具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸的制作方法

具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分离的多肽、催化结构域，以及编码这些多肽或催化结构域的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同生产和使用这些多肽或催化结构域的方法。
【专利说明】具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽、催化结构域、结合结构域，以及编码 这些多肽、催化结构域、或结合结构域的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸 构建体、载体、和宿主细胞，以及生产和使用这些多肽、催化结构域和结合结构域的方法。
[0005] 相关技术说明
[0006] 可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料或包含木聚糖的材料进行预处理。优选 在水解前进行预处理。可替代地，可以同时用酶水解进行预处理，以释放可发酵糖，例如葡 萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵 糖（即使在没有酶的情况下）。
[0007] 预处理的目的是提高生产速率连同水解步骤中释放的糖的总产率。在化学预处理 (像例如酸预处理或碱预处理）的情况下，预处理的类型将对木质纤维素结构性组分具有 不同影响，并且因此取决于预处理方法，用于水解步骤的酶组合物可能不同。本方法的目标 是改善经预处理的包含木聚糖的材料的水解。
[0008] 本发明提供具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。使用具 有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽提供了用于改善特别是含木聚糖材料的水解的方法。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项 组成：
[0011] (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少 90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%、或100%序列一致性；或
[0012] 与SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100%序列一致性；或
[0013] 与SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%、或100 %序列一致性；
[0014] (b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在高严谨度条件或非常高严谨 度条件下与（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列、（ii)其CDNA序列、或（iii) (i)或（ii) 的全长互补体杂交；或
[0015] 或在非常高严谨度条件下与（iv)SEQ ID N0:3的成熟多肽编码序列、（V)其CDNA 序列、或（vi) (iv)或（V)的全长互补体杂交；
[0016] 或在非常高严谨度条件下与（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽编码序列、（viii)其 cDNA序列、或（ix) (vii)或（viii)的全长互补体杂交；
[0017] (c)由一种多核苷酸所编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1的成熟多肽 编码序列或其cDNA序列具有至少80%、至少85%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性；或
[0018] 与SEQ ID N0:3的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、 至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或 100 %序列一致性；或
[0019] 与SEQ ID N0:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至 少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%或100%序列一致性；或
[0020] (d)SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽的一种变体，该变体在 一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0021] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0022] 在一个相关的方面，本发明涉及包括如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的肽的 组合物。
[0023] 在又另一个相关的方面，本发明涉及用于生产如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活 性的肽的方法和或包括如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的的肽的组合物和/或重组 宿主细胞。
[0024] 另外，本发明涉及用编码如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的多核苷酸 转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
[0025] 此外，本发明的一个另外的相关的方面涉及一种产生亲本细胞的突变体的方法， 该方法包括使编码如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的多核苷酸失活，这导致该 突变体比该亲本细胞产生的该多肽少。
[0026] 本发明还涉及一个双链抑制性RNA(dsRNA)分子，该RNA(dsRNA)分子包括编码 如上所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的一种分离的多核苷酸的一个子序列，其中 任选地该dsRNA是一种siRNA或一种miRNA分子，以及抑制具有葡萄糖醛酸酯酶活性的 多肽在细胞中的表达的方法，该方法包括向该细胞给予或在该细胞中表达该双链抑制性 RNA(dsRNA)分子，以及涉及通过所述方法产生的细胞。
[0027] 在一个相关的方面，本发明涉及编码一种信号肽的一种分离的多核苷酸、包括该 信号肽的重组宿主细胞，以及生产一种蛋白的方法，其中对包括该信号肽的重组宿主细胞 进行培养并回收该蛋白。具体地，本发明的信号肽包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至17或 SEQ ID N0:4的氨基酸1至17或SEQ ID N0:6的氨基酸1至20或由其组成。
[0028] 本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，这些方法包括：在具有葡萄糖 醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
