从阳性血培养中隔离活性微生物的流程与配方的制作方法
【专利摘要】本发明公开的多个实施方案中提出了一些试剂和方法，利用这些试剂和方法可从阳性血培养样本中快速隔离出包括肺炎球菌在内的活性微生物细胞。产生的微生物团块既可用于鉴定，也可用于基于生长的检测方法，例如药敏试验等。本发明中所述的缓冲液包含一种基液、一种非离子型清洗剂、一种硫醇，并选择性地包含氯化铵。这些公开的方法提出了一种流程，按照该流程，只需要用一个样本制备管和一次离心分离即可从PBC血样中快速分离和浓缩活性微生物，同时可以将可能对鉴定方法产生干扰的哺乳动物血细胞碎片清除。
【专利说明】从阳性血培养中隔离活性微生物的流程与配方 相关专利申请的交叉引用
[0001] 本申请要求美国临时专利申请号为61/604732, 2012年2月29日提交的专利申请 于申请之日的权益，其公开内容在此通过引用的方式并入。 相关专利申请
[0002] 本专利申请的标的涉及美国专利号为13/647, 072, 2012年10月8日提交的美国 专利申请，该专利申请要求美国临时专利申请号为61/544, 407, 2011年10月7日提交的专 利申请于申请之日的权益，其公开内容在此通过引用的方式并入。 发明背景
[0003] 败血症是一种严重的疾病，是由宿主的免疫系统对感染的过激反应所引起的。它 可以引发全身性炎症，导致血流量受损。随着败血症的病程发展，会因为身体器官极度缺乏 氧气和营养物质而造成永久性损伤，并最终导致器官衰竭。如果诊断不当或不进行治疗，心 脏会变得衰弱并可能发生感染性休克，导致多个器官衰竭而死亡。为了检测败血症患者的 血液中是否存在细菌或酵母菌，必须进行血培养。如果存在微生物（血培养阳性（PBC))， 则必须鉴定出这些微生物并确定其对抗生素的敏感性，以提供适当的治疗。血培养阳性的 血样用于隔离、鉴定和进行抗生素敏感性试验（AST)。微生物鉴定的常用方法有质谱法， 包括MALDI-T0F/MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）或基于表型生长的方法，如 Phoenix?ID〇
[0004] 为了鉴定出微生物，在对微生物进行表型分析和AST检测时，需要从采集的血样 中的血细胞或其他物质中隔离出完整、有活性的微生物。在通过质谱法鉴定微生物时，微 生物样本中应完全不含已知会干扰MALDI-T0F/MS鉴定的物质，如血细胞成分、其他细胞碎 片和盐等。此外，微生物样本的量必须足够，这样才能得到可靠的鉴定。表型鉴定法，如 Phoenix? ID等需要完整而有活性的微生物，不含可能对分析所用的酶底物产生干扰的物 质。在进行AST检测，如Phoenix? AST检测时，微生物样本中需含有能在分析的过程中， 在有耐药性且抗生素存在的情况下生长，有活性，且没有发生改变的微生物。对所有方法而 言，重要的是量必须充足，纯度必须足够，因为样本中如携带残留的血液或培养基成分，就 会对试验造成直接干扰，或因微生物浓度（浊度）的误导性偏大而间接造成干扰。
[0005] 按照目前的技术，从PBC样本中隔离出活微生物需要进行微生物传代培养，这一 过程需要的时间长达72小时。这就会造成治疗的延迟或采用不正确的抗生素治疗。
[0006] 微生物中的某些菌株尤其难以在保持生物体活性的情况下从PBC样本中隔离，例 如肺炎链球菌（S. pneumoniae)。之所以难以隔离，部分原因是肺炎链球菌能激活自溶素 (autolysin)，从而使这种微生物的细胞发生"自毁"。请参见《用阳性血培养瓶的肺炎链球 菌抗原检测法作为替代方法诊断肺炎球菌菌血症》（Streptococcus pneumoniae Antigen Test Using Positive Blood Culture Bottles as an Alternative Method To Diagnose Pneumococcal Bacteremia，Journal of Clinical Microbiology, Vol. 43, No. 5, May 2005, p.2510-2512.) -文。目前从败血症患者体内隔离微生物，包括肺炎球菌的方法需 要用血培养瓶进行接种。在得到阳性信号后，一部分PBC样本被取出进行革兰氏染色， 另一部分用于微生物传代培养。传代培养出的微生物菌落用来进行下游的检测，如通过 MALDI-TOF/MS进行鉴定，表型鉴定法和AST检测等。
[0007] 从PBC样本中隔离活性微生物的其他技术通常要采用液体分离法，液体中含有裂 解缓冲液和可使PBC样本中的血细胞裂解的清洗剂。在裂解后，可将裂解的血细胞清除而 保留微生物。然而，使用这些裂解缓冲液往往会影响、破坏微生物或使其失去活性，造成其 数量不足，无法满足某些基于生长的鉴定方法，如AST检测的要求。
[0008] Bruker公司的Sepsityper?系统是一种无须对微生物进行传代培养，即可通过 MALDI-TOF/MS技术对PBC样本中的微生物进行直接检测的液体分离方法。此方法采用 十二烷基硫酸钠（SDS)，通过离心分离产生微生物团块。虽然S印sityper?法通常支持用 MALDI-TOF/MS技术来检测微生物团块，但由于这种强烈的清洗剂会和微生物的细胞壁之间 发生相互作用，导致活性不足，无法进行基于生长的鉴定方法和AST法。
