15(^1^(1811^)金颗粒、约5以8质粒0嫩、15(^1^ 2. 5M CaC12、和30 μ L 0. 2M亚精胺组合起来。在室温将反应（总体积375 μ L)温育10分 钟，偶尔温和搅动。将DNA包被的金颗粒短暂离心、用420 μ L 70%乙醇清洗，随后用420 μ L 100%乙醇清洗。将最终的离心沉淀重悬于110 μ L 100%乙醇中并用Branson 1450超声 波仪进行简单的超声处理（3次各3秒的脉冲，每次脉冲之间为1分钟）。将用DNA包被的 金颗粒的12. 2 μ L等分试样散布到9个巨载体（macrocarrier) (BioRad, Hercules, CA)的 每一个上，并在使用BioRad roSlOOO/He系统的轰击测定法中使用。使用3510psi盘以靶 距离9cm转化悬浮培养细胞，并且每个板轰击3次。在轰击后，将细胞在黑暗中于28°C温 育，首先在含有D-山梨糖醇和D-甘露醇培养基的G-N6上温育12小时，接着在G-N6板上 再温育36小时。从板上收集细胞，吸干以除去缓冲液，并用300 μ L 2x CCLT LUC提取缓冲 液（Promega Corporation, Madison, WI)提取。离心后，收集约600 μ L蛋白质提取物。使 用Bradford测定法估算蛋白质浓度。
[0220] 测量LUC酶活性（表示为萤光素酶单位（LU)/mg蛋白）和GUS酶活性（表示为 GUS 活力单位（GU)/yg 蛋白），其通过在例如 Maliga 等（Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)中 记载的方法。通过将LUC水平对GUS水平标准化为LUC/mg蛋白：GUS/yg蛋白的比率来比 较SCBV = LUC构建体中测试启动子的相对活性。
[0221] 实施例3
[0222] 用于玉米植物中激活标签化的质粒
[0223] 本实施例描述了土壤杆菌超二元质粒的生成。
[0224] 超二元系统是土壤杆菌穿梭载体/同源重组系统的一个特殊化的例子（Komari 等，Meth. Mol. Biol. 343:15-41，2006, Komari 等，Plant Physiol. 114:1155-1160, 2007 ;还 参见欧洲专利No. EP604662B1和美国专利7, 060, 876,各通过提述完整并入）。与超二元系 统一起采用的根癌土壤杆菌宿主菌株是LBA4404 (pSBl)。菌株LBA4404 (pSBl)携带两个独 立复制的质粒PAL4404和pSBl。pAL4404是Ti质粒衍生的辅助质粒，其含有完整的vir基 因集（来自Ti质粒pTiACH5)，但不具有T-DNA区（且因此不具有T-DNA左边界和右边界 重复序列）。质粒pSBl供应了自pTiBo542衍生的另一 vir基因部分集。在超_兀系统中 使用的穿梭载体的一个例子是PSB11，其含有被T-DNA右边界和左边界重复区侧翼的克隆 多接头，该克隆多接头充当预定用于植物细胞转化的基因的引入位点。穿梭载体PSBll不 能在土壤杆菌中独立复制,但在经由PSBl和pSBll上存在的共有序列之间的同源重组整合 到pSBl中时作为共整合质粒稳定维持在土壤杆菌中。由此，通过自两种不同的土壤杆菌Ti 质粒来源（pTiACH5和pTiBo542)衍生的Vir蛋白有效地作用于经修饰的pSBll载体上的 LBA4404(pSBl)中引入的完全修饰过的T-DNA区，并将其转移到植物细胞中。已经证明超二 元系统在单子叶植物物种的转化中特别有用（参见Hiei等，Plant J. 6:271-282,1994,和 Ishida 等，Nat. Biotechnol. 14:745-750, 1996)。
[0225] 用于生成经激活标签化的玉米植物的转化质粒可以包括通过超二元质粒pSBl 和pEPP1088(具有pSBll载体骨架）之间的同源重组形成的共整合质粒（参见欧洲专 利No. EP604662B1和美国专利7060876,各通过提述据此并入）。所述共整合质粒被称为 pSBl: :pEPP1088或ZeaTAG载体。pEPP1088的结构由限制酶分析和对构建体的选定区域 的DNA序列测定验证。例示pEPP1088的相关特征的结构图在图3中给出。pEPP1088在 T-DNA左边界（LB)和右序列（RB)序列（由pSBll质粒提供）之间的位置处含有上文所描 述的-502至-222bpSCBV增强子序列的4个拷贝以及可选择的标志基因，其由以下构成：稻 (Oryza sativa)肌动蛋白基因启动子和相关的第1内含子和5'UTR(基本如GenBank登录 号EU155408. 1的碱基12-1411所公开的，其通过提述完整据此并入）、AAD-1除草剂耐受蛋 白的编码序列（如美国专利申请No. 20090093366中公开的）、和来自玉米脂肪酶的3' UTR 终止序列（基本如GenBank登录号gb I L35913. I lMZELIPASE的碱基921-1277和美国专利 7, 179, 902中所公开的，其通过提述完整据此并入）。