[0029] 本发明还涉及用于产生发酵产物的方法，包括：(a)在具有葡萄糖醛酸酯酶活性 的多肽的存在下，用一种酶组合物对一种纤维素材料进行糖化；(b)用一种或多种发酵微 生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且（c)从发酵中回收该发酵产 物。
[0030] 本发明还涉及对纤维素材料进行发酵的方法，这些方法包括用一种或多种发酵微 生物对该纤维素材料进行发酵，其中该纤维素材料是在具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的 存在下用酶组合物进行糖化。
[0031] 附图简要说明
[0032] 图1显示在β_葡聚糖酶和β_木糖苷酶的酶促背景上添加四种葡萄糖醛酸酯 酶之后对经预处理的玉米纤维的转化百分率的影响的比较研究。样品：样品Α，一色齿毛菌 (C.unicolor) (SEQ ID Ν0:2);样品 Β，里氏木霉（SEQ ID Ν0:4);样品 C，球毛壳菌（SEQ ID NO:6)〇
[0033] 图2显示在β-葡聚糖酶和β-木糖苷酶的酶促背景上添加四种葡萄糖醛酸 酯酶之后对葡糖醛酸（g/kg DM)的释放的影响的比较研究。样品：样品Α，一色齿毛菌 (C.unicolor) (SEQ ID N0:2);样品 B，里氏木霉（SEQ ID N0:4);样品 C，球毛壳菌（SEQ ID NO:6)〇
[0034] 定义
[0035] 纤维素分解活性术语"纤维素分解活性"意指水解一种纤维素材料的生物 活性。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：（1)测量总纤维素分解活性， 以及⑵测量个体纤维素分解活性（葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和β_葡糖苷 酶），如在张（Zhang)等人，对纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略（Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies), 2006,生物技术进展 (Biotechnology Advances) 24:452-481中综述。通常使用不溶性底物对总纤维素分解活 性进行测定，包括沃特曼一号（Whatman Ml)滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、 棉花、经过预处理的木质纤维素等。最常用的总纤维素分解活性测定法是使用沃特曼一 号滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC)(高斯 (Ghose)，1987,纤维素酶活性的测量（Measurement of cellulase activities)，纯粹与应 用化学（Pure Appl.Chem. )59:257-68)确立的。
[0036] 出于本发明的目的，通过测量在以下条件下由一种或多种纤维素分解酶进行的纤 维素材料水解的增加来测定纤维素分解酶活性：l_2〇mg的纤维素分解蛋白/g于PCS中的 纤维素，在50°C -65°C下持续3-7天，与未添加纤维素分解蛋白的对照水解相比较。典型 条件为：1ml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠 （pH 5)，lmM MnS04， 50°C -65°C，72小时，通过AMINEX? HPX-87H柱（伯乐实验室有限公司，美国加州赫拉克 勒斯）进行的糖分析。
[0037] 内切葡聚糖酶：术语"内切葡聚糖酶"意指一种内切-1，4-(1，3 ;1，4)_ β -D-葡聚 糖4-葡聚糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物（如羧甲基纤维素和羟 乙基纤维素）、地衣多糖中的l，4-i3-D-糖苷键和混合β-1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚 糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β_1，4键的内切水解。可以通过 测量底物粘度的减小，或通过还原糖测定确定还原端增加来确定内切葡聚糖酶活性（张等 人，2006,生物技术进展24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯，1987,纯粹与应用化学 59:257-268的程序，在pH 5、40°C下，使用羧甲基纤维素（CMC)作为底物，确定内切葡聚糖 酶活性。
[0038] 纤维二糖水解酶：术语"纤维二糖水解酶"是指一种l，4-i3_D-葡聚糖纤维二 糖水解酶（E.C. 3. 2. 1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β-1，4-连接的葡萄糖 的聚合物中的l，4-i3-D-糖苷键水解，从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖（泰里 (Teeri)，1997,晶态纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新见解（Crystalline cellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases),生物技术趋 势（Trends in Biotechnology) 15:160-167 ;泰里（Teeri)等人，1998,里氏木霉纤维二糖 水解酶：为何对晶态纤维素如此有效？（Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose ?)，生物化学学会学报（Biochem. Soc. Trans. )26:173-178)。出于本发明的目的，根据范·帝伯赫（van Tilbeurgh)等人，1982， 欧洲生化学会联合会快报（FEBS Letters) ,149:152-156以及范?帝伯赫和克莱森斯 (Claeyssens)，1985,欧洲生化学会联合会快报，187:283-288所述的程序，使用一种荧光二 糖衍生物4-甲基伞形酮基-β -D-乳糖在pH 5、40°C下确定纤维二糖水解酶活性。
[0039] β -葡糖苷酶：术语" β -葡糖苷酶"意指一种β -D-葡糖苷葡糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 21)，其催化末端非还原性β -D-葡萄糖残基的水解，并释放β -D-葡萄糖。 出于本发明的目的，根据文丘里（Venturi)等人，2002,来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外 β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性（Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum:production, purification and some biochemical properties),基础微生物学杂志（J. Basic Microbiol. )42:55-66 描述的基 本程序确定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在40°C、pH 5下，在含有 0. 01%TWEEN? 20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄 糖苷每分钟产生1. 〇微摩尔的对硝基苯酚。