[0009] 在Prod'hom等人于2010年2月17日发表的《采用基质辅助激光解吸电离飞行时 间质谱技术从血培养阳性团块中进行直接细菌鉴定》(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Direct Bacterial Identification from Positive Blood Culture Pellets"，.Tournal of Clinical Microbiology,Vol. 48,N o. 4, p. 1481-1483 (Februaryl7, 2010)) -文中公开了一种对PBC样本中的红细胞进行裂解 的方法，该方法先用氯化铵对细菌团块进行制备，然后采用MALDI-TOF/MS技术进行分析。 然而,这些方法均不足以在包含肺炎球菌的整个微生物检测板内得到可靠的MALDI-TOF/MS 数据。此外，没有迹象表明这些方法会使微生物能维持满足基于生长的鉴定法和AST检测 所要求的足够活性。
[0010] Hansson等人发表的《用微流控血样制备法进行败血症快速诊断》（Microfluidic Blood Sample Preparation for Rapid Sepsis Diagnostics, KTH Engineering Sciences (2012)) -文建议用清洗剂来裂解血细胞，以及用氯化铵选择性地裂解某些类型 的血细胞。然而，这篇文章却只字未提具体采用哪种配方或方法可以从不含干扰物质的PBC 血样中隔离出有活性的微生物并对同一 PBC血样进行诸如MALDI-TOF/MS鉴定和AST检测 的下游检测。
[0011] 无论在M. Drancourt的文章《用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术检测血 样中的微生物：一次回顾···》（Detection of Microorganisms in Blood Specimens Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time-〇f-flight Mass Spectrometry:A Review, Clinical Microbiology and Infection, 16:1620-1625，（2010))还是Nassif等人 的专利文献W0 2010/100612中，均描述了从PBC血样中隔离微生物的方法，包括通过在一 部分PBC血样中加入皂苷和/或氯化铵来清除血样中的红细胞、混合物的离心分离和用水 清洗生成的团块来清除残留的血蛋白。然而，这些方法在整个微生物检测板内无法在种一 级得出一致的微生物鉴定结果，并且/或者无法鉴定出肺炎球菌。此外，并无迹象表明用这 些方法生成的微生物团块的活性足以满足基于生长的检测方法（如AST等）的要求。
[0012] 因此，需要开发出既能够从PBC血样中快速分离出微生物，同时又能保持这些微 生物的活性的试剂和方法，这样，那些对细胞活性有要求，基于生长的分析方法，例如AST 检测等就变得可行。此外，最好这些试剂和方法能够用于从包括肺炎球菌在内的所有类型 的微生物中隔离出有活性的细胞。
【发明内容】
简述
[0013] 在公开的本发明的多个实施方案中描述了一些可从一份PBC血样中快速隔离出 包括肺炎球菌在内的活性微生物细胞的试剂和方法。用这些不同的试剂和方法所产生的微 生物团块中完全不含干扰物质，可用于多种鉴定方法，如MALDI-T0F/MS、基于生长的鉴定方 法和AST法。这样就能快速得出结果而无需进行微生物的传代培养。通过不同的实施方案 获得的活性微生物细胞团块，既可以用于MALDI-T0F/MS等快速鉴定系统的直接接种，也可 通过传统或自动的系统，如BD?公司的Phoenix?ID/AST系统进行ID/AST检测（AST)。这 些不同的实施方案也可应用于其他的系统和分子检测法，例如聚合酶链反应（PCR)，以及本 领域内技术人员所熟知的其他方法。
[0014] 本专利申请描述了几种不同的"裂解加清洗"缓冲液，这些缓冲液可在裂解哺乳动 物血细胞并洗去细胞碎片和其他血液成分的同时保持微生物的活性。本专利申请所描述的 这些"裂解加清洗"缓冲液中包含一种基液，其组成包括，例如：盐、蛋白胨和其他可以保护 微生物的营养物质，以及裂解试剂，如清洗剂、硫醇和用于将细胞碎片从哺乳动物血细胞中 去除的氯化铵。
[0015] 本专利申请所描述的从PBC血样中隔离微生物的方法采用"裂解加清洗"缓冲液快 速产生一个活性微生物团块，此团块可用于下游的检测方法，如MALDI-T0F/MS鉴定和AST 检测。这些公开的方法提供了一种使用样本制备管，通过一个裂解步骤、一个清洗步骤以及 仅仅一个离心分离步骤即可从PBC血样中快速隔离和浓缩微生物的流程。这些方法可以很 容易地根据自动系统的要求而调整，无需为了保持细胞的活性而进行微生物的传代培养。
[0016] 本专利申请所描述的方法没有采用那些会对微生物鉴定方法，如质谱法或 Phoenix? ID等表型法造成干扰的物质。此外，通过本专利申请所描述的方法从一份PBC血 样中快速隔离出的活性微生物的量能满足多项下游分析，如质谱法鉴定、表型或基于生长 的鉴定分析，以及AST检测的需要。此外，用本专利申请所描述的方法所制备的样本可满足 下游分析对宽检测板微生物鉴定的要求，包括最难以鉴定的微生物，如肺炎球菌。
[0017] 在另一个实施方案中则提供了一种试剂盒，其中可包括本专利申请所描述的一种 或多种用于从血样中隔离活性微生物的"裂解加清洗"缓冲液。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1所示为本文所述的一个实施方案中描述的一种方法，该方法可从PBC血样中 隔离活性微生物。
[0019] 图2所示为本文所述的一个实施方案中描述的一种方法，该方法可从PBC血样中 隔离活性肺炎球菌。 详细说明
