白细胞介素-3多肽结合物和其用途

白细胞介素-3多肽结合物和其用途
【专利摘要】本发明提供靶向白细胞介素-3受体表达细胞的方法，具体地说，通过使用结合到毒素的白细胞介素-3(IL-3)变异体来抑制所述细胞生长，所述毒素将影响表达白细胞介素-3受体的细胞。还揭示包含一或多个非天然编码氨基酸的白细胞介素-3(IL-3)变异体，和非天然编码氨基酸的结构。
【专利说明】白细胞介素-3多肽结合物和其用途

【技术领域】
[0001] 本发明提供靶向白细胞介素_3受体表达细胞，并且具体地说，通过使用结合到毒 素的白细胞介素-3(IL-3)变异体来抑制所述细胞生长方法，所述毒素将影响表达白细胞 介素-3受体的细胞。

【背景技术】
[0002] 癌症是最显著健康病状中的一种。2003年美国癌症协会癌症事实和数据 (American Cancer Society's Cancer Facts and Figures)预测今年将有 130万美国人接 受癌症诊断。在美国，癌症的死亡率仅次于心脏病而排名第二，每4起死亡中便有一例。在 2002年，美国国家卫生研究院（National Institutes of Health)估算癌症的全部花费总 共是1716亿美元，其中610亿美元是直接花费。普遍预测癌症的发病率将随美国人口老龄 化而提高，从而进一步加强这一病状的影响。在1970年代和1980年代确立的癌症现有治 疗方案并未显著变化。在用于最晚期状态的常见癌症时，这些治疗，包括化学疗法、辐射和 其它形态（包括更新型的靶向疗法），显示有限的整体存活效益，因为这些疗法尤其主要靶 向肿瘤块。
[0003] 更确切地说，迄今为止的常规癌症诊断和疗法均尝试选择性地检测和根除极快速 生长的赘生性细胞（即形成肿瘤块的细胞）。标准肿瘤学方案通常主要经设计以在无不当 毒性的情况下投与最高剂量的辐射或化学治疗剂，即通常称为"最大耐受剂量"(MTD)或"无 明显副作用水平"（N0AEL)。许多常规癌症化学疗法（例如烷基化剂（如环磷酰胺）、抗代 谢剂（如5-氟尿嘧啶）以及植物碱（如长春新碱））和常规辐射疗法主要通过干扰与细胞 生长和DNA复制有关的细胞机制来对癌细胞发挥其毒性作用。化学疗法方案通常还涉及投 与化学治疗剂的组合以试图提高治疗功效。与多种化学治疗剂的可用性无关，这些疗法具 有许多缺陷（参见例如斯托克代尔（Stockdale)，1998，"癌症患者管理准则（Principles Of Cancer Patient Management)，'，美国医学科学（Scientific American Medicine),第 3卷，罗本斯特恩（Rubenstein)和费德尔曼（Federman)编，第12章，第X节）。例如， 化学治疗剂由于对快速生长细胞（无论正常或恶性）的非特异性副作用而具有极大毒性； 例如化学治疗剂引起显著并且通常危险的副作用，包括骨髓细胞减少、免疫抑制以及胃肠 道疼痛等。
[0004] 其它类型的传统癌症疗法包括手术、激素疗法、免疫疗法、抗血管生成疗法、靶 向疗法（例如针对癌症目标的疗法，如Glcevec?和其它酪氨酸激酶抑制剂、VdcadcR、 SutenLii等）以及辐射治疗，用于根除患者的赘生性细胞（参见例如斯托克代尔，1998，"癌 症患者管理准则"，美国医学科学，第3卷，罗本斯特恩和费德尔曼编，第12章，第IV 节）。所有这些方法在用于患者时可以造成显著缺陷，包括功效不足（就长期结果而言（例 如由于未能靶向癌症干细胞）和毒性（例如由于对正常组织的非特异性作用））。因此，需 要用于改良癌症患者的长期前景的新疗法。
[0005] 癌症干细胞
[0006] 癌症干细胞包含肿瘤的独特子群（通常约0. 1% -10% )，其与其余的约90 %肿瘤 (即肿瘤块）相比致瘤性更高、相对更缓慢生长或处于静态并且通常与肿瘤块相比化学抗 性更高。鉴于常规疗法和方案通常经设计以快速攻击增殖细胞（即包含肿瘤块的癌细胞）， 通常缓慢生长的癌症干细胞可能比更快生长的肿瘤块对常规疗法和方案的抗性更高。癌症 干细胞可以表现其它特征，所述其它特征使其相对具有化学抗性，如更高的抗药性和抗凋 亡路径。前述内容将构成标准肿瘤学治疗方案在大部分晚期癌症患者中无法确保长期效益 的关键原因-即无法充分靶向和根除癌症干细胞。在一些情况下，癌症干细胞是肿瘤的奠 基细胞（即其是包含肿瘤块的癌细胞的祖细胞）。
[0007] 已经在多种癌症类型中发现癌症干细胞。例如，贝奈特（Bonnet)等人能够使 用流动式细胞测量术分离出携带特异性表型CD34+CD38-的白血病细胞，并且接着证明 这些细胞（对于既定白血病，包含〈1% )与其余的99+%白血病主体不同，其在传递到 免疫缺陷小鼠中时能够在其衍生时复制白血病。参见例如"人类急性骨髓白血病发展 成起源于原始造血细胞的层次（Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell) "，自然医学（Nat. Med. )，3:730-737(1997)。也就是说，在10, 000个白血病细胞中发现〈1个这些癌症干细 胞，但这一低频率群体能够在与原始肿瘤中相同的组织学表型情况下引起人类白血病并且 将其连续转移到严重的组合免疫缺乏/非肥胖性糖尿病（N0D/SCID)小鼠中。
[0008] 考克斯（Cox)等人发现人类急性淋巴母细胞白血病（ALL)细胞的小型子部 分，其具有表型⑶347⑶ΚΓ和⑶347⑶19_并且能够在免疫功能不全小鼠中移植ALL 肿瘤，即癌症干细胞。相反，在一些情况下，使用ALL主体即使注射10倍更多的细胞 也没有观测到小鼠的移植。参见考克斯等人，"急性淋巴母细胞白血病祖细胞的表征 (Characterization of acute lymphoblastic leukemia progenitor cells)，'，血液 (Blood) 104(19):2919-2925 (2004)。
[0009] 发现多发性骨髓瘤含有细胞的小型子群，其是CD138-并且与CD138+骨髓瘤细 胞的大型主体群体相比具有更大的克隆源性和致瘤潜力。参见松井（Matsui)等人，"克 隆源性多发性骨髓瘤细胞的表征（Characterization of clonogenic multiple myeloma cells)"，血液学103(6) :2332。作者总结出多发性骨髓瘤的⑶138-子群是癌症干细胞群 体。
[0010] 近藤（Kondo)等人从C6-神经胶瘤细胞系分离出小型细胞群体，其借助于其在免 疫功能不全小鼠中自我更新和复制神经胶质瘤的能力而被鉴别成癌症干细胞群体。参见 近藤等人，"C6神经胶瘤细胞系中癌症类干细胞的小型群体的持续性（Persistence of a small population of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line)，'，美国 科学院院刊（Proc. Natl. Acad, Sci. USA), 101:781-786(2004)。在这一研究中，近藤等人测 定癌细胞系含有癌症干细胞群体，其提供癌细胞系移植免疫缺陷小鼠的能力。
[0011] 证实乳癌含有具有干细胞特征（携带表面标记⑶44+⑶24lin)的小型细胞群体。参 见艾尔-哈吉（Al-Hajj)等人，"致瘤乳癌细胞的前瞻性识别（Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells)"，美国国家科学院院刊 100:3983-3988(2003)。 这些细胞中只有200个细胞（对应于全部肿瘤细胞群体的1-10% )能够在N0D/SCID小鼠 中形成肿瘤。相比之下，植入20, 000个缺乏这一表型（即肿瘤块）的细胞不能使肿瘤重新 生长。
[0012] 发现来源于人类前列腺肿瘤的细胞的子群可以自我更新和复制出衍生其的前列 腺肿瘤的表型，从而构成前列腺癌干细胞群体。参见柯林斯（Collins)等人，"致瘤前列腺 癌干细胞的前瞻性识别（Prospective Identification of Tumorigenic Prostate Cancer Stem Cells)"，癌症研究（Cancer Res) 65 (23) :10946-10951 (2005)。
[0013] 方（Fang)等人从具有癌症干细胞属性的黑素瘤分离出细胞子群。具体地说，这 一细胞子群可以分化和自我更新。在培养物中，子群形成球状物，而来自病灶的更多的分 化细胞部分的附着性更高。另外，当移植到小鼠中时，含有球状细胞的子群比附着细胞 的致瘤性更高。参见方等人，"黑色素瘤中具有干细胞属性的致瘤子群（A Tumorigenic Subpopulation with Stem Cell Properties in Melanomas)" 癌症研究65(20); 9328-9337(2005)〇
[0014] 辛格（Singh)等人发现脑肿瘤干细胞。当分离并且移植到裸小鼠中时，与⑶133 肿瘤块细胞不同，CD133+癌症干细胞形成肿瘤，其可接着连续移植。参见辛格等人，"人 类脑肿瘤引发细胞的识别（Identification of human brain tumor initiating cells)"， 自然（Nature) 432:396-401 (2004);辛格等人，"神经系统肿瘤中的癌症干细胞（Cancer stem cells in nervous system tumors)"，癌基因（0ncogene)23:7267_7273(2004);辛 格等人，"人类脑肿瘤中癌症干细胞的识别（Identification of a cancer stem cell in human brain tumors)"，癌症研究 63:5821-5828 (2003)。
[0015] 因为常规癌症疗法靶向快速增殖细胞（即形成肿瘤块的细胞），相信这些治疗在 靶向和破坏癌症干细胞方面效率相对较低。实际上，已证实癌症干细胞，包括白血病干细胞 对常规化学治疗疗法（例如Ara-c、道诺霉素（daunorubicin))以及较新的靶向疗法（例如 Gieevee?、Veleade? )相对具有抗性。
[0016] 例如，白血病干细胞相对缓慢生长或处于静态、表达多药抗性基因并且利用 其它抗凋亡机制--有助于其化学抗性的特征。参见乔丹（Jordan)等人，"靶向最致 命细胞：探讨白血病疗法作为干细胞生物学中的问题（Targeting the most critical cells:approaching leukemia therapy as a problem in stem cell biology)，'，自然临 床实践肿瘤学（Nat. Clin. Pract. Oncol), 2:224-225(2005)。另外，癌症干细胞借助于其化 学抗性而可以促成治疗失效，并且还可以在临床缓解之后在患者中保持，并且这些残余癌 症干细胞因此可以造成在日后的复发。参见贝胡德（Behbood)等人，"癌症干细胞是否将 提供新的治疗目标？（Will cancer stem cells provide new therapeutictargets?) "， 癌发生学（癌发生）26(4):703-711(2004)。因此，预期靶向癌症干细胞可以为癌症患者提 供改良的长期结果。因此，需要经设计以靶向癌症干细胞的新型治疗剂和/或方案实现这 一目标。
[0017] 急性骨髓白血病
[0018] 在美国、加拿大和欧洲，每年约4万名患者患上急性骨髓白血病（AML)。参见例 如哈马尔（Jamal)等人，癌症统计学（Cancer Statisitics) 56 :106-130(2006)。AML 是 成人中最常见的白血病并且是儿童中第二常见的白血病。与治疗和并发症有关的住院 期延长代表这些领域中的显著卫生保健成本共用。另外，即使使用组合诱导和合并化学 疗法，大部分患者最终仍复发并且由于其疾病或治疗之并发症而死亡。参见例如布鲁恩 (Brune)等人，"急性骨髓白血病中通过组胺二盐酸盐和白细胞介素-2改良的合并免 疫疗法后的无白血病存活：随机III期试验的结果（Improved leukemia-free survival after post-consolidation immunotherapy with histamine dihydrochloride and interleukin-2in acute myeloid leukemia:results of a randomized phase III trial)"，血液学108(1) :88-96 (2006)。急需新颖疗法。AML细胞干细胞的选择性靶向可 以提供安全和更有效的疗法。