[0040] 纤维素分解增强活性：术语"纤维素分解增强活性"意指由一种GH61多肽催化的 生物活性，该GH61多肽增强具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解。出于本发明 的目的，通过在以下条件下测量来自由纤维素分解酶水解纤维素材料的还原糖的增加或纤 维二糖与葡萄糖总量的增加来测定纤维素分解增强活性 ：l_5〇mg总蛋白/g于PCS中的纤 维素，其中总蛋白由50% -99. 5% w/w纤维素分解蛋白和0. 5% -50% w/w具有纤维素分 解增强活性的GH61多肽的蛋白构成，在50°C _65°C持续1-7天，与不具有纤维素分解增强 活性的相等总蛋白装载的对照水解（l-50mg纤维素分解蛋白/g于PCS中的纤维素）相比 较。在一个优选方面，使用在总蛋白质重量的3%的米曲霉（Aspergillus oryzae) β -葡糖 苷酶（根据W0 02/095014在米曲霉中重组产生）或总蛋白质重量的3%的烟曲霉β-葡 糖苷酶（如W0 2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生）的纤维素酶蛋白负载量存 在的情况下CELLUCLAST? 1.5L(诺维信公司（Novozymes A/S)，丹麦巴格斯瓦尔德 (Bagsvaerd, Denmark))的混合物作为纤维素分解活性的来源。
[0041] 具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维 素分解酶的量降低优选至少1. 01倍、更优选至少1. 05倍、更优选至少1. 10倍、更优选至少 1. 25倍、更优选至少1. 5倍、更优选至少2倍、更优选至少3倍、更优选至少4倍、更优选至 少5倍、甚至更优选至少10倍、以及最优选至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶 催化的纤维素材料的水解。
[0042] 家族61糖苷水解酶：术语"家族61糖苷水解酶"或"家族GH61"或"GH61" 意指根据亨利萨特（Henrissat) B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分 类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志（Biochem.J. )280:309-316 ;和亨利萨特B.和贝洛赫 (Bairoch)A.，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类（Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases)，生物化学杂志 316:695-696 属于糖苷水解酶家 族61的多肽。
[0043] 木聚糖降解活性：术语"木聚糖降解活性"或"木聚糖分解活性"意指水解含有木 聚糖的材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括：（1)测量总木聚 糖分解活性，并且（2)测量单独的木聚糖分解活性（内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、阿拉伯 呋喃糖苷酶、α-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、以及α-葡萄糖醛酸酯 酶）。木聚糖分解酶测定的最近进展总结于若干出版物中，这些出版物包括：别雷（Biely) 和普乔尔德（Puchard)，木聚糖分解酶测定的最近进展（Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes)，2006,食品与农业科学杂志（Journal of the Science of Food and Agriculture)86(ll) :1636-1647 ;斯帕尼科瓦（Spanikova)和别雷，2006,葡萄糖醒 酸酯酶_由产生的新型碳水化合物酯酶裂裙菌（Schizophyllum commune) (Glucuronoyl esterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune),欧洲 生化学会联合会快报580 (19) :4597-4601 ;赫尔曼（Herrmann)、沃散斯卡（Vrsanska)、尤 日奇科娃（Jurickova)、赫西（Hirsch)、另ij雷、以及库比切克（Kubicek)，1997,里氏木霉 的β-D-木糖苷酶是一种多功能β-D-木聚糖木糖水解酶（The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase),生物化学杂 志 321:375-381。
[0044] 总木聚糖降解活性可以通过测定由不同类型的木聚糖（包括例如燕麦（oat spelt)木聚糖、山毛榉木木聚糖、以及落叶松木木聚糖）形成的还原糖，或通过光度法 测定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖 分解活性测定基于由聚合4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖产生的还原糖，如描述于别雷，别 雷，Poutanen(坡泰恩），1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity(用于木聚糖酶活性测定的多个实验室测试方法），Journal of Biotechnology (生物技术杂志）23(3) :257-270 中。
[0045] 出于本发明的目的，通过测量在以下典型条件下由一种或多种木聚糖降解酶引 起的桦木木聚糖（西格玛化学有限公司（Sigma Chemical Co.，Inc.)，美国密苏里州圣 路易斯（St. Louis，M0, USA))水解的增加来确定木聚糖降解活性：1ml反应、5mg/ml底物 (总固体）、5mg木聚糖分解蛋白/g底物、50mM乙酸钠 （pH 5)、50°C、24小时，使用如里弗 (Lever) ,1972,用于碳水化合物的比色测定的新反应（A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates)，分析生物化学47:273-279所描述的对轻基苯甲酸醜 肼（PHBAH)测定进行糖分析。
[0046] 木聚糖酶：术语"木聚糖酶"意指1，4- β -D-木聚糖-木糖水解酶（E. C. 3. 2. 1. 8)， 其催化木聚糖中的1，4-β -D-木糖苷键的内切水解。为了本发明的目的，使用桦木木聚糖 作为底物确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶定义为在50°C、pH 5下的初始期水解 中，在含有0. 01 % TWEEN? 20的50mM乙酸钠中从作为底物的2g桦木木聚糖每公升每 分钟产生1.〇μ摩尔还原糖（以如里弗（LeVer)，1972,用于碳水化合物的比色测定的新反 M (A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates),分析生物化 学（Anal. Biochem) 47:273-279所述的葡萄糖当量测量）。
[0047] β -木糖苷酶：术语"β -木糖苷酶"意指一种β-D-木糖苷木糖水解酶 (E. C. 3. 2. 1. 37)，其催化短β (1 - 4)-木寡糖的外水解，以从非还原性末端去除连续的 D-木糖残基。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40°C、pH 5下在含有 0. 01%TWEEN? 20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷每 分钟产生1. 0微摩尔的对硝基苯酚。