[0020] 用本文所述的"裂解加清洗"缓冲液从PBC血样中隔离和提纯微生物，可以保持微 生物细胞的活性，进而可保证它们对基于生长的检测，如AST检测的响应。本文所述的方法 还能降低血样中细胞碎片等其他可能对多种鉴定方法，如MALDI-T0F/MS和Phoenix?ID等 产生干扰的物质的量。在一个实施方案中，本文所述的缓冲液的配方中将盐的含量降至最 低水平，以免对MALDI-T0F/MS鉴定分析技术产生干扰。
[0021] 在另一个实施方案中，本文所述的缓冲液和方法用于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性 菌或酵母菌的隔离与下游分析。在另一个实施方案中，革兰氏阳性菌除包含肺炎链球菌以 夕卜，还包含其他种类的链球菌。
[0022] "裂解加清洗"缓冲液
[0023] 本文所述的"裂解加清洗"缓冲液均衡含有多种试剂，可对微生物和用于裂解血细 胞的裂解试剂起到稳定作用。在一个实施方案中，缓冲液中包含一种基液，其成分包括盐、 蛋白胨和其他用于稳定微生物的营养物质，以及非离子型清洗剂、硫醇，还可以包含用于裂 解血样中的血细胞的氯化铵。
[0024] 虽然无意受特定理论的约束，但据信基液有助于微生物的稳定，同时裂解试剂可 裂解血细胞并清除干扰性的细胞碎片。本文所述的"裂解加清洗"缓冲液对多种独立作用 的裂解机制有促进作用：水（渗透裂解）、清洗剂（膜溶解）、硫醇（破坏膜内的蛋白质之间 的相互作用）和氯化铵（氯化铵基本上可通过红细胞的细胞膜，而细胞发生裂解的原因是 膜的胶体成分的渗透压不平衡）。将多种裂解试剂结合起来，可以减轻每种裂解试剂对微生 物的作用强度，并能以比分开使用更短的时间使用。
[0025] 基液的成分可以包含一种微生物营养肉汁、一种等渗缓冲液、多种蛋白胨和/或 盐类。该营养肉汁可以采用Trypticase?大豆肉汁等。在一个示例性实施方案中，该营养 肉汁在"裂解加清洗"缓冲液中的浓度约为10克/升至50克/升。等渗缓冲液是本领域 技术人员所公认的与全血样本相容的临床缓冲液。这类缓冲液通常是磷酸钠、磷酸钾和盐 溶液，如氯化钠或磷酸盐缓冲的盐溶液的混合液。在一个示例性实施方案中，该等渗缓冲液 的浓度约为1克/升至85克/升。在另一个示例性实施方案中，该等渗缓冲液是一种磷酸 盐缓冲夜。在一个实施方案中，蛋白胨包括酪蛋白胨和/或大豆蛋白胨。按照设想，基液的 其他成分包括丙酮酸钠、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨和/或右旋葡萄糖等。
[0026] 在另一个实施方案中，这种"裂解加清洗"缓冲液可以包含一种非离子型清洗剂或 非离子型清洗剂的混合液。在该实施方案中，在"裂解加清洗"缓冲液中至少有一种非离子 型清洗剂是非离子型溶血性清洗剂，该清洗剂可以选择性地裂解血细胞，但不会裂解微生 物。设想的示例型非离子型溶血性清洗剂包括Triton? X-100和皂苷。其他非离子型清洗 剂可以包含'Tween?系列、Brij?:系列、辛基-b-葡萄糖苷、Tergitol?.系列、MEGA系列（包括 N-辛酰基-N-甲基葡萄糖胺、N-壬酰基、N-癸酰基）、PLUR0NIC?系列，如F-68、毛地黄 阜苷（digitonins)，和CHAP系列等。在一个示例性实施方案中，该非离子型清洗剂在"裂 解加清洗"缓冲液中的浓度约为〇. 01克/升至20克/升。在另一个实施方案中，该"裂解 加清洗"缓冲液含有Triton? X-100,浓度约为6. 7克/升。
[0027] 在一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液含有Triton? X-100。Triton? X-100 的浓度按照能保持肺炎球菌活性的要求来选择。示例性实施方案所设想的Triton? X-100 浓度最高为1克/升。在另一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液含有Triton? X-100， 浓度约为〇. 335克/升。在又一个实施方案中，"裂解加清洗"缓冲液中Triton? X-100的 浓度为：约〇. 1克/升至约1克/升、约〇. 1克/升至约〇. 9克/升、约0. 1克/升至约0. 8 克/升、约0. 1克/升至约0. 7克/升、约0. 1克/升至约0. 6克/升、约0. 1克/升至约 〇. 5克/升、约0. 1克/升至约0. 4克/升、约0. 2克/升至约1克/升、约0. 3克/升至 约1克/升、约〇. 2克/升至约0. 9克/升、约0. 2克/升至约0. 8克/升、约0. 2克/升 至约0. 7克/升、约0. 2克/升至约0. 6克/升、约0. 2克/升至约0. 5克/升、约0. 2克 /升至约0. 4克/升、约0. 3克/升至约0. 9克/升、约0. 3克/升至约0. 8克/升、约0. 3 克/升至约0. 7克/升、约0. 3克/升至约0. 6克/升、约0. 3克/升至约0. 5克/升、或 约〇. 3克/升至约0. 4克/升。"裂解加清洗"缓冲液含有能够保持肺炎球菌活性并具有某 一浓度的Triton? X-100，也可用来从肺炎球菌以外的生物体内隔离出活性微生物细胞，并 不需要对这些其他生物体使用不同的"裂解加清洗"缓冲液。
[0028] 在一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液可以选择含有氯化铵。在另一个实施 方案中，氯化铵在"裂解加清洗"缓冲液中的浓度约为〇. 01克/升至80克/升。