[0019] 骨髓发育不良综合症
[0020] 在美国，每年有约20, 000例骨髓发育不良综合症（MDS)新病例。骨髓发育不良 综合症患者典型地在红血球、白血球和血小板中的至少一种或多种方面具有低血液细胞计 数。在检查时，通常发现骨髓发育异常或增生，意谓骨髓中存在太多的功能不全的血液干细 胞。少数MDS患者具有发育不全骨髓，意谓骨髓中的血液干细胞过少，使得疾病与再生障碍 性贫血看起来类似。近一半的MDS患者在诊断时无症状。当病征和症状出现时，其可包括 贫血、虚弱、疲劳、头痛、皮下出血、出血增加、疹子、发热、口疮和拖延性疾病。MDS在年长人 群中的发生频率增加，但其也可在儿童中发生。在不到三分之一的患者中,MDS随时间推移 而发展变成急性白血病。平均诊断年龄是70岁。取决于MDS的类型、患者病史以及年龄和 耐受某些治疗方案的能力，MDS的治疗可以显著不同。治疗选项包括支持性护理、化学疗法 相关药剂以及干细胞移植（其典型地仅在50岁以下的患者中使用）。但是，现有治疗的缓 解率相对较低，并且需要新疗法。
[0021] 白细胞介素-3
[0022] 白细胞介素-3(IL_3)是一种细胞激素，其支持多潜力和定型骨髓和淋巴祖 细胞的增殖和分化。参见例如尼兹切（Nitsche)等人"白细胞介素-3在N0D/SCID 小鼠中促进人类造血干细胞的增殖和分化，但降低其再增殖潜力"，干细胞（Stem Cells)21:236-244(2003)。人类白细胞介素-3通过结合于人类IL-3受体而介导其作 用，人类IL-3受体是杂二聚结构并且由IL-3结合α -子单元和β -子单元组成。α子 单元为配位体结合所必需并且赋予受体特异性。β子单元也由粒细胞巨噬细胞-群落刺 激因子（GM-CSF)和IL-5受体共用，并且为高亲和力配位体结合和信号转导所需。IL-3 的结合引起α-受体子单元和β-受体子单元的杂二聚化。与某些正常造血细胞相比， IL-3受体在多种血液癌症（包括AML、B细胞急性淋巴球性白血病（B-ALL)、毛状细胞白 血病、霍奇金氏病（Hodgkin's disease)以及某些侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤（aggressive non-Hodgkin，s lymphomas)(穆诺兹（Munoz),血液学（Haematologica)86:1261-1269, 2 001 ;罗西妮（Riccioni),淋巴瘤（Leuk Lymphoma)46:303_311，2005;特斯塔（Testa),白 血病（Leukemia) 18:219-226, 2004))以及AML的癌症干细胞、骨髓发育不良综合症（MDS)、 T细胞ALL(T-ALL)和慢性骨髓白血病（CML)(参见乔丹等人"白细胞介素-3受体α链 是人类急性骨髓性白血病干细胞的独特标记（The interleukin_3receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells)，'，白血病 14:1777-1784(2000);弗洛里安（Florian)等人"不同骨髓恶性病中CD34+/CD38-干细胞 表面上分子目标的检测（Detection of molecular targets on the surface ofCD34+/ CD38_stem cells in various myeloid malignancies)" 淋巴瘤 47:207-222(2006);莱尔 米特（Lhermitte)等人"大部分未成熟T-ALL表达Ra-IL3(CD123) :DT-IL3#疗法的可能目 标（Most immatureT-ALLs express Ra_IL3(CD123):possible target for DT-IL3#ther apy)"，20:1908-1910 (2006);和赫格（Hogge)等人"具有增加的受体亲和力的变异型白喉 毒素-白细胞介素-3结合物具有增强的针对急性骨髓白血病祖细胞的细胞毒性（Variant Diphtheria Toxin-Interleukin-3Conjugates with Increased Receptor Affinity Have Enhanced Cytotoxicity against Acute Myeloid Leukemia Progenitors)，'，临床癌症石开 究（Clin. Caner Res. ) 12:1284-1291 (2004))中过度表达。
[0023] 最近，已经报导蛋白质科学中的全新技术，其能够克服与蛋白质的位点特异性 修饰和重组型细胞因子的结合相关的多种局限性。具体地说，已将新的组分加入到原核 生物大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli)(例如参见 L.王（L. Wang)等人，（2001)， 科学（Science) 292:498-500)和真核生物酿酒酵母菌（Sacchromyces cerevisia， S. cerevisiae)(例如J.秦（J. Chin)等人，科学301:964-7 (2003))的蛋白质生物合成机 器中，使得所述机器能够在活体内将非基因编码氨基酸并入蛋白质中。已经使用此方法将 多种具有新颖化学、物理或生物学特性的新氨基酸，包括光亲和力分类和可光异构化氨基 酸、光交联氨基酸（参见例如J. W.秦等人(2002)美国国家科学院院刊,99:11020-11024 ； 和J. W.秦等人，(2002)美国化学学会杂志（T. Am. Chem. Soc.) 124:9026-9027)、酮氨基 酸、含有重原子氨基酸和糖基化氨基酸有效地且高保真地并入大肠杆菌中和酵母中响应 于琥珀密码子（TAG)的蛋白质中。参见例如J.W.秦等人，(2002),美国化学学会期刊 (Journal of the American Chemical Society) 124:9026-9027 ;J.W.秦和 P.G.舒尔 茨（P. G. Schultz), (2002),化学牛物化学（ChemBioChem) 3 (11) :1135-1137 :T.W. Chin 等 人，(2002),美国国家科学院院刊（PNAS United States of America) 99:11020-11024 ;以 及L Wang和R G. Schultz, (2002),化学通讯(Chem. Comm.), 1:1-11，所有参考文献均以全 文引用的方式并入本文中。这些研究已经表明，有可能选择性地并且常规地引入例如酮基、 炔基和叠氮基部分等化学官能团，这些化学官能团未发现于蛋白质中，对20种常见的基因 编码的氨基酸中所发现的所有官能团呈化学惰性并且可以用于有效地并且选择性地反应 以形成稳定共价键。
[0024] 将非基因编码的氨基酸并入到蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在的官能 团的有价值的替代物的化学官能团，例如赖氨酸的ε -NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸 的亚氨基等。已知某些化学官能团对见于20种常见的基因编码氨基酸中的官能团是惰性 的但简洁有效地反应以形成稳定的键。例如，此项技术中已知叠氮化合物和乙炔群在催化 量的铜存在的情况下，在水性条件下进行胡伊斯根（Huisgen) [3+2]环加成反应。参见例如 托尔诺（Tornoe)等人，(2002)有机化学杂志（T. Org. Chem.) 67: 3057-3064 ;和罗斯托夫采 夫（Rostovtsev)等人，(2002)应用化学国际版（Angew. Chem. Int. Ed.)41:2596-2599。通 过将叠氮部分引入蛋白质结构中，例如能够并入官能团，所述官能团对见于蛋白质中的胺、 硫氢基、羧酸、羟基化学上惰性，但也与乙炔部分顺利并有效地反应以形成环加成产物。重 要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基仍保留化学惰性，而且在其它蛋白质侧链存在 时在生理条件下不发生反应。
[0025] 本发明尤其解决与IL-3多肽结合物的活性和产生有关的问题，并且还解决具有 改良的生物或药理学特性（如增强的针对肿瘤的活性和/或改良的结合和/或改良的治疗 半衰期）的IL-3多肽的产生。


【发明内容】

[0026] 本发明涉及具有一或多个非天然编码氨基酸的白细胞介素-3(IL_3)多肽。本发 明更涉及具有一或多个非天然编码氨基酸的IL-3多肽结合物。本发明更涉及IL-3多肽结 合物，其中毒素通过IL-3变异体内的一或多个非天然编码氨基酸结合于IL-3变异体。
[0027] 本发明提供抑制或减少肿瘤或癌症增长的方法，其包含用有效量的本发明IL-3 多肽接触所述肿瘤。本发明提供抑制或减少肿瘤或癌症增长的方法，其包含用有效量的本 发明聚乙二醇化IL-3(PEG-IL-3)多肽接触所述肿瘤。在一个实施例中，PEG-IL-3为单聚 乙二醇化PEG-IL-3。在一个实施例中，PEG-IL-3为双聚乙二醇化PEG-IL-3。在一个实施 例中，PEG-IL-3上连接有两个（2)以上聚（乙）二醇分子。本发明的另一个实施例提供使 用本发明的TOG-IL-3多肽调节免疫反应的方法。本发明的另一个实施例提供靶向白细胞 介素-3受体表达细胞并且具体地说，通过使用结合于毒素的白细胞介素_3 (IL-3)变异体 来抑制所述细胞生长的方法，所述毒素将影响表达白细胞介素-3受体的细胞。
[0028] 本发明的IL-3多肽和PEG-IL3多肽可用于治疗由造血系统中骨髓、红细胞、淋巴 或巨核细胞中的任一种或其组合的含量减少表征的疾病。另外，其可用于活化成熟骨髓和 /或淋巴细胞。对本发明的多肽治疗敏感的病状包括白细胞减少症，即外周血液中循环白 细胞（白细胞）的数目减少。白细胞减少症可由暴露于某些病毒或辐射引起。其通常是不 同形式的癌症疗法（例如暴露于化学治疗药物）和感染或出血的副作用。用本发明的这些 IL-3和PEG-IL3多肽进行白细胞减少症的治疗性处理可以避免由当前可用药物治疗引起 的不良副作用。
[0029] 在一些实施例中，本发明的IL-3多肽结合于毒素。与某些正常造血细胞相比， IL-3受体在多种血液癌症（包括AML、B细胞急性淋巴球性白血病（B-ALL)、毛状细胞白血 病、霍奇金氏病以及某些侵袭性非霍奇金氏淋巴瘤（穆诺兹，血液学86:1261-1269, 2001 ; 罗西妮，淋巴瘤46:303-311，2005;特斯塔，白血病18:219-226, 2004))以及AML的癌 症干细胞、骨髓发育不良综合症（MDS)、T细胞ALL(T-ALL)和慢性骨髓白血病（CML)(参 见乔丹等人"白细胞介素-3受体α链是人类急性骨髓性白血病干细胞的独特标记"，白 血病14:1777-1784(2000);弗洛里安等人"不同骨髓恶性病中⑶34+/⑶38-干细胞表面 上分子目标的检测"淋巴瘤47:207-222 (2006);莱尔米特等人"大部分未成熟T-ALL表达 Ra-IL3 (CD123) :DT-IL3#疗法的可能目标"，20:1908-1910 (2006);和赫格等人"具有增加 的受体亲和力的变异型白喉毒素-白细胞介素-3结合物具有增强的针对急性骨髓白血病 祖细胞的细胞毒性"，临床癌症研究12:1284-1291(2004))中过度表达。本发明的IL-3和 结合于毒素（包含但不限于肿瘤学技术中已知的毒素和白喉毒素（DPT))的IL-3多肽是用 于治疗癌细胞和/或用于治疗IL-3表达肿瘤细胞。