[0048] 乙酰木聚糖酯酶：术语"乙酰木聚糖酯酶"的意思是一种羧酸酯酶（EC3. 1. 1. 72)， 其催化乙酰基自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α -萘基乙酸酯、和对硝基苯基 乙酸酯的水解。为了本发明的目的，用〇. 5mM对硝基苯基乙酸酯作为底物，在含有0. 01 % TWEEN?20的50mM乙酸钠（pH5. 0)中，对乙酰木聚糖酯酶的活性进行测定。一个单位的乙酰 木聚糖酯酶被定义为，在pH 5, 25°C，每分钟能够释放1 μ mol对硝基酚根阴离子的酶的量。
[0049] 阿魏酸酯酶：术语"阿魏酸酯酶"意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶（EC 3. 1.1. 73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基（阿魏酰基）基团从酯化的糖（其在"天 然"底物中通常为阿拉伯糖）的水解，以产生阿魏酸酯（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸酯）。阿 魏酸酯酶（Feruloyl esterase)也被称为阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase)、轻基肉 桂酰基酯酶、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I、或FAE-II。为了本发明的目 的，使用〇. 5mM对硝基苯阿魏酸酯作为底物在50mM乙酸钠中在pH 5. 0对阿魏酰酯酶的活 性进行测定。一个单位的阿魏酸酯酶等于，在pH 5, 25°C，每分钟能够释放1 μ mol的对硝基 酚根阴离子的酶的量。
[0050] α-葡糖醛酸糖苷酶：术语"α-葡糖醛酸糖苷酶"是指可催化α-D-葡萄 糖苷酸水解成为D-葡萄糖醛酸酯和醇的一种α-D-葡萄糖苷酸葡萄糖醛酸水解酶 (EC 3. 2. 1. 139)。出于本发明的目的，根据德弗里斯（de Vries)，1998,细菌学杂志 (J.Bacteriol. ) 180:243-249来测定α-葡糖醛酸糖苷酶活性。一个单位的α-葡糖醛酸 糖苷酶等于能够在pH 5、40°C下每分钟释放1微摩尔的葡糖醛酸或4-0-甲基葡糖醛酸的酶 的量。
[0051] 本发明的这些多肽具有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽 的至少60%，例如至少70%、至少80%、至少90%、至少92%、至少93%、至少94%、至少 95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或至少100 %的葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0052] α -L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语" a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶"意指一种a -L-阿拉 伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶（EC 3. 2. 1. 55)，其催化a -L-阿拉伯糖苷中的末端非还原 性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有（1，3)_和/或 (1，5)_键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿 拉伯呋喃糖苷酶还被称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿 拉伯呋喃糖苷酶、多糖a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯 糖苷酶、或α-L-阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用每ml的100mM乙酸钠 （pH 5) 中5mg的中等粘度小麦阿拉伯糖基木聚糖（麦格酶国际爱尔兰股份有限公司（Megazyme International Ireland, Ltd.)，爱尔兰威克洛郡布瑞公司（Bray, Co. Wicklow, Ireland)以 总体积200 μ 1在40°C下持续30分钟，接着通过AMINEX? HPX-87H柱色谱（伯乐实验 室有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.)，美国加州赫拉克勒斯（Hercules, CA, USA)进 行阿拉伯糖分析来测定a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0053] 纤维素材料：该纤维素材料可以是包括纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁 中的主要多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞停止生长后产 生的次生细胞壁也包含多糖，并且它通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤 维素是脱水纤维二糖的均聚物，因此是一种线性i3-(l-4)_D-葡聚糖，而半纤维素包括多 种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚 糖、以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链 的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定 细胞壁基质。
[0054] 纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮、以及穗轴，或树的叶、枝、以及木材中。 纤维素材料可以是，但不限于：草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸、以 及纸浆和造纸厂残余物（参见，例如，维色洛戈尔（Wiselogel)等人，1995,于生物乙醇手 册（Handbook on Bioethanol)(查尔斯· E ·怀曼（Charles E. Wyman)编辑），第 105-118 页，泰勒弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington D.C.);怀曼 (Wyman)，1994,生物资源技术（Bioresource Technology)50:3_16;林德（Lynd)，1990,应 用生物化学与生物技术（Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695_719; 莫思尔（Mosier)等人，1999,木质纤维素的生物转化的最近进展（Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics)，生物化学工程 / 生物技术的进展（Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology)，T·谢伯（T.Scheper)主编，第 65 卷，第 23-40 页，纽约斯普林格出版社（Springer-Verlag，New York)。在此应该理解的是，纤维素可以处 于木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。 在一个优选方面，该纤维素材料是木质纤维素。