[0029] 虽然 申请人:无意受某种特定理论的约束，但加入氯化铵或其他裂解性成分有助于 减轻"裂解加清洗"缓冲液中其他裂解性成分对微生物活性的影响。在加入各种裂解试剂 时，为了能裂解PBC血样中的血细胞，需要加入足够的量。这样往往会导致微生物细胞的死 亡，而这是不希望出现的结果。用清洗剂、硫醇和氯化铵裂解血细胞时，其作用机理不同。 如果一种"裂解加清洗"缓冲液能结合多种裂解机理，各种不同的裂解成分的用量就可以减 少。这样就可能减轻裂解微生物细胞这种负效应，但仍足以裂解血细胞，这样就能比单独使 用任何一种裂解成分更有效地裂解血细胞。因此，可以在保持微生物细胞活性的同时消除 不希望存在的血细胞成分。
[0030] 在一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液包含一种基液，该基液包含磷酸盐缓 冲的盐溶液、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋葡萄糖、丙酮酸钠、包含巯基乙酸钠和 L-盐酸半胱氨酸的硫醇、包含皂苷和Triton? X-100的非离子型清洗剂，并选择性地包含 PBS。
[0031] 在另一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液包含一种基液，该基液包含 Trypticase?大豆肉汁、酵母提取物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、丙酮酸钠、包含巯基乙酸钠和 L-盐酸半胱氨酸的硫醇、包含皂苷和Triton? X-100的非离子型清洗剂。
[0032] 在又一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液包含一种基液，该基液包含 Trypticase?大豆肉汁、包含巯基乙酸钠和L-盐酸半胱氨酸的硫醇、包含皂苷和Triton? X-100的非离子型清洗剂。
[0033] 在一个实施方案中，所述"裂解加清洗"缓冲液包含：一种酪蛋白胨的浓度为约8 克/升至约35克/升、氯化钠浓度为约2克/升至约10克/升、大豆蛋白胨浓度为约1. 5 克/升至15克/升和磷酸钾浓度为约0. 5克/升至约5克/升的基液；一种半胱氨酸的 浓度为约〇. 01克/升至2. 5克/升和巯基乙酸钠浓度为约0. 01克/升至2. 5克/升的硫 醇；和一种皂苷的浓度为约0. 01克/升至约10克/升及Triton? X-100浓度为约0. 01克 /升至约20克/升的非离子型清洗剂。
[0034] 在一个实施方案中，所述"裂解加清洗"缓冲液包含：一种酪蛋白胨的浓度为约8 克/升至约35克/升、氯化钠的浓度为约2克/升至约10克/升、大豆蛋白胨的浓度为约 1. 5克/升至15克/升和磷酸钾的浓度为约0. 5克/升至约5克/升的基液；一种半胱氨 酸的浓度为约〇. 01克/升至2. 5克/升和巯基乙酸钠的浓度为约0. 01克/升至2. 5克/ 升的硫醇；和一种皂苷的浓度为约〇. 01克/升至约10克/升及Triton? X-100的浓度为 约〇. 01克/升至约80克/升的非离子型清洗剂；和浓度为约0. 01克/升至约80克/升 的氯化铵。
[0035] 在一个实施方案中，可以选择在该"裂解加清洗"缓冲液中加入一种消泡剂，以便 于生产。该消泡剂最好对"裂解加清洗"缓冲液的性能没有明显的影响。由于消泡剂已为 本领域内的技术人员所熟知，这里就不再详细描述了。对发泡剂及其用量的选择在很大程 度上属于设计选择，考虑到本文所述对"裂解加清洗"缓冲液的要求，这完全属于本领域技 术人员能力范围内的事。在一个实施方案中，该消泡剂在"裂解加清洗"缓冲液中的浓度为 〇. 1克/升。
[0036] 本文所述"裂解加清洗"缓冲液中各种组分的含量指各种组分在"裂解加清洗"缓 冲液中的最终含量。通常PBC血样和"裂解加清洗"缓冲液以1:1的体积比混合，也可考虑 其他的体积比。"裂解加清洗"缓冲液中各组分的浓度可根据"裂解加清洗"缓冲液和PBC血 样之间体积比的变化而进行相应的调整，以便在和PBC血样混合后，"裂解加清洗"缓冲液 中各组分能达到期望的浓度。
[0037] 在一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液含有皂苷和Triton? X-100,但不含 消泡剂。虽然不想被理论所束缚，但和在"裂解加清洗"缓冲液中单纯使用皂苷一种非离子 型清洗剂相比，用皂苷和Triton? X-100相结合能使处理后的PBC血样中的泡沫大大减少。 这种减少泡沫的作用能够改善作业流程，更便于清除离心分离后的上清液，从而减少或完 全不需要使用消泡剂（即硅树脂液）。
[0038] 在一个实施方案中，该"裂解加清洗"缓冲液中包含一种含胆碱的溶液，例如在美 国专利申请号为13/647,072的专利中所述的含胆碱溶液，该专利的内容在此通过引用全 部并入本文。虽然 申请人:无意受某种特定理论的约束，但在"裂解加清洗"缓冲液加入含氮 碱溶液，由于在"裂解加清洗"缓冲液中有裂解性成分的存在，可抑制、防止和/或减轻微生 物的自溶，特别是肺炎球菌。
[0039] 在另一个实施方案中则提供了一种试剂盒，其中可包括本专利申请所描述的一种 或多种用于从PBC血样中隔离活性微生物的"裂解加清洗"缓冲液。
[0040] 从PBC血样中隔离微生物的方法
[0041] 从怀疑至少含有一种微生物的样本，例如本专利申请所描述的PBC血样中隔离微 生物的方法采用"裂解加清洗"缓冲液，该缓冲液按照设想可以快速产生一个活性微生物团 块，此团块可用于下游的检测方法，如MALDI-T0F/MS鉴定和AST检测。在一个实施方案中， 该方法包含在该"裂解加清洗"缓冲液中加入一部分PBC血样，以形成一种混合物。在一个 实施方案中，PBC血样与"裂解加清洗"缓冲液的体积比为1:1。对该混合物进行了一段时 间的温育，以裂解PBC血样中的血细胞。