[0030] 本发明的一些实施例是针对抑制白细胞介素-3受体表达细胞的方法，其包含投 与需要此类抑制的人类医药组合物，所述医药组合物包含可有效抑制所述细胞的量的人类 白细胞介素-3-毒素结合物和药学上可接受的载剂，其条件是白细胞介素_3受体表达细胞 不是急性骨髓白血病细胞，并且其中细胞表达白细胞介素-3受体的α子单元和β子单 元。本发明的一些实施例是针对结合物，其是IL-3/白喉毒素结合物。在本发明的一个方 面中，抑制白细胞介素-3受体表达细胞的生长。在本发明的这一实施例或任一实施例中， 白细胞介素-3-毒素结合物可包含通过与毒素的共价键连接的全长成熟（缺乏信号肽）人 类白细胞介素-3。优选的是毒素由于细胞表面结合域缺失而经修饰。例如，结合物是化学 结合物，其中例如白喉毒素部分（白喉毒素的催化和易位结构域）与白细胞介素-3部分是 直接或通过化学连接基团化学连接在一起。任选地，结合物是基因重组型，其中结合物表达 为单一多肤。
[0031] 在这一实施例的特定方面中，结合物可按每天4微克/千克或更大的剂量投与。在 其它方面中，结合物可按每天约4微克/千克到每天约20微克/千克范围内的剂量投与。 在其它方面中，结合物可按每天约4微克/千克到每天约9微克/千克范围内的剂量投与。 在其它方面中，结合物可按每天约4微克/千克到每天约12. 5微克/千克范围内的剂量投 与。在这一实施例的特定方面中，结合物可按每天约5. 3微克/千克的剂量或每天约7. 1微 克/千克的剂量或每天约9. 4微克/千克的剂量或每天约12. 5微克/千克的剂量投与。在 特定方面中，结合物可按无不当毒性情况下的最大耐受剂量或低于所述剂量的剂量投与。 另外，结合物可每周投与至少两次或结合物可每周投与至少三次、每周至少四次、每周至少 五次、每周至少六次或每周至少七次。在特定方面中，当结合物投与超过一次时，结合物每 次可按每天4微克/千克或更大的剂量投与。具体地说，结合物可在一周或两周或更长的 时段内投与。在抑制白细胞介素-3受体表达细胞的生长的方面中，与参考样品，即未与本 发明的结合物接触的细胞样品相比，可抑制细胞生长达至少50 %、至少65 %、至少75 %、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。
[0032] 在另一个实施例中，本发明是针对抑制白细胞介素-3受体表达细胞生长的方法， 其包含投与需要此类抑制的人类医药组合物，所述医药组合物包含可有效抑制所述细胞的 量的白细胞介素-3-毒素结合物和药学上可接受的载剂，其中结合物是按每天超过4微克/ 千克的剂量投与，并且其中细胞表达白细胞介素-3受体的α子单元。在这一实施例的一 方面中，细胞表达白细胞介素-3受体的α子单元和β子单元。
[0033] 本发明的IL-3和PEG-IL3多肽可适用于治疗嗜中性白血球减少症和例如治疗如 再生障碍性贫血、环状嗜中性白血球减少症、特发性嗜中性白血球减少症、先天性白细胞颗 粒异常综合征（Chdiak-Higashi syndrome)、全身性红斑性狼疮症（SLE)、白血病、骨髓发育 不良综合症和骨髓纤维化等病状。
[0034] 多种药物可引起骨髓抑制或造血不足。此类药物的实例是AZT、DDI、烷基化剂以及 用于化学疗法的抗代谢剂、抗生素（如氯氨苯醇、青霉素和磺胺药）、吩噻嗪酮、镇静剂（如 安宁（meprobamate))以及利尿剂。本发明的IL-3和PEG-IL3多肽可适用于预防或治疗通 常在经这些药物治疗的患者中发生的骨髓抑制或造血不足。
[0035] 造血不足也可以因病毒、微生物或寄生虫感染和因肾脏疾病或肾衰竭的治疗（例 如透析）而发生。本发明的IL-3和PEG-IL3多肽可适用于治疗此类造血不足。
[0036] 造血不足的治疗可包括向患者投与含有IL-3和/或PEG-IL3多肽的医药组合物 中的IL-3和/或PEG-IL3多肽。本发明的IL-3和/或PEG-IL3多肽也可以适用于通过用 本发明的突变蛋白质试管内处理造血前驱体细胞，随后将这些细胞注射到患者中来实现造 血前驱体细胞的活化和扩增。
[0037] 本发明的IL-3和PEG-IL3多肽治疗也可以有利地影响多种免疫缺乏症（例如在 T和/或B淋巴细胞中）或免疫病症（例如类风湿性关节炎）。免疫缺乏症可以由病毒性 感染（例如HTLVI、HTLVII、HTLVIII)、过度暴露于辐射、癌症疗法或由其它医学治疗引起。 本发明的IL-3和/或PEG-IL3多肽也可以单独或与其它促红细胞生成素组合用于治疗其 它血液细胞不足，包括血小板减少（血小板不足）或贫血。这些新型多肽的其它用途在于 活体内和活体外治疗从骨髓移植恢复的患者以及开发通过标准诊断或治疗用途方法产生 的单株和多株抗体。
[0038] 本发明的其它方面是用于治疗上述病状的方法和治疗性组合物。此类组合物包含 治疗有效量的一或多种本发明的IL-3和/或PEG-IL3多肽与药学上可接受的载剂的混合 物。这一组份可以非经肠、静脉内或皮下投与。在投与时，本发明中使用的治疗组合物优选 呈无热原质、非经肠可接受水性溶液形式。此类非经肠可接受蛋白质溶液的制备（考虑pH 值、等渗性、稳定性等方面）属于此项技术的技能范围。
[0039] 涉及用于治疗上述病状的方法的给药方案将由主治医师视不同因素而确定，所述 不同因素改变药物的作用，例如患者的病状、体重、性别和膳食、任何感染严重性、投药时间 和其它临床因素。通常，日疗程可在每千克体重0.2-150微克/千克非糖基化IL-3蛋白质 范围内。这一给药方案是参考标准生物活性水准，其识别原生IL-3在本文中所描述的AML 增殖分析法中通常具有10皮摩尔到100皮摩尔或约10皮摩尔到100皮摩尔的EC5(I。因此， 将关于既定突变蛋白质活性对比原生（参考）IL-3活性来调节剂量并且应注意剂量方案可 包括低到每天每千克体重〇. 1微克和高到每天每千克体重1毫克的剂量。此外，可能存在 IL-3和/或PEG-IL3多肽的剂量调节到高于或低于每千克体重10-200微克范围的特定情 形。这些情形包括与其它CSF或生长因子共同投与；与化学治疗药物和/或辐射共同投与； 以及本章节中早先提到的不同患者相关问题。如上文所指出，治疗方法和组合物还可包含 与其它人类因子共同投与。用于与本发明的多肽同时或依序共同投与的其它合适促红细 胞生成素、CSF和白细胞间介素包括GM-CSF、CSF-1、G-CSF、Meg-CSF、Μ-CSF、红血球生成素 (ΕΡ0)、IL-1、IL-4、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、LIF、B 细胞、成长因 子、B细胞分化因子和嗜酸性细胞分化因子、干细胞因子（SCF)(也称为青灰因子或c套组 配体）或其组合。将调节上述剂量以补偿治疗组合物中的此类额外组分。可以通过血液概 况（例如分化细胞计数等）的周期性评估来监测所治疗患者的进展。
[0040] 在另一个实施例中，本发明的IL-3和/或PEG-IL-3多肽调节至少一种发炎性细 胞因子的表达，所述细胞因子可以选自由以下各者组成的群组：IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-3 和RANK-配体（RANK-L)。在某些实施例中，PEG-IL-3结合于至少一种化学治疗剂。化学治疗 剂可以选自由以下各者组成的群组：替莫唑胺（temozolomide)、吉西他滨（gemictabine)、 多柔比星（doxorubicin)、IFN-a。在本发明的一个实施例中，PEG-IL-3与以下各者之一共 同投与：替莫唑胺（剂量5mg-250mg);吉西他滨（200mg-lg);多柔比星（lmg/m 2-50mg/m2); 干扰素 -a (lyg/kg-300yg/kg)。在某些实施例中，肿瘤或癌症选自由以下各者组成的群 组：结肠癌、卵巢癌、乳癌、黑色素瘤、肺癌、神经胶母细胞瘤和白血病。
[0041] 本发明还涉及一种用于治疗哺乳动物中急性白血病的方法，其包含向所述哺乳动 物投与治疗有效量的本发明的IL-3和/或PEG-IL3多肽。本发明还提供抑制急性白血病 母细胞增殖的方法，其包含投与罹患急性白血病的哺乳动物治疗有效剂量的本发明的IL-3 和/或PEG-IL3多肽。
[0042] 本发明还提供治疗哺乳动物中的急性白血病的方法，其包含投与所述哺乳动物治 疗有效量的本发明的IL-3和/或PEG-IL3多肽，其中IL-3和/或PEG-IL3多肽对急性白 血病母细胞具有在白细胞介素-3投与停止之后持续的抗增殖作用。
[0043] 根据本发明的方法，待治疗的急性白血病可能是骨髓细胞白血病（如急性骨髓性 白血病（AML))或B细胞白血病（如急性淋巴球性白血病（ALL))。所投与的IL-3可以选 自由以下组成的群组：白细胞介素-3与一或多个非天然编码氨基酸和白细胞介素_3多肽 结合物。本发明的另一实施例是针对抑制白细胞介素-3受体表达细胞的方法，其包含向需 要所述抑制的人投与医药组合物，所述医药组合物包含可有效抑制所述细胞的量的人类白 细胞介素-3-白喉毒素结合物和药学上可接受的载剂，其条件是白细胞介素_3受体表达细 胞不是急性骨髓白血病细胞，并且其中细胞表达白细胞介素-3受体的α子单元和β子单 元。在这一实施例之优选方面中，抑制白细胞介素-3受体表达细胞的生长。
[0044] 在本发明的这一或任一实施例中，白细胞介素-3-毒素（IL3_t)结合物可包含连 接到毒素的全长、成熟（缺乏信号肽）、人类白细胞介素-3。在本发明的这一或任一实施例 中，白细胞介素-3-毒素（IL3-t)结合物可包含通过共价键连接到毒素的全长、成熟（取法 信号肽）、人类白细胞介素-3。在一些实施例中，毒素经修饰，作为非限制性实例，毒素可包 括一或多个非天然编码氨基酸。
[0045] 适合的毒素或细胞毒性剂可以是例如奥瑞他汀（auristatin)、DNA小沟结合 齐[J、DNA小沟烧化剂、烯二炔、莱希菌素（lexitropsin)、倍癌霉素（duocarmycin)、紫杉烧 (taxane)、噪呤霉素（puromycin)、海兔毒素（dolastatin)、类美登素（maytansinoid)和 长春花（vinca)生物碱。在特定实施例中，细胞毒性剂是AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥 瑞他汀E、太平洋紫杉醇、多西他赛、CC-1065、SN-38、拓朴替康（topotecan)、吗啉基-多 柔比星、根霉素、氰基吗啉基-多柔比星、海兔毒素-10、棘霉素（echinomycin)、考布他 汀（combretatstatin)、卡里奇霉素（chalicheamicin)、美登素（maytansine)、DM-1 或 纺锤菌素（netropsin)。其它适合的细胞毒性剂包括抗微管蛋白剂，如奥瑞他汀、长春 花生物碱、鬼曰毒素（podophyllotoxin)、紫杉烧、巴卡亭（baccatin)衍生物、念珠藻素 (cryptophysin)、类美登素、考布他汀或海兔毒素。在特定实施例中，抗微管蛋白剂是AFP、 MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奥瑞他汀 E、长春新喊（vincristine)、长春喊（vinblastine)、长 春地辛（￥；[11(168；[116)、长春瑞宾（￥；[110代113；[116)、/?-16、喜树碱（03115)1：01：1160；[11)、紫杉醇、 多烯紫杉醇、埃坡霉素 A(epothilone A)、埃坡霉素 B、诺考达唑（nocodazole)、秋水仙碱 (colchicines)、秋水醜胺（colcimid)、雌莫司汀（estramustine)、西马多丁（cemadotin)、 迪斯德莫来（discodermolide)、美登素、DM-1或艾槽塞洛素（eleutherobin)。