[0055] 在一个方面，纤维素材料是草本材料。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。 在另一个方面，纤维素材料是林业残余物。在另一个方面中，该纤维素材料是城市固体废 物。在另一个方面中，纤维素材料是废纸。在另一个方面中，纤维素材料是纸浆和造纸厂残 余物。
[0056] 在另一个方面中，纤维素材料是玉米秸杆。在另一个方面中，纤维素材料是玉米纤 维。在另一个方面中，纤维素材料是玉米芯。在另一个方面中，纤维素材料是橘皮。在另一 个方面中，纤维素材料是稻草。在另一个方面中，纤维素材料是小麦杆。在另一个方面，纤 维素材料是柳枝稷。在另一个方面中，纤维素材料是芒草。在另一个方面中，纤维素材料是 甘蔗渣。
[0057] 在另一个方面中，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是细菌 纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是海藻纤维素。在另一个方面中，纤维素材料是棉短 绒。在另一个方面，纤维素材料是无定形磷酸处理的纤维素。在另一个方面中，纤维素材料 是滤纸。
[0058] 纤维素材料可以按原样使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理，如在 此所描述。在一个优选方面，纤维素材料进行了预处理。
[0059] 预处理的玉米秸杆：术语"PCS"或"预处理的玉米秸杆"是指通过用热和稀硫酸处 理源自玉米秸杆的纤维素材料。
[0060] 含有木聚糖的材料：术语"含有木聚糖的材料"意指包含含有β-α-4)连接的木 糖残基主链的植物细胞壁多糖的任何材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木 糖主链的杂聚物，其通过短的碳水化合物链分支。它们包括D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、 L-阿拉伯糖、和/或不同的低聚糖，这些低聚糖由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、以 及D-葡萄糖构成。可以将木聚糖类型的多糖分成同源木聚糖（homoxylan)和异源木聚糖 (heteroxylan)，包括葡糖醛酸木聚糖、（阿拉伯糖）葡糖醛酸木聚糖、（葡糖醛酸）阿糖基 木聚糖、阿糖基木聚糖、以及复杂的异源木聚糖。参见，例如，埃伯林格罗瓦（Ebringerova) 等人，2005,聚合物科学进展（Adv. Polym. Sci.) 186:1-67。
[0061] 在本发明的方法中，可以使用含有木聚糖的任何材料。在一个优选方面，含有木聚 糖的材料是木质纤维素。
[0062] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个 或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是静默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0063] 结合结构域：术语"结合结构域"例如"纤维素结合结构域"是指介导酶结合至纤 维素底物的非晶区域的酶的区域。纤维素结合结构域（CBD)典型地发现于葡萄糖醛酸酯酶 的N-末端或C-末端末尾。
[0064] 催化结构域：术语"催化结构域"意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。
[0065] cDNA:术语"cDNA"是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子 的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先 的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤 进行加工，包括剪接。
[0066] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0067] 控制序列：术语"控制序列"是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的 核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的（即，来自相同基 因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括 但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少， 控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码 一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供 有多个接头。
[0068] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0069] 表达载体：术语"表达载体"意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种 多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
[0070] 片段：术语"片段"是指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端删除的一个 或多个（例如，若干个）氨基酸的一种多肽或一个催化或纤维素结合结构域；其中该片段 具有葡萄糖醛酸酯酶或纤维素结合活性。在一个方面，一个片段包括SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽的氨基酸数目的至少85%、90%、以及95%。
[0071] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构 建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制 期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0072] 分离的或纯化的：术语"分离的"或"纯化的"意指从其中去除与其天然相关的至少 一种组分的多肽或多核苷酸。例如，如通过SDS-PAGE确定的，多肽可以是至少1 %纯，例如 至少5 %纯、至少10 %纯、至少20 %纯、至少40 %纯、至少60 %纯、至少80 %纯、至少90 %纯 或至少95%纯，并且如通过琼脂糖电泳确定的，多核苷酸可以是至少1%纯，例如至少5% 纯、至少10 %纯、至少20 %纯、至少40 %纯、至少60 %纯、至少80 %纯、至少90 %纯、或至少 95%纯。