[0042] 在一个示例性实施方案中，与该PBC血样混合的"裂解加清洗"缓冲液中至少含有 一种非离子型清洗剂，该清洗剂的浓度约为〇. 01克/升至20克/升。在另一个实施方案 中，该"裂解加清洗"缓冲液含有Triton? X-100,浓度约为6.7克/升。在另一个实施方 案中，该"裂解加清洗"缓冲液中Triton? X-100的浓度为约1克/升。在另一个实施方案 中，该"裂解加清洗"缓冲液中Triton? X-100的浓度约为0. 335克/升。在另一个实施方 案中，该"裂解加清洗"缓冲液中Triton? X-100的含量范围是：约0. 1克/升至约1克/ 升、约〇. 1克/升至约〇. 9克/升、约0. 1克/升至约0. 8克/升、约0. 1克/升至约0. 7 克/升、约0. 1克/升至约0. 6克/升、约0. 1克/升至约0. 5克/升、约0. 1克/升至约 〇. 4克/升、约0. 2克/升至约1克/升、约0. 3克/升至约1克/升、约0. 2克/升至约 0. 9克/升、约0. 2克/升至约0. 8克/升、约0. 2克/升至约0. 7克/升、约0. 2克/升 至约0. 6克/升、约0. 2克/升至约0. 5克/升、约0. 2克/升至约0. 4克/升、约0. 3克 /升至约0. 9克/升、约0. 3克/升至约0. 8克/升、约0. 3克/升至约0. 7克/升、约0. 3 克/升至约0. 6克/升、约0. 3克/升至约0. 5克/升、或约0. 3克/升至约0. 4克/升。
[0043] 在一个实施方案中，在将一部分PBC血样与"裂解加清洗"缓冲液混合而制备混合 物后，对该混合物进行不超过约5分钟的温育。在另一个实施方案中，该混合物在温育过程 中被上下颠倒几次，以保证PBC血样和"裂解加清洗"缓冲液能均匀混合。在温育后，通过对 该混合物进行浓缩形成一个团块，该团块含活性微生物和一种含血细胞碎片的上清液。可 对离心分离的加速度和时间范围进行优化，以得到一个易于辨别的团块，以便在不影响该 团快的情况下清除该上清液。有各种变量会影响离心分离的加速度和时间，例如混合物的 体积、样本试管的尺寸和形状和转子的类型等。在一个实施方案中，以l〇〇g至5000g的加 速度对该混合物进行离心分离。在另一个实施方案中，对该混合物进行离心分离的时间为 小于或等于10分钟。
[0044] 在离心分离后，上清液被丢弃，同时用另外一份"裂解加清洗"缓冲液清洗该团块。 在清洗步骤中使用的"裂解加清洗"缓冲液可以和在裂解步骤中用于裂解血细胞的"裂解加 清洗"缓冲液的配方相同，也可不同。在清洗了该团块后，对该混合物进行再次离心分离。 含有血细胞碎片的上清液被再次丢弃，而含有活性微生物的团块则被保留。可将团块顶部 的微量溶液清除。最后，可将该团块再次悬浮在一种溶液中，以用于下游分析。在一个实施 方案中，该团块被悬浮在一种浓度至少为约4麦克法兰（McFarland)的溶液中。
[0045] 本文所述各实施方案中生成的活性微生物团块可用于制取下游各种检测方法所 共用的样本，这些监测方法包括质谱鉴定法，例如MALDI-T0F/MS鉴定、基于生长的表型鉴 定，和Phoenix? ID和AST检测，如Phoenix? AST检测。此外，整个方法可在一个样本试管 中实现，无需将样本在多个试管之间转移。因此，本专利中所述的方法可以很容易地根据自 动系统的要求而调整。
[0046] 可采用本专利中所述的多种方法，如提高PBC血样的体积、采用多等份的PBC血 样、多重旋转等，来增加初始用量中微生物的数量，以提高产量。此外，用这些方法还可以迅 速制备样本，并且便于自动化。此外，本专利中所述的方法和缓冲液可以裂解血细胞、从PBC 血样中清除干扰物并提供高产量的活性微生物。在一个实施方案中，可通过增加 PBC血样 的初始用量和/或从PBC血样中取出多个等份进行隔离，然后将生成的微生物团块结合成 一个样本的方法来提高活性微生物团块的产量。
[0047] 图1所不为本文所述方法的一个实施方案。将一份PBC血样，如5毫升血样转移 到（100) -个样本试管中。在该PBC血样中加入一定量，如5毫升的"裂解加清洗"缓冲液 (105)中进行混合（110)，例如混合5分钟。对该混合物进行离心分离（115)，例如在2200g 的加速度下分离10分钟，得到含活性微生物的团块A和含血细胞碎片的上清液A。上清液A 被倒出并丢弃（120)而团块A则被保留（125)。在团块A中加入另一份，如5毫升的"裂解 加清洗"缓冲液（130)，重新使该团块悬浮。重新悬浮的团块A在混合（135)后生成第二份 混合物。对第二份混合物进行离心分离（140)，例如在2200g的加速度下分离10分钟，得到 含活性微生物的团块B和含有第一步离心分离时未能清除的血细胞碎片的上清液B (115)。 上清液B被倒出并丢弃（145)而团块B则被保留（150)。团块B的至少一部分被悬浮（155) 在一种溶液中，例如600升的无菌去离子水中，生成一种稠密的微生物悬浮液，例如可生成 一种浓度约4麦克法兰（McFarland)的悬浮液。生成的微生物悬浮液可用于各种下游检测 方法（160)，例如MALDI/TOF-MS鉴定，和基于生长的表型鉴定，例如使用Phoenix?系统的 鉴定，和基于生长的AST方法，例如Phoenix? AST检测。
[0048] 在本文所述的这些活性微生物隔离方法的一个实施方案中，在PBC血样与"裂解 加清洗"缓冲液混合之前或同时，先和一种胆碱溶液混合进行温育，如美国专利申请号为 13/647, 072的专利中所述，该专利的内容在此通过引用已全部并入本文。