[0226] pEPP1088的T-DNA(且如存在于pSBl: :pEPP1088中的）在通过土壤杆菌介导的 转化引入玉米细胞中时整合到玉米染色体中的随机位置处。对经转化的玉米细胞的选择由 T-DNA中的组成性表达的AADl可选择标志基因提供。携带强力的-502至-222bp SCBV转 录增强子激活子元件的串联拷贝的T-DNA导致整合位点附近天然基因的异常表达，由此在 一些情况中，为从经转化的组织再生的植物提供了新的可鉴定的性状。存在帮助对受体位 点附近受影响的基因进行分离和鉴定的现代分子生物学方法，由此为分离的基因用于进一 步开发提供了条件。
[0227] 实施例4
[0228] 土壤杆菌介导的玉米转化
[0229] 本实施例描述了土壤杆菌介导的玉米转化的生成。
[0230] 未成熟胚的生成.将来自B104近交系的种子种植到含有Sunshine Custom Blend? 160 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA)的 4 加仑罐中。使用高压钠和金属齒 化物灯与16:8小时光照：黑暗光周期的组合，使植物在温室中生长。为了获得用于转化的 未成熟的胚，实施受控的近缘授粉。在授粉后10-13天当胚大小为约I. 4-2. Omm时，分离未 成熟的胚。
[0231] 感染和共培养.通过将玉米穗浸没到有Tween 20 (每500mL 1或2滴）的50 %商 品化漂白剂中10分钟，并用无菌水漂洗3次对其进行表面消毒。将在YEP固体培养基（含 有50mg/L壮观霉素、lOmg/L利福平、和50mg/L链霉素）上于28°C生长3天或于25°C生长4 天的细菌取1或2个菌环转移到含有100 μ M乙酰丁香酮的5mL液体感染培养基（MS盐、ISU 修改的MS维生素、3. 3mg/L麦草畏、68. 4gm/L鹿糖、36gm/L葡萄糖、700mg/L L-脯氨酸，pH 5.2)中，来制备含有超二元载体共整合质粒的土壤杆菌细胞的悬浮液。使用无菌5mL移液 管温和地吹打该溶液，直到得到均匀的悬浮液，并将浓度调节到使用Ultrospec 10细胞密 度仪（GE Healthcare/Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)在 600nm 处（0D600)测量 的光密度为〇. 3-0. 5。将未成熟的胚直接分离到含有2mL感染培养基的微离心管中。除 去培养基并用l_2mL新鲜的感染培养基替换2次，然后将其除去并用I. 5mL 土壤杆菌溶 液替换。将土壤杆菌和胚溶液在室温温育5分钟并转移到共培养培养基中，该培养基含 有MS盐、ISU修改的MS维生素、3. 3mg/L麦草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、IOOmg/ L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解产物、15mg/L AgN03、100yM乙酰丁香酮、和2. 3-3gm/L Gelzan?(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)，pH 5. 8。共培养温育在黑暗下或在24小时白荧光 光照条件（约50 μ EnT2s-1)下于25°C进行3-4天。
[0232] 静息和选择.共培养后，将胚转移到无选择的基于MS的静息培养基中，该培养基 含有MS盐、ISU修改的MS维生素、3. 3mg/L麦草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、IOOmg/ L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解产物、15mg/LAgN03、0. 5gm/L MES(2-(N-吗啉）乙磺酸一 水合物(ethanesulfonic acid monohydrate) ；PhytoTechnologies Labr. , Lenexa, KS) > 250mg/L羧苄青霉素、和2.3gm/L GelzanTM，pH 5.8。温育在黑暗下或在24小时的白荧光光 照条件（约50 μ EnT2iT1)下于28°C进行7天。在7日静息期后，将胚转移到选择性培养基中。 为了选出经超二元质粒（含有植物可表达的AADl可选择标志基因）转化的玉米组织，使用 补充有氟吡氯禾灵（Haloxyfop)的基于MS的静息培养基（如上）。将胚首先转移到含有 IOOnM氟吡氯禾灵的选择培养基中并温育1-2周，然后转移到含有500nM氟吡氯禾灵的选择 培养基中并再温育2-4周。经过在黑暗下或在24小时白荧光光照条件下（约50 μ EnT2iT1) 于28°C约5-8周的过程，获得经转化的分离株。通过将回收的分离株每隔1-2周转移到新 鲜的选择培养基中使其壮大，以用于再生和进一步分析。