[0073] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰（例如N-端加工、C-端 截短、糖基化、磷酸化等）之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，如使用预测SEQ ID NO:2的氨基酸1至17、SEQ ID NO:4的氨基酸1至17、SEQ ID NO:4的氨基酸21至690或 SEQIDN0:6的氨基酸l至20是信号肽的信号P(SignalP)(尼尔森（Nielsen)等人，1997， 蛋白质工程（Protein Engineering)10:l-6)预测的，该成熟多肽是SEQ ID N0:2的氨基酸 1至474、SEQ ID N0:4的氨基酸1至460或SEQ ID N0:6的氨基酸1至392。本领域中已 知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽（即， 具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸）的混合物。
[0074] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有葡萄糖醛酸酯酶活 性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面，基于预测SEQ ID NO: 1的核苷酸1至66、 SEQ ID N0:3的核苷酸1至60、SEQ ID N0:5的核苷酸1至45和SEQ ID N0:7的核苷酸1 至81编码信号肽的信号P (SignalP)程序（尼尔森等人，1997,同上），该成熟多肽编码序列 是SEQIDN0:1的核苷酸1至 2544、SEQIDN0:3的核苷酸1至 2526、SEQIDN0:5的核苷 酸1至2508、SEQ ID N0:7的核苷酸1至2124或其cDNA序列。
[0075] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的 基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包 括一个或多个控制序列。
[0076] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指一种配置，其中一个控制序列相对于一 种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
[0077] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列 一致性"描述。
[0078] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传 学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所实 施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德尔曼和翁施，1970,分子生物学杂志 (J. Mol. Biol. )48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数 是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩 阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致 性，并且如下计算：
[0079](一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0080] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套 件，赖斯等人，2000,同上）（优选5. 0. 0版或更新版本）的Needle程序中所实施的尼德尔 曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,同上）来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序 列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化 选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0081] (一致的脱氧核糖核苷酸X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0082] 子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编 码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有葡萄糖醛酸酯酶活性 的一个片段。在一个方面，一个子序列包含SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的 成熟多肽的氨基酸数目的至少85 %、90 %、以及95 %。
[0083] 变体：术语"变体"是指包括改变（即在一个或多个位置处取代、插入、和/或删 除一个或多个（例如若干个）氨基酸残基）的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一个多肽。取代 意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸置换；缺失意指除去占据一个位置的氨基 酸；并且插入意指与占据一个位置的氨基酸相邻来添加一个或多个（例如，若干个）氨基 酸，例如1-5个氨基酸。
[0084] 发明详细说明
[0085] 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽
[0086] 本发明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分离的多肽，该多肽选自下组，该组由以 下各项组成：
[0087] (a)与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一种多肽；
[0088] (b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在高或非常高严谨度条件下与 (i)SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全长互补 体杂交；
[0089] (c)由与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；
[0090] (d) SEQ ID N0:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位 置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0091] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0092] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0093] 本发明还涉及编码包括SEQ ID N0:2的氨基酸1至17或由其组成的信号肽的一种 多核苷酸、编码包括SEQ ID N0:2的氨基酸101至474或由其组成的前肽的一种多核苷酸、 或编码包括SEQ ID N0: 2的氨基酸1至474或由其组成的信号肽和前肽的一种多核苷酸， 其每一者被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；涉及核酸构建体、表达载体、以及包括 这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及涉及产生一种蛋白质的方法。
[0094] 本发明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分离的多肽，该多肽选自下组，该组由以 下各项组成：