[0046] 在IL-3和PEG-IL3药物结合物中，IL-3和PEG-IL3药物结合物可以直接或通过 连接基团结合到毒素。合适的连接基团包括例如可裂解和非可裂解连接基团。可裂解连接 基团通常对胞内条件下的裂解敏感。适合的可裂解连接基团包括例如可由胞内蛋白酶（如 溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶）裂解的肽连接基团。在例示性实施例中，连接基团可以是二 肽连接基团，如纟颜氨酸-瓜氨酸（val-cit)或苯丙氨酸-赖氨酸（phe-lys)连接基团。其 它适合的连接基团包括可在小于5. 5的pH值下水解的连接基团，如腙连接基团。额外适合 的可裂解连接基团包括二硫连接基团。IL-3或PEG-IL3药物结合物可靶向IL-3受体表达 细胞并且可以调节剂量和/或毒性。作为非限制性实例，IL-3或PEG-IL3结合物可以是化 学结合物，其中白喉毒素部分（白喉毒素的催化和易位结构域）与白细胞介素-3部分直接 或通过化学连接基团以化学方式连接在一起。
[0047] 在一些实施例中，本发明的IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素结合物和 PEG-IL3-毒素结合物用于癌症的过继性免疫疗法。本发明还包括用于过继性免疫疗法的 医药组合物，其包含IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素结合物和PEG-IL3-毒素结合物。 本发明部分地基于以下发现：IL-3可以预防或减少细胞因子产生，所述细胞因子被认为是 造成目前过继性免疫疗法中遇到的许多有害副作用的原因。如本文所用的术语"过继性免 疫疗法"意味着涉及将对抗功能性癌症的免疫细胞转移到患者中的疗法。优选地，对抗癌 症的免疫细胞包含源自患者本身的肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL)。广义上，本发明的方法包 含以下步骤：（i)在存在IL-2和IL-3的情况下培养TIL，（ii)向患者投与经培养的TIL， 和（iii)在投与TIL之后向患者投与IL-2和IL-3。这些化学物质和方法描述于贝尔托齐 (Bertozzi)申请案美国公开案第20090068738号，其以全文引用的方式并入本文中。
[0048] 在本发明的一些实施例中，IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素结合物和 PEG-IL3-毒素结合物是用于抑制移植组织的排斥作用。本发明还包括包含白细胞介素-3 的医药组合物。
[0049] 在一些实施例中，投与本发明的IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素结合物和 PEG-IL3-毒素结合物可以抑制肿瘤诱导的血管生成和/或促进肿瘤毒性分子[例如氧化氮 (N0)]的产生，其在一或多种临床前模型中引起肿瘤消退。
[0050] 在某些实施例中，本发明的方法涉及投与白喉毒素（DT)结合物（DT-IL3)以便抑 制人类中癌细胞和/或癌症干细胞的生长，这些细胞表达白细胞介素-3受体的一或多个子 单元。例示性细胞包括骨髓白血病癌症干细胞。在其它实施例中，本发明的方法涉及骨髓 或外周血液的离体净化，以便移除表达白细胞介素-3受体的一或多个子单元的细胞，使得 经过净化的骨髓或外周血液适于例如自体干细胞移植以便恢复造血功能。
[0051] 本发明提供治疗哺乳动物中的癌症的方法，例如哺乳动物包括（但不限于）患 有以下病状中的一或多种的哺乳动物：结肠癌、卵巢癌、乳癌、黑素瘤、肺癌、神经胶母细 胞瘤和白血病，其通过投与有效量的IL-3多肽、PEG-IL3多肽、IL-3-毒素结合物和/或 PEG-IL3-毒素结合物。
[0052] 如本文所使用，白细胞介素3或IL-3定义为一种蛋白质，其（a)具有与IL-3的 已知序列实质上一致的氨基酸序列，包括名称为"使用突变人类白细胞介素-3(IL-3)多肽 的治疗方法（Therapeutic methods employing mutant human interleukin-3 (IL-3)多 肽）"的美国专利第6,017, 523号，保尔（Bauer)等人中描述的IL-3突变蛋白质，其以全 文引用的方式併入本文中；成熟IL-3序列（即缺乏分泌性前导序列）和如本申请的SEQ ID N0:l-3中揭示的IL-3,和（b)具有至少一种与原生IL-3共有的生物活性。出于本发明的 目的，糖基化（例如在如酵母或CH0细胞的真核细胞中产生）和未糖基化（例如以化学方 式合成或在大肠杆菌中产生）的IL-3是等效物并且可以互换使用。还包括其它突变体和 其它类似物，包括病毒IL-3,其保留IL-3的生物活性。
[0053] 优选的是，本发明的白细胞介素-3是选自由以下组成的群组：由以下氨基酸序列 定义的开放式阅读框的成熟多肽：Met Ser Arg Leu Pro Val Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Val Arg Pro Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn lie Asn Gly Glu Asp Gin Asp lie Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser lie Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro lie His lie Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe (SEQ ID NO:1)，和 Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn He Asn Gly Glu Asp Gin Asp lie Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser lie Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro lie His He Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe (SEQ ID N0:2)，和Met Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys Ser Asn Met lie Asp Glu lie lie Thr His Leu Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn lie Asn Gly Glu Asp Gin Asp He Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Ala Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gin Asn Asn Ala Ser Ala lie Glu Ser lie Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro lie His He Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala lie Phe (SEQ ID NO:3), 其中标准三字母缩写是用于表示L-氨基酸，从N端开始。
[0054] 本发明提供包含一或多个非天然编码氨基酸的白细胞介素3 (IL-3)多肽。本发明 提供白细胞介素3(IL_3)多肽，其包含结合到毒素的一或多个非天然编码氨基酸。本发明 提供包含一或多个非天然编码氨基酸的聚乙二醇化白细胞介素3(IL-3)多肽。本发明提 供结合到毒素的白细胞介素3 (IL-3)多肽，其包含一或多种水溶性聚合物，其中IL-3多肽 包含一或多个非天然编码氨基酸。本发明提供结合到一或多种水溶性聚合物的白细胞介素 3 (IL-3)多肽，其中聚乙二醇化IL-3多肽也连接到毒素并且其中IL-3多肽包含一或多个非 天然编码氨基酸。本发明还提供IL-3多肽的单体和二聚物。本发明还提供IL-3多肽的三 聚物。本发明提供IL-3多肽的多聚物。本发明还提供包含一或多个非天然编码氨基酸的 IL-3二聚物。本发明提供包含一或多个非天然编码氨基酸的IL-3多聚物。本发明提供同 源IL-3多聚物，其包含一或多个非天然编码氨基酸，其中每个IL-3多肽具有相同的氨基酸 序列。本发明提供异源IL-3多聚物，其中至少一个IL-3多肽包含至少一个非天然编码氨 基酸，其中多聚物中的任一个或每一个IL-3多肽可以具有不同的氨基酸序列。
[0055] 在一些实施例中，IL-3多肽包含一或多种翻译后修饰。在一些实施例中，IL-3多 肽与连接基团、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，IL-3单体是同源的。在一些 实施例中，IL-3二聚物是同源的。在一些实施例中，IL-3多聚物结合到一种水溶性聚合物 上。在一些实施例中，IL-3多聚物结合到两种水溶性聚合物。在一些实施例中，IL-3多聚 物结合到三种水溶性聚合物。在一些实施例中，IL-3多聚物结合到三种以上水溶性聚合物 上。在一些实施例中，其中IL-3多肽与长度足够允许形成二聚物的连接基团连接。在一些 实施例中，其中IL-3多肽与长度足够允许形成三聚物的连接基团连接。在一些实施例中， 其中IL-3多肽与长度足够允许形成多聚物的连接基团连接。在一些实施例中，IL-3多肽 与双官能聚合物、双官能连接基团或至少一种其它IL-3多肽连接。在一些实施例中，IL-3 多肽包含一或多个翻译后修饰。在一些实施例中，IL-3多肽与连接基团、聚合物或生物活 性分子连接。
[0056] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸连接到水溶性聚合物。在一些实施例中，水溶 性聚合物包含聚（乙二醇）（PEG)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接基团 与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键接。在一些实施例中，聚（乙二醇）分子是一种 双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多 肽是IL-3。在一些实施例中，IL-3或其变异体包含至少两个与包含聚（乙二醇）部分的水 溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
[0057] 在一个实施例中，本发明的IL-3或PEG-IL3连接到治疗剂，如细胞毒性剂。细胞 毒性剂可以是任何对癌细胞发挥治疗作用的药剂或可以用作治疗剂以用于结合到IL-3、 PEG-IL3或IL-3变异体的活性免疫细胞（参见例如W02004/010957, "药物结合物和其用 于治疗癌症、自体免疫疾病或感染性疾病的用途（Drug Conjugates and Their Use for Treating Cancer, An Autoimmune Disease or an Infectious Disease)，'。
[0058] 适用类别之细胞毒性剂或免疫抑制剂包括例如抗微管蛋白剂、奥瑞他汀、DNA小沟 结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂（例如钼复合物，如顺式-钼、单（钼）、双（钼）及三-核 钼复合物及卡钼）、蒽环霉素、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学治疗增感剂、倍癌霉素、依 --泊苷（etoposide)、氟化啼陡、离子载体、莱克希托普森（lexitropsin)、亚硝基脲、顺氯 氨钼（platinol)、预形成化合物、噪呤抗代谢物、噪呤霉素（puromycin)、福射增感剂、类固 醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱或其类似物。