[0233] 玉米转化领域中的技术人员会理解当使用其它的植物可表达的、可选择的标志基 因（例如除草剂耐受基因）时有其它选择经转化的植物的方法可供使用。
[0234] 预再生.在选择过程后，将暴露于24小时光照方案的培养物转移到基于MS的预 再生培养基中，该培养基含有MS盐、ISU修改的MS维生素、45gm/L蔗糖、350mg/L L-脯氨 酸、100mg/L 肌醇、50mg/L 酪蛋白酶促水解产物、lmg/L AgN03、0. 25gm/L MES、0. 5mg/L 萘 乙酸、2.5mg/L脱落酸、lmg/L 6-节氨基噪呤、250mg/L羧节青霉素、2.5gm/L Gelzan?、和 500nM氟吡氯禾灵，pH 5. 8。在24小时白荧光光照条件（约50 μ EnT2s-1)下于28°C持续温 育7天。
[0235] 再生和小植株分离.为了再生，将培养物转移到基于MS的第一再生培养基中，该 培养基含有MS盐、ISU修改的MS维生素、60gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、125mg/L羧苄青霉素、 2. 5gm/L Gelzan?、和500nM氟吡氯禾灵，pH 5. 8。在黑暗下或在24小时白荧光光照条件 (约δΟμΕπΓ2^)下于28°C 2周后，将组织转移到基于MS的第二再生培养基中，该培养基 由以下构成：MS盐、ISU修改的MS维生素、30gm/L鹿糖、100mg/L肌醇、3gm/L Gelzan?, pH 5. 8(有或无500nM氟吡氯禾灵）。再生/选择在16小时或24小时白荧光光照条件（约 50 μ EnT2iT1)下于28°C持续2周。当小植株长度达到3-5cm时，将它们切下并转移到第二再 生培养基（如上，但无氟吡氯禾灵）中，并在16小时白荧光光照条件（约δΟμΕπΓ2^)下于 25°C温育以允许芽和根的进一步生长和发育。
[0236] 种子生成.将植物移植到Metro-Mix? 360无土生长培养基（Sun Gro Horticulture)中并在生长室中使其长壮（harden off)。然后将植物移植到Sunshine Custom Blend 160 土壤混合物中并在温室中生长至开花。进行受控的授粉以用于种子生 成。
[0237] 实施例5
[0238] 稳定转化的玉米细胞中的SCBV增强子活性
[0239] 从自经转化的B104未成熟胚再生的10株Ttl植物分离出基因组DNA (Qiagen DNeasy植物Mini试剂盒；Qiagen, Germantown, Maryland),并通过反向PCR克隆和对 由反向PCR扩增的产物进行DNA测序来测定整合的T-DNA (从pSBI: : pEPP 1088转移） 的基因组位置。通过使用侧翼序列作为查询序列的BLAST搜索（Altschul等，J.Mol. Biol.，215:403-410,和 Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990)，确定 位于4xSCBV增强子的IOkb内的侧翼编码区所代表的基因的身份。对BLAST结果的分析揭 示，T-DNA(因此4XSCBV增强子亦然）在10个系的每一个中都被整合到不同的基因组位置， 且因此4XSCBV增强子在每个系中都被不同的基因侧翼（表1)。
[0240] 从10个Ttl系的叶组织中分离出总RNA (Qiagen RNeasy植物Mini试剂 盒，Qiagen, Germantown, Maryland)。通过使用针对侧翼于4XSCBV增强子的相关基因的特 异性引物进行逆转录和RT-PCR(实时PCR)，在合适的T tl植物和未经转化的对照植物之间比 较鉴定的侧翼基因的转录本累积。作为对照，还测定了内源GAPDH基因的转录本累积。
[0241] RT-PCR产物揭示这些系中来源于3个不同的侧翼基因的转录本的累积增加了。 4XSCBV增强子在2个Ttl系中位于受影响的侧翼基因的上游2. 6kb和2. 8kb，在第3个Ttl 系中位于受影响的侧翼基因的下游478bp。由此，这些结果指示由T-DNA投递的4XSCBV 增强子导致整合位点附近基因转录本的不依赖于链的、增加的累积（strand-independent increased accumulation)。表1指示了鉴定出的侧翼基因和对其转录水平的分析结果。
[0242] 表I. 4XSCBV增强子对10株TO植物中侧翼基因的RNA累积的影响。