[0095] (a)与SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一种多肽；
[0096] (b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在高或非常高严谨度条件下与 (i)SEQ ID N0:3的成熟多肽编码序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全长互补 体杂交；
[0097] (c)由与SEQ ID N0:4的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；
[0098] (d) SEQ ID N0:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位 置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0099] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0100] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0101] 本发明还涉及编码包括SEQ ID N0:4的氨基酸1至17或由其组成的信号肽的一种 多核苷酸、编码包括SEQ ID N0:4的氨基酸17至460或由其组成的前肽的一种多核苷酸、 或编码包括SEQ ID N0:4的氨基酸1至460或由其组成的信号肽和前肽的一种多核苷酸， 其每一者被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；涉及核酸构建体、表达载体、以及包括 这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及涉及产生一种蛋白质的方法。
[0102] 本发明涉及具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分离的多肽，该多肽选自下组，该组由以 下各项组成：
[0103] (a)与SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少80%序列一致性的一种多肽；
[0104] (b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在高或非常高严谨度条件下与 (i)SEQ ID N0:6的成熟多肽编码序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全长互补 体杂交；
[0105] (c)由与SEQ ID N0:6的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一种多核苷酸编码的一种多肽；
[0106] (d) SEQ ID N0:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位 置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0107] (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
[0108] 本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0109] 本发明还涉及编码包括SEQ ID N0:6的氨基酸1至20或由其组成的信号肽的一种 多核苷酸、编码包括SEQ ID N0:6的氨基酸21至392或由其组成的前肽的一种多核苷酸、 或编码包括SEQ ID N0:6的氨基酸1至392或由其组成的信号肽和前肽的一种多核苷酸， 其每一者被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；涉及核酸构建体、表达载体、以及包括 这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及涉及产生一种蛋白质的方法。
[0110] 本发明还涉及抑制表达或者产生与序列SEQ ID:N0:2、SEQ ID N0:4、或SEQ ID N0:6 中任一项具有至少 68%，例如像 70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或 100%序列 一致性的一种或多种肽的方法。
[0111] 另外，本发明涉及一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在具有葡萄糖醛 酸酯酶的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料，该多肽与序列SEQ ID:N0:2、 SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6 中任一项具有至少68%，例如像70%、75%、80%、85%、90%、 95%、99%或100%序列一致性。
[0112] 在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%，例如至 少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有葡 萄糖醛酸酯酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽只有不超过十个氨基 酸不同，例如九个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、 三个氨基酸、两个氨基酸、或一个氨基酸。
[0113] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组 成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。在另一个方面，多肽包括SEQ ID N0:2的成熟 多肽或由其组成。在另一个优选的方面，多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸101至474或由 其组成。
[0114] 在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID N0:4的成熟多肽具有至少95%，例如至少 96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的分离的多肽，该分离的多肽 具有葡萄糖醛酸酯酶活性。在一个方面，这些多肽与SEQ ID N0:4的成熟多肽只有不超过 十个氨基酸不同，例如九个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四 个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸、或一个氨基酸。
[0115] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组 成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。在另一个方面，多肽包括SEQ ID N0:4的成熟 多肽或由其组成。在另一个优选的方面，多肽包括SEQ ID NO:4的氨基酸94至460或由其 组成。