[0049] 在另一个实施方案中描述了多种可从PBC血样中隔离活性肺炎球菌的方法。这些 方法中包括获得一份怀疑含有至少一种微生物的血样。将该血样的一部分加入一个厌氧血 培养瓶，并将该血样的另一部分加入一个需氧血培养瓶。这两个培养瓶被温育至得到阳性 信号为止。在把一部分需氧PBC血样和本文所述的"裂解加清洗"缓冲液混合后形成一种混 合物，对该混合物进行一段时间的温育以裂解血细胞，并对该混合物进行离心分离以生成 一个团块后，可以获得该血样中存在肺炎球菌的早期迹象。团块如果呈绿色，即可视为血样 中存在肺炎球菌的早期迹象。通过目测观察需氧阳性血培养瓶中是否存在一种绿色溶液， 也可获得血样中是否存在肺炎球菌的早期迹象。
[0050] 在获得肺炎球菌存在的早期迹象后，该厌氧PBC血样可以用于隔离活性肺炎球 菌，从而通过本文所述的方法进行下游分析，以隔离出活性微生物。在一个实施方案中，该 方法包含在本文所述的"裂解加清洗"缓冲液中加入一部分厌氧PBC血样，以形成一种混合 物。对该混合物进行了一段时间的温育，以裂解PBC血样中的血细胞。
[0051] 在一个实施方案中，隔离活性肺炎球菌的方法包括采用一种含Triton? X-100的" 裂解加清洗"缓冲液。Triton? X-100的浓度按照能保持肺炎球菌的活性来选择。设想的 浓度不超过约1克/升。在另一个实施方案中，隔离活性肺炎球菌的方法包括采用一种含 Triton? X-100约0. 335克/升的"裂解加清洗"缓冲液。
[0052] 在一个实施方案中，在将一部分PBC血样与"裂解加清洗"缓冲液混合而制备混合 物后，对该混合物进行不超过约5分钟的温育。在另一个实施方案中，该混合物在温育过程 中被上下颠倒几次，以保证PBC血样和"裂解加清洗"缓冲液能均匀混合。在温育后，通过 对该混合物进行浓缩形成一个团块，该团块含活性微生物和一种含血细胞碎片的上清液。
[0053] 在离心分离后，上清液被丢弃，同时用另外一份"裂解加清洗"缓冲液清洗含肺炎 球菌的该团块。在清洗步骤中使用的"裂解加清洗"缓冲液可以和在裂解步骤中用于裂解 血细胞的"裂解加清洗"缓冲液的配方相同，也可不同。在清洗了该团块后，对该混合物进 行再次离心分离。含有血细胞碎片的上清液被再次丢弃，而含有肺炎球菌的团块则被保留。 最后，可将该团块再次悬浮在一种溶液中，以用于下游分析。
[0054] 这种从PBC血样中隔离活性肺炎球菌的方法的一个实施方案如图2所示。可获得 一份悬浮有肺炎球菌的血样（200)。将该血样的一部分（例如10毫升）加入（205) -个厌 氧血培养瓶，并将该血样的另一部分（例如10毫升）加入（210) -个需氧血培养瓶。如果 厌氧和需氧PBC瓶内均得到阳性信号（215)，则表明存在一种微生物。将一份厌氧PBC血 样，如5毫升血样转移到（220) -个试管中。在该PBC血样中加入一份，例如5毫升本文所 述的"裂解加清洗"缓冲液，形成一种混合物，该缓冲液含有为保持肺炎球菌的活性而选定 浓度，如〇. 335克/升的Triton? X-100。对该混合液进行一段时间（例如5分钟）的温育 (230)，以裂解其中的血细胞。然后对该混合液进行离心分离（235)，产生一个绿色团块，这 即可视为血样中存在肺炎球菌的早期迹象（240)。获得肺炎球菌存在的早期迹象后（240)， 制备一份该厌氧PBC血样（245)，通过本文所述的任何方法进行下游分析，以从PBC血样中 隔离出活性微生物，包括，例如，按照图1中所述的方法，使用含有Triton? X-100的"裂解 加清洗"缓冲液，Triton? X-100的浓度为保持肺炎球菌的活性而选定，如0. 335克/升。
[0055] 实施例
[0056] 实施例1
[0057] 在血培养瓶中接种产气肠杆菌（ATCC 13048)或金黄色葡萄球菌（ATCC 43300MRSA)，并温育至出现阳性信号为止，获得阳性血培养（PBC)样本。将该PBC血样的一 部分（5毫升）从瓶中直接取出后加入一个15毫升的锥形管。在该PBC血样中加入氯化胆碱 (〇. 5毫升的20 %氯化胆碱溶液），在室温下温育20分钟后，用Beckman J6-MI离心机和一 个JS-4. 2转子，在132g的加速度下进行5分钟的离心分离。将上清液加入另一个15毫升 的锥形管，并与5毫升含16克/升氯化铵、6. 7克/升Triton? X-100和BD Bactec Lytic 1〇(目录号：442265)的"裂解加清洗"缓冲液混合。在室温下对混合物进行5分钟的温育。 然后将裂解的样本在1855g的加速度下进行10分钟的离心分离。在清除上清液后，将留下 的团块悬浮在4.5毫升BD Phoenix? ID肉汁（目录号：246001)中。将一部分回收的微生 物用来通过平板测数法确定微生物的活性。平板测数法的活性测定结果表明，裂解后的产 气肠杆菌浓度为1.85x 109cfu/毫升，而裂解之前在PBC血样中的含量为1.65x 109cfu/毫 升。活性测定结果还表明，裂解后的金黄色葡萄球菌浓度为1.25x 108cfu/毫升，而裂解之 前在PBC血样中的含量为2. 00x 108cfu/毫升。