[0059] 个别细胞毒素或免疫抑制药剂包括例如男性荷尔蒙、安曲霉素（anthramycin) (AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑噪呤、博莱霉素（bleomycin)、白消安（busulfan)、 丁硫氨酸磺酰亚胺（buthionine sulfoximine)、喜树碱（camptothecin)、卡钼 (carboplatin)、卡莫司汀（carmustine) (BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺钼、秋水仙喊 (colchicine)、环磷酰胺、阿糖胞苷（cytarabine)、胞啼陡核苷（cytidine)、阿拉伯糖 昔（arabinoside)、细胞松她素 B(cytochalasin B)、达卡巴嚷（dacarbazine)、更生霉素 (dactinomycin)(以前是放射菌素（actinomycin))、道诺霉素（daunorubicin)、达卡巴 嗪（decarbazine)、多西他赛、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿啼陡、短杆菌肽 D(gramicidin D)、轻基脲、艾达霉素（idarubicin)、异环磷酰胺、伊立替康（irinotecan)、 洛莫司汀（lomustine) (CCNU)、双氯乙基甲胺、美法仑、6-巯基嘌呤、甲胺喋呤、光神霉素 (mithramycin)、丝裂霉素 C(mitomycin C)、米托蒽醌（mitoxantrone)、硝基咪唑、太平洋紫 杉醇、普卡霉素（plicamycin)、丙卡巴肼（procarbizine)、链佐霉素（streptozotocin)、特 诺波赛（tenoposide)、6_硫鸟噪呤、噻替派（thioTEPA)、拓朴替康、长春碱（vinblastine)、 长春新喊（vincristine)、长春瑞宾（vinorelbine)、VP_16 和 VM-26。
[0060] 在一些典型实施例中，治疗剂是细胞毒性剂。合适的细胞毒性剂包括例如海兔 毒素（例如奥瑞他汀E、AFP、MMAF、MMAE)、DNA小沟结合剂（例如烯二炔和莱克希托普森 (lexitropsins))、倍癌霉素（duocarmycins)、紫杉烧（例如太平洋紫杉醇和多西他赛）、噪 呤霉素、长春花生物碱、CC-1065、SN-38、拓朴替康、吗啉基-多柔比星、根霉素（rhizoxin)、 氰基-吗啉基-多柔比星、棘霉素（echinomycin)、考布他汀（combretastatin)、纺锤 菌素（netropsin)、埃坡霉素 A(epothilone A)和埃坡霉素 B(epothilone B)、雌氣 芥（estramustine)、克瑞普托非森（cryptophysins)、西马多丁（cemadotin)、美登醇 (maytansinoids)、迪斯德莫来（discodermolide)、艾槽塞洛素（eleutherobin)和米托蒽 醌。
[0061] 在某些实施例中，细胞毒性剂是常规化学治疗，如多柔比星、太平洋紫杉醇、美法 仑、长春花生物碱、甲胺喋呤、丝裂霉素 C或依托泊苷。另外，如CC-1065类似物、卡奇霉素、 美登素、海兔毒素10类似物、根霉素和岩沙海葵毒素（palytoxin)等强效剂可以连接到本 发明的IL-3和PEG-IL3多肽。
[0062] 在特定实施例中，细胞毒素或细胞生长抑制剂是奥瑞他汀E(所属领域中也称为 海兔毒素-10)或其衍生物。典型地，奥瑞他汀E衍生物是例如奥瑞他汀E与酮酸之间形成 的酯。例如，奥瑞他汀E可以分别与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应产生AEB和AEVB。 其它典型奥瑞他汀衍生物包括AFP、MMAF和MMAE。奥瑞他汀E和其衍生物的合成和结构 描述于美国专利申请案第09/845, 786号（美国专利申请公开案第20030083263号）和第 10/001，191号；国际专利申请案第PCT/US03/24209号、国际专利申请案第PCT/US02/13435 号和美国专利案第6, 323, 315号；第6, 239, 104号；第6, 034, 065号；第5, 780, 588号；第 5, 665, 860 号；第 5, 663, 149 号；第 5, 635, 483 号；第 5, 599, 902 号；第 5, 554, 725 号；第 5, 530, 097 号；第 5, 521，284 号；第 5, 504, 191 号；第 5, 410, 024 号；第 5, 138, 036 号；第 5, 076, 973 号；第 4, 986, 988 号；第 4, 978, 744 号；第 4, 879, 278 号；第 4, 816, 444 号；以及 第 4, 486, 414 号。
[0063] 在一些实施例中，将一个非天然编码氨基酸并入在IL-3或其变异体中一或多个 的以下位置中：位置 1 之前（即在 N 端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152或添加到蛋白质羧基端上，和其任何组合（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相应 氨基酸）。在一些实施例中，一或多种毒素直接结合到IL-3变异体。在一些实施例中，一 或多种毒素结合到IL-3多肽中的一或多个非天然编码氨基酸。在一些实施例中，本发明的 IL-3变异体连接到连接基团。在一些实施例中，连接到连接基团的IL-3变异体更包含毒 素。在本发明的一些实施例中，IL-3连接基团连接到非天然编码氨基酸。
[0064] 在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-3或其变异体中一或 多个的以下位置中：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152或添加到蛋白质羧基端上，和其任何组合（SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2或3中的 相应氨基酸）。
[0065] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸并入在如下的对应于IL-10或其变 异体二级结构的以下区域中一或多个中的任何位置处：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 3的螺旋L侧；疏水性相互作用位点处；N端最初43个氨基酸内；氨基酸位置44-160内。 在一些实施例中，将一或多个非天然编码氨基酸并入在IL-3或其变异体的以下一或多个 位置中：SEQ ID N0:1 的位置 1 之前（亦即在 N 端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43和其任何组合，或SEQ ID N0:2或3的相应氨基酸。在一些实施例中，，将一 或多个非天然编码氨基酸并入IL-3或其变异体的以下一或多个安置中：44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、 118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、 137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到 SEQ ID N0:1的蛋白质的羧基端和其任何组合，或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3中的相应氨基 酸。
[0066] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中这些位置中的一或多个处的非天然存在的氨 基酸连接到毒素，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白质的羧基端，和其任何组合（SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸或任何IL-3序列中的相应氨基酸）。
[0067] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中这些位置中的一或多个处的非天然存在的氨 基酸连接到连接基团，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、 106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、 125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、 144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白质的羧基端，和其任何组合（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸或任何IL-3序列中的相应氨基酸）。
[0068] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中这些位置中的一或多个处的非天然存在的 氨基酸连接到连接基团，即更连接到毒素，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即 在 N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、 141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白质的羧基端，和 其任何组合（SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸或任何IL-3序列中的相应 氨基酸）。
[0069] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中这些位置中的一或多个处的非天然存在的 氨基酸连接到水溶性聚合物，包括（但不限于）以下位置：位置1之前（即在N端）、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白质的羧基端，和其任何组合 (SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸或任何IL-3序列中的相应氨基酸）。
[0070] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中这些位置中的一或多个处的非天然存在的氨 基酸连接到水溶性聚合物，包括（但不限于）以下位置：SEQ ID NO: 1的位置1之前（即 在 N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43 或其任何组合，或 SEQ ID N0:2 或SEQ ID NO:3中的相应氨基酸残基。
[0071] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中这些位置中的一或多个处的非天然存在的氨 基酸连接到水溶性聚合物，包括（但不限于）以下位置：44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、 79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、 103、 104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、 141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152,或添加到蛋白质的羧基端，和其任 何组合（SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或3中的相应氨基酸）。