[0243]
【权利要求】
1. 一种嵌合转录调节区，包含： 显示在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中的甘蔗杆状病毒（SCBV)增强子元件或 其同源物的一个或多个拷贝；和 与其可操作地连接的、从植物种子特异性基因的上游区获得的启动子，所述启动子包 含RNA聚合酶结合位点和mRNA启动位点， 其中当在所述嵌合转录调节区的调节性控制下转录目的核苷酸序列时，转录产物的量 相比于用包含所述启动子但不包含所述SCBV增强子序列的嵌合转录调节区所获得的转录 广物的量提1?。
2. 权利要求1的启动子，其中该启动子是从Lesquerella fendleri 3-酮脂酰辅酶A 种子特异性基因的上游区获得的。
3. 权利要求1的核苷酸序列，其中该核苷酸序列为脂肪酸修饰性核苷酸序列。
4. 权利要求3的脂肪酸修饰性核苷酸序列，其由构巢曲霉（Aspergillus nidulans)酰 基辅酶A A 9去饱和酶核苷酸序列组成。
5. -种构建体，其包含：权利要求1的嵌合转录调节区，所述转录调节区可操作地连接 于可转录的多核苷酸分子，所述可转录的多核苷酸分子可操作地连接于3'转录终止多核苷 酸分子。
6. 权利要求5的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子对其中表达所述多核苷酸分 子的植物赋予农艺性状。
7. 权利要求5的构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子对其中表达该多核苷酸分子 的植物赋予增值性状或油脂修饰性状。
8. 用权利要求5的构建体稳定转化的转基因植物。
9. 权利要求8的转基因植物，其中所述可转录的多核苷酸分子对其中表达该多核苷酸 分子的植物赋予农艺性状。
10. 权利要求8的转基因植物，其中所述可转录的多核苷酸分子对所述植物赋予增值 性状或油脂修饰性状。
11. 权利要求8的转基因植物的种子，其中所述种子包含权利要求5的构建体。
12. 权利要求8的转基因植物，该植物是拟南芥（Arabidopsis Thaliana)植物。
13. 包含权利要求1的嵌合转录调节区的转基因植物细胞。
14. 一种生成转基因植物的方法，包括用权利要求5的构建体来转化植物细胞或组织。
15. 权利要求14的方法，其中所述转基因植物是双子叶植物。
16. 权利要求14的方法，其中所述转基因植物是单子叶植物。
17. 用权利要求5的构建体转化的植物细胞或组织。
18. 权利要求17的植物细胞或组织，其中所述植物细胞或组织来自双子叶植物。
19. 权利要求17的植物细胞或组织，其中所述植物细胞或组织来源于单子叶植物。
20. 可以从权利要求8的转基因植物获得的植物细胞、果实、叶、根、芽、花、种子、插条、 和其它可用在有性或无性繁殖中的繁殖材料、包括F1杂交种的后代植物、雄性不育植物和 所有其它植物及植物产物。
21. -种拟南芥植物细胞、组织或植物，其包含显示于SEQ ID NO: 1的位置337至位置 618中的甘蔗杆状病毒（SCBV)增强子元件或其同源物的4个拷贝，其中所述SCBV增强子元 件的4个拷贝插入到所述拟南芥植物细胞、组织或植物的基因组中。
22. 权利要求21的拟南芥植物细胞、组织或植物，其中所述SCBV增强子元件对在该 SCBV增强子调节性控制下的目的核苷酸序列赋予增强的转录，所述增强的转录是与不存在 SCBV增强子时该目的核苷酸序列的转录相比而言的。
23. -种增强目的核苷酸序列的转录的方法，包括： 将包含SEQ ID NO: 2的DNA构建体转化到拟南芥植物的基因组中；和 在所述植物的种子中表达所述DNA构建体，从而在该种子中产生修饰的脂肪酸谱。
24. 权利要求23的方法，其中所述修饰的脂肪酸谱包括饱和脂肪酸百分比的降低。
25. 权利要求23的方法，其中所述DNA构建体包含SCBV增强子元件的4个拷贝、从 Lesquerella fendleri 3-酮脂酰辅酶A种子特异性基因的上游区获得的启动子、构巢曲 霉酰基辅酶A A 9去饱和酶核苷酸序列、和根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)开 放阅读框233'非翻译区。
26. 权利要求23的转化方法，其中转化包括根癌土壤杆菌介导的花序浸渍。
27. 权利要求23的表达方法，其中表达包括种子特异性表达。
【文档编号】C12N15/82GK104411827SQ201380021781
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】P·A·欧文斯默洛, C·拉森, S·A·贝文, J·P·戴维斯, V·S·雷迪, W·M·安利, M·A·汤普森 申请人:陶氏益农公司