[0058] 用BD Phoenix? ID肉汁将另一份回收的细菌悬浮液进一步稀释至浓度为0. 5麦 克法兰（McFarland)，用于 Phoenix? ID/AST 检测。BD Phoenix? ID/AST 系统如美国专利 号为 5, 922, 593、6, 096, 272、6, 372, 485、6, 849, 422、和 7, 115, 384 的专利所述，这些专利的 内容在此通过引用已全部并入本文。将上述接种的菌剂一部分通过Phoenix? ID用于表型 鉴定，将其倒入BD Phoenix? ID/AST检测板的鉴定部分（碧迪公司）并用一个塑料盖密封。 将上述接种的菌剂的另一部分通过Phoenix? AST用于AST检测，将其倒入BD Phoenix?ID/ AST检测板的AST部分（碧迪公司）并用一个塑料盖密封。为每个隔离出的微生物团块计 算一系列抗生素的抗菌药物敏感性最小抑菌浓度（MIC)。将微生物团块的MIC结果与用相 同菌株的平板纯培养物（"对照"）的MIC结果进行对比。对比后可看出检测方法所得出的 结果是否与对照方法实质上等同，即测定测试方法和对照方法之间的基本一致率（EA)。如 果稀释差（dilution difference)为0,表明检测方法和对照方法完全一致。稀释差为-1或 1表明检测方法被视为属于对照方法的基本一致率范围内，也即在试验的正常误差范围内。 稀释差如果超出此范围，例如 _4、+4、_3、+3、_2、和+2等，则表明结果不在抗生素/微生物 测试的基本一致范围内。AST结果的方法和验证的详细描述见《临床微生物学实验室程序的 验证与确认》（ASM Press，1997 年 2 月）（"Verification and Validation of Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory，'，Cumitech 31, (Feb. 1997, ASM Press)) 一 文。
[0059] 从两份PBC血样中回收的细菌的Phoenix?鉴定结果均正确，均鉴定为产气肠杆菌 和金黄色葡萄球菌，两份血样的置信度均为99%。Phoenix? AST检测的结果表明与从板上 菌落中制备的样本相比，一致率（EA)为100%，即稀释差在-1到+1的稀释差范围内。金黄 色葡萄球菌的AST检测结果包括正确鉴定出该MRSA菌株应有的四（4)个耐性因子，包括耐 甲氧西林葡萄球菌（MRS)、mecA介导的耐药葡萄球菌（mecA)、产生β -内酰胺酶的葡萄球 菌的 MLSb 显型（STAMLS)。
[0060] 这些结果表明，本文所述的"裂解加清洗"缓冲液可用于从PBC血样中隔离出活性 微生物，用于下游鉴定和AST检测。
[0061] 实施例2
[0062] 通过在血培养瓶中接种屎肠球菌（ATTC 700221)、粪肠球菌（ATCC 51299)、金黄 色葡萄球菌（ATCC 43300)或奇异变形杆菌（ATCC 29906)获得四种阳性血培养样本。制备 四种不同的"裂解加清洗"缓冲液，其配方的汇总见下方表1。 表1:
【权利要求】
1. 一种用于从阳性血培养样本中隔离和浓缩活性微生物的缓冲液，该缓冲液包含一种 基液、至少一种非离子型清洗剂、至少一种硫醇，并且选择性地包含氯化铵，其中所述缓冲 液中基液、至少一种非离子型清洗剂、至少一种硫醇的含量是根据保持肺炎球菌的活性的 要求而选择的。
2. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述至少一种非离子型清洗剂包含Triton X-100，其在所述缓冲液中的浓度不超过约1克/升。
3. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述至少一种非离子型清洗剂包含Triton X-100，其在所述缓冲液中的浓度约为0. 335克/升。
4. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述的基液包含从由一种营养肉汁、一种等渗缓 冲液、一种蛋白胨和一种盐溶液的一组物质中所选出的至少一种。
5. 如权利要求4所述的缓冲液，其中所述缓冲液中的营养肉汁浓度为约10克/升至 50克/升。
6. 如权利要求4所述的缓冲液，其中所述营养肉汁含有胰蛋白胨大豆肉汁。
7. 如权利要求4所述的缓冲液，其中所述的等渗缓冲液包含从由磷酸钠、磷酸钾、磷酸 盐缓冲的盐溶液和盐溶液组成的一组物质中选出的至少一种。
8. 如权利要求4所述的缓冲液，其中缓冲液中等渗缓冲液的浓度为约1克/升至20克 /升。
9. 如权利要求4所述的缓冲液，其中所述的蛋白胨从一组包含酪蛋白胨和大豆蛋白胨 的蛋白胨中选出。
10. 如权利要求4所述的缓冲液，其中所述的基液包含从由丙酮酸钠、酵母提取物、柠 檬酸钠、肉蛋白胨、右旋葡萄糖和磷酸盐缓冲的盐溶液组成的一组物质中选出的至少一种。
11. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述至少一种非离子型清洗剂从由Triton系列 清洗剂、皂苷、Bri j系列清洗剂、辛基-b-葡糖苷、Tergitol系列清洗剂、CYMAL系列清洗剂、 MEGA系列清洗剂、PLUR0NIC系列清洗剂和CHAP系列清洗剂所组成的一组清洗剂中选出。
12. 如权利要求2所述的缓冲液，进一步包括至少另一种非离子型清洗剂，该清洗剂在 所述缓冲液中的浓度为约〇. 01克/升至20克/升。
13. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述至少一种硫醇从由L-盐酸半胱氨酸、巯基乙 酸钠、巯基乙胺、巯基丁二酸、巯基乙醇、巯基乙磺酸和硫代甘油组成的一组物质中选出。
14. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述至少一种硫醇在所述缓冲液中的浓度为约 0.005克/升至4克/升。
15. 如权利要求1所述的缓冲液，该缓冲液进一步含有氯化铵。
16. 如权利要求15所述的缓冲液，其中氯化铵在缓冲液中的浓度为约0. 01克/升至 80克/升。
17. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述的基液包含磷酸盐缓冲的盐溶液、酵母提取 物、柠檬酸钠、肉蛋白胨、右旋葡萄糖和丙酮酸钠； 所述至少一种硫醇包含L-盐酸半胱氨酸和巯基乙酸钠；且 所述至少一种非离子型清洗剂包含皂苷和TritonX-100。
18. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述的基液包含胰蛋白胨大豆肉汁、酵母提取 物、柠檬酸钠、肉蛋白胨和丙酮酸钠； 所述至少一种硫醇包含L-盐酸半胱氨酸和巯基乙酸钠；且 所述至少一种非离子型清洗剂包含皂苷和TritonX-100。
19. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述基液包含胰蛋白胨大豆肉汁； 所述至少一种硫醇包含L-盐酸半胱氨酸和巯基乙酸钠；且 所述至少一种非离子型清洗剂包含皂苷和TritonX-100。
20. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述基液包含：酪蛋白胨，其在所述缓冲液中的 浓度为约8克/升至约35克/升、氯化钠，其在所述缓冲液中的浓度为约2克/升至10克 /升、大豆蛋白胨，其在所述缓冲液中的浓度为约1. 5克/至15克/升和磷酸钾，其在所述 缓冲液中的浓度为约〇. 5克至约5克/升； 所述至少一种硫醇包含：半胱氨酸，其在所述缓冲液中的浓度为约0. 01克/升至约 2. 5克/升和巯基乙酸钠，其在所述缓冲液中的浓度为约0. 01克/升至约2. 5克/升； 所述至少一种非离子型清洗剂包含：皂苷，其在所述缓冲液中的浓度为约0. 01克/升 至约10克/升和Triton X-100,其在所述缓冲液中的浓度为约0. 01克/升至约20克/ 升；且 所述选择性含有的氯化铵，如果含有，其在所述缓冲液中的浓度为约〇. 01克/升至约 80克/升。
21. 如权利要求1所述的缓冲液，该缓冲液进一步含有一种消泡剂。
22. 如权利要求1所述的缓冲液，其中所述至少一种非离子型清洗剂为皂苷和Triton X-100的混合物，且所述缓冲液不含消泡剂。
23. -种关于从阳性血培养样本中隔离和浓缩活性有机物的方法，包括： 将一种阳性血培养样本的一部分与如权利要求1所述的缓冲液混合后形成一种混合 物，其中所述缓冲液的量和阳性血培养样本的量之比能保证将细胞裂解，同时又能够保持 所述阳性血培养样本中微生物的活性； 可以选择对所述混合物进行温育； 对所述混合物进行离心分离，产生一个团块和上清液； 将所述上清液丢弃，同时保留所述团块； 用所述缓冲液使团块再次悬浮，生成一种团块的悬浮液； 对所述团块的悬浮液进行离心分离，再次产生上清液和第二个团块； 将再次产生的上清液丢弃，同时保留含有活性微生物的第二个团块。
24. 如权利要求23所述的方法，其中所述部分阳性血培养样本和等量的缓冲液混合， 形成所述的混合物。
25. 如权利要求23所述的方法，进一步包含将第二个团块用一种溶液进行再次悬浮， 并对第二个团块的悬浮液进行至少一次下游检测，所述至少一次检测从包含：质谱法鉴定 微生物、表型鉴定、药敏试验和分子检测的一组检测中选择。
26. 如权利要求23所述的方法，其中所述微生物从包含：革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性 细菌和酵母菌的一组微生物中选择。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述革兰氏阳性细菌为肺炎链球菌。
28. -种关于从阳性血培养样本中隔离和浓缩活性肺炎链球菌的方法，包括： 获得一份怀疑含有至少一种微生物的血样； 将该血样的一部分加入一个厌氧血培养瓶，并将该血样的另一部分加入一个需氧血培 养瓶； 从厌氧和需氧血培养瓶中获得阳性信号； 获得肺炎链球菌在所述血样中存在的早期迹象，做法是将一部分需氧阳性血培养样本 与如权利要求1所述的缓冲液混合后形成一种混合物，对该混合物进行温育，以裂解血样 中的血细胞，然后对该混合物进行离心分离后产生一个绿色团块，该团块即为血样中存在 肺炎链球菌的早期迹象； 制备一份厌氧阳性血培养样本，用于下游分析，包括： 将一部分厌氧阳性血培养样本与浓度不超过约1克/升的X-100混合后形成一种混合 物； 可以对该混合物进行温育； 对该混合物进行离心分离后，产生一个团块和一些上清液； 将所述上清液丢弃，同时保留所述团块； 用所述缓冲液对所述团块进行重新悬浮，生成团块的悬浮液； 对团块的悬浮液进行离心分离，再次产生上清液和第二个团块； 将再次产生的上清液丢弃，同时保留含活性肺炎链球菌的第二个团块。
29. 如权利要求28所述的方法，其中所述部分厌氧阳性血培养样本和等量的缓冲液混 合，形成所述的混合物。
30. 如权利要求28所述的方法，其中所述部分厌氧阳性血培养样本和X-100浓度为约 0. 335克/升的所述缓冲液混合，形成所述的混合物。
31. 如权利要求28所述的方法，进一步包含将第二个团块用一种溶液进行再次悬浮， 并对第二个团块的悬浮液进行至少一次下游检测，所述至少一次检测从包含：质谱法鉴定 微生物、表型鉴定、药敏试验和分子检测的一组检测中选择。
32. -个用于从阳性血培养样本中隔离和浓缩有机物的试剂盒，包含如权利要求1所 述的至少一种配方的试剂。
【文档编号】C12N1/20GK104254597SQ201380021036
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】苏珊.M.基歇尔, 万德.怀特, 威廉.B.布劳绍, 戴安.鲁波, 詹姆斯.Y.周, 朱莉.L.罗萨勒斯, 杰弗里.H.布鲁顿, 约翰.D.曼特罗, 阿德里安.P.麦立科, 唐纳德.R.卡利汉, 本.唐, 冯丽萍, 柯蒂斯.M.高斯内尔, 肖恩.比蒂, 约翰.P.道格拉斯 申请人:Bd公司