[0072] 在一些实施例中，IL-3或其变异体包含调节IL-3对另一个IL-3或其变异体的亲 和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-3或其变异体包含调节IL-3或其变异体对 IL-3受体或结合搭配物的亲和力的取代、添加缺失缺失，所述受体或结合搭配物包括（但 不限于）蛋白质、多肽、脂质、脂肪酸、小分子或核酸。在一些实施例中，IL-3或其变异体包 含调节在与不含取代、添加或缺失的相应IL-3稳定性相比较时的IL-3稳定性的取代、添加 或缺失。稳定性和/或溶解性可以使用所属领域的一般技术人员已知的多种不同分析来测 量。所述分析包括（但不限于）SE-HPLC和RP-HPLC。在一些实施例中，IL-3或其变异体包 含调节在与不含取代、添加或缺失的相应IL-3免疫原性相比较时的IL-3免疫原性的取代、 添加或缺失。在一些实施例中，IL-3包含调节在与不含取代、添加或缺失的相应IL-3血清 半衰期或循环时间相比较时的IL-3血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
[0073] 在一些实施例中，IL-3或其变异体包含在与不含取代、添加或缺失的相应IL-3或 其变异体水溶性相比较时增加 IL-3水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-3或 其变异体包含在与不含取代、添加或缺失的相应IL-3或其变异体溶解性相比较时增加宿 主细胞中所产生IL-3或其变异体溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，IL-3或其 变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-3或其变异体的表达或合成相比较 时增加宿主细胞中IL-3表达或增加活体外合成的取代、添加或缺失。包含此取代的IL-3 或其变异体保持促效剂活性并且保持或改良在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中， IL-3或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-3或其变异体的蛋白酶抗 性相比较时增加所述IL-3或其变异体蛋白酶抗性的取代、添加或缺失。在一些实施例中， IL-3或其变异体包含在与受体对不含取代、添加或缺失的相应IL-3或其变异体相互作用 的活性相比较时调节所述IL-3受体的信号转导活性的取代、添加或缺失。在一些实施例 中，IL-3或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-3的结合相比较时调节 所述IL-3与另一个分子的结合的取代、添加或缺失。
[0074] IL-3毒素结合物或PEG-IL3-毒素结合物可以调配成包含治疗有效量的IL-3毒素 结合物或PEG-IL3-毒素结合物和医药学载剂的医药组合物。"治疗有效量"是足以提供所 需治疗结果的量。优选地，所述量负性副作用最少。投与用于治疗可用IL-3-毒素结合物 治疗的病状的IL-3-毒素结合物或PEG-IL3-毒素结合物的量是部分基于目标细胞上IL-3 受体的表达，其可由所属领域中已知的IL-3活性分析法测定。对需要所述治疗的特定患者 的治疗有效量可以通过考虑各种因素来确定，如所治疗的病状、患者的总体健康状况、投药 方法、副作用严重性等等。在肿瘤情形中，合适的IL-3活性将是例如CD8T细胞浸润到肿瘤 位点中、来自这些浸润细胞的发炎性细胞因子（如IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-3和RANK-L)的 表达、生物样品中TNF-α或IFN-γ的含量提高。
[0075] IL-3-毒素结合物或PEG-IL3-毒素结合物的治疗有效量可在每天每公斤体重约 0. 01微克到约100微克蛋白质范围内。优选地，聚乙二醇化IL-3的量在每天每公斤体重约 0. 1微克到20微克蛋白质，更优选地每天每公斤体重约0. 5微克到10微克蛋白质，并且最 优选地每天每公斤体重约1微克到4微克蛋白质的范围内。使用本发明的PEG-IL3-毒素 结合物，可以使用频繁较低的投药时程，因为这一结合形式的作用时间比IL-3毒素结合物 更长。聚乙二醇化IL-3毒素结合物是按纯形式调配并且实质上不含集聚物和其它蛋白质。 优选的是，通过持续灌注投与PEG-IL3-t使得每天递送约50微克到800微克范围内的量的 蛋白质（即每天每公斤体重约1微克到16微克蛋白质IL-3-毒素结合物或PEG-IL3-毒素 结合物）。每日输注速率可以基于副作用监测和血液细胞计数而变化。
[0076] 为了制备含有IL-3毒素结合物或PEG-IL3-毒素结合物的医药组合物，将治 疗有效量的IL-3-毒素结合物或PEG-IL3-毒素结合物与药学上可接受的载剂或赋形 剂混合。载剂或赋形剂优选是惰性的。医药载剂可以是任何适合于向患者递送本发 明IL-3组合物的相容的无毒物质。合适载剂的实例包括标准生理食盐水、林格氏溶 液（Ringer's solution)、右旋糖溶液和汉克氏溶液（Hank's solution)、也可以使用 如非挥发性油和油酸乙酯等非水性载剂。优选的载剂是5%右旋糖/盐水。载剂可以 含有少量添加剂，如增进等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂和防腐剂，参见例如 雷明顿药物科学（Remington's Pharmaceutical Sciences)和美国药典：国内处方集 (U. S. Pharmacopeia:National Formulary),马克出版公司(Mack Publishing Company), 宾夕法尼亚州伊斯顿（Easton，Pa.) (1984)。治疗剂和诊断剂的调配物可以通过与生理 学上可接受的呈例如冻干粉末、浆料、水溶液或悬浮液形式的载剂、赋形剂或稳定剂混合 来制备（参见例如哈德曼（Hardman)等人（2001)古德曼和吉尔曼治疗剂药理学基础 (Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics),麦格劳 _ 希尔 集团（McGraw-Hill),纽约州纽约（New York, N.Y.);吉纳罗（Gennaro) (2000)雷明顿：医 药科学和实践（Remington:The Science and Practice of Pharmacy),利平科特、威廉姆 斯和威尔金斯公司（Lippincott, Williams, and Wilkrns),纽约州纽约；阿维斯（Avis)等 人（编）（I"3)医药剂型：非经肠药物治疗（Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications),马塞尔德克公司（Marcel Dekker),纽约州；利伯曼（Lieberman)等人 (编）（1990)医药剂型：淀剂（Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets),马塞尔德克 公司，纽约州；利伯曼等人（编）（1990)医药剂型：分散系统（Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems),马塞尔德克公司，纽约州；Weiner 和 Kotkoskie(2000) 赋形剂毒性和安全性（Excipient Toxicity and Safety),马塞尔德克公司（Marcel Dekker, Inc.)，纽约州纽约。
[0077] PEG-IL-3可以调配成医药组合物，所述医药组合物包含治疗有效量的IL-3和医 药载剂。"治疗有效量"是足以提供所需治疗结果的量。优选地，所述量负性副作用最少。 经投与以治疗可用IL-3治疗的病状的PEG-IL-3量是基于所结合蛋白质的IL-3活性，该活 性可以通过此项技术中已知的IL-3活性分析来加以测定。对需要所述治疗的特定患者的 治疗有效量可以通过考虑各种因素来确定，如所治疗的病状、患者的总体健康状况、投药方 法、副作用严重性等等。在肿瘤情形中，合适的IL-3活性将是例如⑶8T细胞浸润到肿瘤位 点中、来自这些浸润细胞的发炎性细胞因子（如IFN. γ、IL-4、IL-6、IL-3和RANK-L)的表 达、生物样品中TNF-a或IFN-y的含量提高。
[0078] 聚乙二醇化IL-3的治疗有效量可以在每天每公斤体重约0. 01微克到约100微克 蛋白质的范围内变化。优选地，聚乙二醇化IL-3的量在每天每公斤体重约0. 1微克到20 微克蛋白质，更优选地每天每公斤体重约〇. 5微克到10微克蛋白质，并且最优选地每天每 公斤体重约1微克到4微克蛋白质的范围内。使用本发明的PEG-IL-3可以采用较不频繁 的投药安排，因为此结合形式的作用比IL-3长。聚乙二醇化IL-3调配成经纯化的形式，并 且实质上不含聚集体和其它蛋白质。优选地，通过连续输注投与PEG-IL-3,以使得每天递送 介于约50微克到800微克蛋白质范围内的量（亦即每天每公斤体重约1微克到16微克蛋 白质PEG-IL-3)。每日输注速率可以基于副作用监测和血液细胞计数而变化。
[0079] 为制备含有单-PEG-IL-3的医药组合物，将治疗有效量的PEG-IL-3与医药学上可 接受的载剂或赋形剂混合。载剂或赋形剂优选是惰性的。医药载剂可以是任何适合于向患 者递送本发明IL-3组合物的相容的无毒物质。合适载剂的实例包括标准生理食盐水、林格 氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。也可以使用非水性载剂，如非挥发性油和油酸乙酯。优 选的载剂是5%右旋糖/盐水。载剂可以含有少量添加剂，如增进等渗性和化学稳定性的 物质，例如缓冲剂和防腐剂，参见例如雷明顿药物科学和美国药典：国内处方集，马克出版 公司，宾夕法尼亚州伊斯顿（1984)。治疗剂和诊断剂的调配物可以通过与生理学上可接 受的呈例如冻干粉末、浆料、水溶液或悬浮液形式的载剂、赋形剂或稳定剂混合来制备（参 见例如哈德曼等人（2001)古德曼和吉尔曼治疗剂药理学基础，麦格劳-希尔集团，纽约 州纽约；Gennaro (2000)雷明顿：医药科学和实践，利平科特、威廉姆斯和威尔金斯公司， 纽约州纽约；阿维斯等人（编）（1993)医药剂型：非经肠药物治疗，马塞尔德克公司，纽 约州；利伯曼等人（编）（1990)医药剂型：锭剂，马塞尔德克公司，纽约州；利伯曼等人 (编）（1990)医药剂型：分散系统，马塞尔德克公司，纽约州；韦纳（Weiner)和科特斯基 (Kotkoskie) (2000)赋形剂毒性和安全性，马塞尔德克公司，纽约州纽约。
[0080] 本发明的组合物可以经口投与或注射到身体中。用于经口使用的调配物还可以包 括进一步保护IL-3不受胃肠道中蛋白酶影响的化合物。注射通常是肌肉内、皮下、皮内或 静脉内的。或者，在适当情况下可以使用关节内注射或其它途径。
[0081] 当非经肠投与时，聚乙二醇化IL-3、IL-3-毒素结合物和/或PEG-IL3-毒素结合 物优选的是按与医药学载剂结合的单位剂量可注射形式（溶液、悬浮液、乳液）调配。参见 例如阿维斯等人编，医药剂型：非经肠药物治疗，德克公司（Dekker)，纽约州（1993);利伯 曼等人编，医药剂型：锭剂，德克公司，纽约州（1990);和利伯曼等人编，医药剂型：分散 系统，德克公司，纽约州（1990)。或者，本发明的组合物可以通过可植入或可注射药物递 送系统引入到患者身体中，例如俄科哈特（Urquhart)等人药理学和毒理学年度综述（Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. )24:199-236, (1984);路易斯（Lewis)编，农药和医药的受控释 放（Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals)普雷纳姆出版社（Plenum Press)，纽约（1981)美国专利第3, 773, 919号；第3, 270, 960号；等等。聚乙二醇化IL-3 可以在存在或不存在各种添加剂和/或稀释剂下在如水、盐水或缓冲媒剂的水性媒剂中投 与。
[0082] 特定患者的有效量可以取决于例如以下各者的因素而变化：所治疗的病状、患者 的总体健康状况、投药的方法途径和剂量、和副作用的严重性（参见例如梅纳德（Maynard) 等人（1996)良好临床实践SOP手册（A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice), 国际药物出版社（Interpharm Press),佛罗里达州波卡拉顿（Boca Raton，Fla.);登 特（Dent) (2001)良好实验室和良好临床实践（Good Laboratory and Good Clinical Practice),厄奇出版社（Urch Publ.)，英国伦敦）。
[0083] 典型兽医学、实验或研究个体包括猴、犬、猫、大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、马和人类。
[0084] 由临床医生例如使用此项技术中已知或怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或 因素来确定适当剂量。一般来说，剂量以在某种程度上小于最佳剂量的量开始，并且其随后 以较小增量增加，直到相对于任何负性副作用达成所需或最佳效果。重要诊断测量包括例 如炎症症状或所产生发炎性细胞因子含量的那些测量。优选地，将使用的生物来源于与治 疗所针对的动物相同物种，由此将对试剂的体液响应减到最少。
[0085] 用第二治疗剂（例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或辐射）共投与或治 疗的方法是此项技术中熟知的（参见例如哈德曼等人（编）（2001)古德曼和吉尔曼治疗 剂药理学基础，第10补充版，麦格劳-希尔集团，纽约州纽约；普尔（Poole)和彼得森 (Peterson)(编）（2001)高阶实践的药物治疗学：实用方法（Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach),利平科特、威廉姆斯和威尔金斯公司，宾夕 法尼亚州费城（Phila.，PA);钱伯纳（Chabner)和隆戈（Longo)(编）（2001)癌症化学疗法 和生物疗法（Cancer Chemotherapy and Biotherapy)，利平科特、威廉姆斯和威尔金斯公 司，宾夕法尼亚州费城）。有效量的治疗剂将减少症状（例如肿瘤大小）或抑制肿瘤增长， 通常至少10% ;通常至少20% ;优选地至少约30% ;更优选地至少40%，并且最优选地至 少 50%。
[0086] 本发明提供治疗增生性病状或病症的方法，例如以下各者的癌症：子宫、子宫 颈、乳房、前列腺、睪丸、阴茎、胃肠道（例如食道、口咽、胃、小肠或大肠、结肠、或直肠）、 肾脏、肾细胞、膀胱、骨、骨髓、皮肤、头部或颈部、皮肤、肝脏、胆囊、心、肺、胰腺、唾液腺、 肾上腺、甲状腺、大脑（例如神经胶质瘤）、神经节、中枢神经系统（CNS)和外周神经系 统（PNS)和免疫系统（例如脾脏或胸腺）。本发明提供治疗例如以下各者的方法：免疫 原性肿瘤、非免疫原性肿瘤、休眠肿瘤、病毒诱导癌症，例如上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状 细胞癌、乳突状瘤病毒、腺癌、淋巴瘤、癌瘤、黑色素瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌、化学 诱导癌症、癌转移和血管生成。本发明还涵盖例如通过调节调控性T细胞（Treg)和或 CD8T细胞的活性来降低对肿瘤细胞或癌细胞抗原的耐受性（参见例如拉米雷兹-蒙太 古（Ramirez-Montagut)等人（2003)癌基因（Oncogene) 22:3180-3187 ;萨瓦亚（Sawaya) 等人（2003)新英格兰医学杂志349:1501-1509 ;法勒（Farrar)等人（1999)免疫学杂志 162:2842-2849 ;勒（Le)等人（2001)免疫学杂志 167:6765-6772 ;卡尼斯塔（Cannistra) 和尼洛夫（Niloff) (1996)新英格兰医学杂志334:1030-1038 ;奥斯本（Osborne) (1998) 新英格兰医学杂志339:1609-1618 ;林奇（Lynch)和沙佩勒（Chapelle) (2003)新英 格兰医学杂志348:919-932 ;恩辛格（Enzinger)和梅尔（Mayer) (2003)新英格兰医 学杂志349:2241-2252;福雷斯蒂耶雷（Forastiere)等人（2001)新英格兰医学杂志 345:1890-1900 ;伊兹比克（Izbicki)等人（1997)新英格兰医学杂志337:1188-1194 ;霍兰 德（Holland)等人（编）（1996)癌症的癌症药物百科全书（Cancer Medicine Encyclopedia of Cancer)，第4补充版，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥）。
[0087] 在一些实施例中，本发明提供用于用PEG-IL-3和至少一种其它治疗剂或诊断剂 来治疗增生性病状、癌症、肿瘤或癌变前病状（如非典型增生）的方法。其它治疗剂可以是 例如细胞因子或细胞因子拮抗剂（如IL-12、干扰素-α或抗表皮生长因子受体）、多柔比 星、表柔比星（epirubicin)、抗叶酸（例如甲胺碟呤或氟尿啼陡）、伊立替康、环磷酰胺、放 射线疗法、激素或抗激素疗法（例如雄激素、雌激素、抗雌激素、氟他胺（flutamide)或二 乙基己烯雌酚（diethylstilbestrol))、手术、他莫昔芬（tamoxifen)、异环磷酰胺、二溴卫 矛醇、烷基化剂（例如美法仑或顺钼）、依托泊苷、长春瑞宾、长春碱、长春地辛、糖皮质激素 (glucocorticoid)、组胺受体拮抗剂、血管生成抑制剂、福射、福射敏化剂、蒽环霉素、长春 花生物碱、紫杉烷（例如紫杉醇和多烯紫杉醇）、细胞周期抑制剂（例如细胞周期调节蛋白 依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor))、针对另一种肿瘤抗原的单克 隆抗体、单克隆抗体与毒素的复合物、T细胞佐剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞（例如树突状 细胞疗法）。疫苗可以可溶性蛋白质形式或以编码所述蛋白质的核酸形式提供（参见例如 勒等人，同前文献；格列柯（Greco)和泽尔夫斯基（Zellefsky)(编）（2000)前列腺癌的放 射线疗法（Radiotherapy of Prostate Cancer),哈伍德学术出版社（Harwood Academic), 阿姆斯特丹（Amsterdam);夏皮罗（Shapiro)和雷希特（Recht) (2001)新英格兰医学杂志 344:1997-2008 ;霍托巴基（Hortobagyi) (1998)新英格兰医学杂志339:974-984 ;卡特罗 纳（Catalona) (1994)新英格兰医学杂志 331:996-1004;内勒（Naylor)和哈登（Hadden) (2003)国际免疫药理学（Int. Immunopharmacol. )3:1205-1215 ;国际辅助肺癌研究合作组 (The Int. Adjuvant Lung Cancer Trial Collaborative Group) (2004)新英格兰医学杂 志350:351-360 ;斯拉蒙（Slamon)等人（2001)新英格兰医学杂志344:783-792 ;库德卡 (Kudelka)等人（1998)新英格兰医学杂志338:991-992 ;范内登（van Netten)等人（1996) 新英格兰医学杂志334:920-921)。
[0088] 还提供治疗癌症髓外造血（EMH)的方法。描述EMH(参见例如拉奥（Rao)等人 (2003)白血病和淋巴瘤（Leuk.Lymphoma)44:715-718 ;雷恩（Lane)等人（2002)皮肤病理 学杂志（J. Cutan. Pathol.) 29:608-612)。
[0089] 在一些实施例中，IL-3或其变异体包含与不含所述取代、添加或缺失的相应IL-3 的脂质结合活性相比较调节所述IL-3脂质结合的取代、添加或缺失。在一些实施例中， IL-3或其变异体包含与不含取代、添加或缺失的相应IL-3或其变异体的脂质代谢活性相 比较增强所述IL-3与代谢脂质相关活性的取代、添加或缺失。
[0090] 在一些实施例中，IL-3或其变异体包含在与不含所述取代、添加或缺失的相应野 生型IL-3的相容性相比较时增加所述IL-3或其变异体与医药防腐剂（例如间甲酚、苯酚、 苯甲醇）相容性的取代、添加或缺失。这一增加的相容性将使保存的医药调配物制剂能够 在存储期间保持蛋白质的物理化学特性（physiochemical property)和生物活性。
[0091] 在一些实施例中，通过一或多个非天然氨基酸产生一或多个经工程改造的键。分 子内键可以许多方式产生，包括（但不限于）在合适的条件下于蛋白质中的两个氨基酸之 间反应（一个或两个氨基酸可为非天然氨基酸）；在合适的条件下与两个氨基酸（其中每 一个氨基酸可为天然编码或非天然编码氨基酸）、与连接基团、聚合物或其它分子反应等。
[0092] 在一些实施例中，IL-3或其变异体中的一或多个氨基酸取代可以用一或多个天然 存在或非天然存在的氨基酸。在一些实施例中，IL-3或其变异体中的氨基酸取代可以用 天然存在或非天然存在的氨基酸进行，其限制条件为至少一个取代用非天然编码氨基酸进 行。在一些实施例中，IL-3或其变异体中的一或多个氨基酸取代可以用一或多个天然存在 的氨基酸进行，并且另外至少一个取代用非天然编码氨基酸进行。
[0093] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨 基脈基、置氣基或块基。
[0094] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基 酸具有以下结构：
[0095]

【权利要求】
1. 一种白细胞介素3 (IL-3)多肽，其包含一或多个非天然编码氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽与SEQ ID NO: 290%同源。
3. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽与SEQ ID NO: 3至少90%同源。
4. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽与SEQ ID NO: 2至少95%同源。
5. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽与SEQ ID NO: 2至少98%同源。
6. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽与SEQ ID NO: 2至少99%同源。
7. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3结合到一或多种水溶性聚合物。
8. 根据权利要求3所述的IL-3,其中所述水溶性聚合物中的至少一者连接到所述非天 然编码氨基酸中的至少一者。
9. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3的形式是单体。
10. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3的形式是二聚物。
11. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组 成的群组的位置处经取代：位置1之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152，或添加到所述蛋白质的羧基端，和其任何组合。
12. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3包含一或多个调节所述IL-3多肽对 IL-3受体的亲和力的氨基酸取代、添加或缺失。
13. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3包含一或多个提高所述IL-3的稳定 性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。
14. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3包含一或多个提高所述IL-3多肽在 重组宿主细胞中的表达或体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
15. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽包含一或多个提高所述IL-3的 耐蛋白酶性的氨基酸取代、添加或缺失。
16. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸对连接基团、聚合物或生 物活性分子具反应性，而所述连接基团、聚合物或生物活性分子另外对所述多肽中的20种 常见氨基酸中的任一者均不具反应性。
17. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、 醜餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
18. 根据权利要求17所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
19. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3连接到毒素、细胞毒性剂或免疫抑制 剂。
20. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述经结合的IL-3连接到一或多种水溶性聚 合物。
21. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述毒素、细胞毒性剂或免疫抑制剂是通过连 接基团连接到所述IL-3。
22. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述毒素、细胞毒性剂或免疫抑制剂直接结合 到所述IL-3中的一或多个所述非天然编码氨基酸。
23. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中η为O到10成为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2为H、烷基、芳基、经取 代烷基和经取代芳基；且R3为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；且R4为H、氨基酸、多肽 或羧基端修饰基团。
24. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
25. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
26. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
27. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含氨基脲基。
28. 根据权利要求19所述的IL-3多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
29. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中η为0-10成为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为0、N、S或不存 在；m为0-10 ;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修 饰基团。
30. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
31. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中η为0-10成为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为0、N、S或不存在；m为 0-10 ;R2为H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；且R3为H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
32. 根据权利要求7所述的IL-3,其中所述水溶性聚合物的分子量介于约0. IkDa与约 IOOkDa 之间。
33. 根据权利要求32所述的IL-3多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约 0. IkDa与约50kDa之间。
34. 根据权利要求19所述的IL-3,其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通过酰 胺键连接到所述水溶性聚合物。
35. 根据权利要求17所述的IL-3,其通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然 编码氨基酸的多肽反应来制得，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲 基。
36. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
37. 根据权利要求1所述的IL-3,其中所述IL-3多肽更包含通过所述非天然编码氨基 酸连接到所述多肽的连接基团、聚合物或生物活性分子。
38. 根据权利要求33所述的IL-3,其中所述IL-3多肽其中所述连接基团、聚合物或生 物活性分子通过糖部分连接到所述多肽。
39. -种制造根据权利要求1所述的白细胞介素3的方法，所述方法包含使所分离的 包含非天然编码氨基酸的IL-3多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接基 团、聚合物或生物活性分子接触。
40. 根据权利要求8所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚（乙二 醇）组成的群组的部分。
41. 根据权利要求39所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼 基、餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
42. 根据权利要求39所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，且所述 连接基团、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
43. 根据权利要求39所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通过酰胺键 连接到所述连接基团、聚合物或生物活性分子。
44. 根据权利要求39所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，且所述连 接基团、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
45. 根据权利要求39所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，且所述 连接基团、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
46. 根据权利要求7所述的IL-3多肽，其中所述水溶性聚合物是聚（乙二醇）部分。
47. 根据权利要求46所述的IL-3多肽，其中所述聚（乙二醇）部分是分支或多臂接枝 聚合物。
48. -种组合物，其包含根据权利要求1所述的IL-3和医药学上可接受的载剂。
49. 根据权利要求48所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连 接。
50. -种治疗患有由白细胞介素3调节的病症的患者的方法，其包含向所述患者投与 治疗有效量的根据权利要求42所述的组合物。
51. -种组合物，其包含与毒素结合的根据权利要求1所述的IL-3和药学上可接受的 载剂。
52. -种包含根据权利要求1所述的IL-3的组合物，其更包含连接基团和结合物以及 药学上可接受的载剂。
53. -种制造包含非天然编码氨基酸的白细胞介素3的方法，所述方法包含在允许包 含非天然编码氨基酸的IL-3多肽表达的条件下培养包含编码所述IL-3多肽的包含选择密 码子的一或多个多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述多肽。
54. -种调节白细胞介素3多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一 或多个非天然编码氨基酸取代所述多肽中的任何一或多个天然存在氨基酸。
55. -种白细胞介素3多肽，其包含一或多个提高重组宿主细胞中所述IL-3多肽的表 达的氨基酸取代、添加或缺失。
56. -种白细胞介素3多肽，其包含至少一个连接基团、聚合物或生物活性分子，其中 所述连接基团、聚合物或生物活性分子通过以核糖体方式并入所述多肽中的非天然编码氨 基酸的官能团连接到所述多肽上。
57. -种白细胞介素3多肽，其包含连接到一或多个非天然编码氨基酸的连接基团、聚 合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸在预先选择的位点处以核糖体方式并入 所述多肽中。
58. -种减少经诊断患有骨髓发育不良综合症（MDS)的人类中的胚细胞的方法，其包 含向需要所述减少的人类投与包含人类白细胞介素3(IL-3)_白喉毒素结合物的医药组合 物，其中所述结合物是按约〇. 1 μ /kg到约50 μ /kg的剂量投与。
59. -种减少经诊断患有癌症的人类中肿瘤细胞数目的方法，其包含向需要所述减少 的人类投与包含人类白细胞介素3 (IL-3)-毒素结合物的医药组合物，其中所述结合物。
60. 根据权利要求56所述的方法，其中所述结合物是按约0. 1 μ /kg到约50 μ /kg的剂 量投与。
【文档编号】C12P21/04GK104245720SQ201380021531
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】梅兰妮·尼尔森, 克里斯汀·S.·艾顿 申请人:Ambrx公司