[0116] 在一个实施例中，本发明涉及与SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少92%，例如至 少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列 一致性的分离的多肽，这些分离的多肽具有葡萄糖醛酸酯酶活性。在一个方面，这些多肽与 SEQ ID N0:6的成熟多肽只有不超过十个氨基酸不同，例如九个氨基酸、八个氨基酸、七个 氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸、或一个氨基酸。
[0117] 本发明的多肽优选地包括SEQ ID N0:6的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组 成；或是其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。在另一个方面，多肽包括SEQ ID N0:6的成熟 多肽或由其组成。在另一个优选的方面，多肽包括SEQ ID NO:6的氨基酸21至392或由其 组成。
[0118] 在另一个实施例中，本发明涉及由一种多核苷酸编码的具有葡萄糖醛酸酯酶活性 的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中高严谨 度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的成熟多肽编码序列，（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴或（ii)的全长 互补体（萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,分子克隆实验指南（Molecular Cloning, A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港（Cold Spring Harbor)，纽约）。
[0119] 可以使用 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5或其子序列，以及SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的多肽或其片段来设计核酸探针以便根据本领域熟知的方法鉴 定和克隆编码来自不同属或物种的菌株的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的DNA。具体而 言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交， 以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15， 例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷 酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷 酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA 和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记（例如，用3午、3!1、355、生物素、或抗生物素蛋 白），以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
[0120] 可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的 DNA对由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自这类其他菌株的基因 组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自 文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为鉴定 与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5或其子序列同源的克隆或DNA，该运载体材料 优选地在DNA印迹法中使用。
[0121] 出于本发明的目的，杂交指示该多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与对应 于以下各项的经过标记的核酸探针杂交：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5;(ii) SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5 的成熟多肽编码序列；（iii)cDNA序列；（iv)其全 长补体；或（v)其子序列。在这些条件下，核酸探针杂交的分子可以使用例如X-射线胶片 而进行检测。
[0122] 在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的多 肽，其成熟多肽，或其片段的多核苷酸。在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:5 或其 cDNA 序列。
[0123] 对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，非常低严谨度条件被定义为最佳地， 遵循标准DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3%SDS、200 毫克 / ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交12至24小时12至24小时。 载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0124] 对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，低严谨度条件被定义为最佳地，遵循 标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 毫克/ml 剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交12至24小时。载体材料最终使 用2X SSC、0. 2% SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0125] 对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，中严谨度条件被定义为最佳地，遵循 标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交并杂交12至24小时。载体材料最终使 用2X SSC、0. 2% SDS，在55°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0126] 对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，中-高严谨度条件被定义为最佳地，遵 循标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 / ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和亦或35%甲酰胺中预杂交并杂交12至24小时。载体材 料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0127] 对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，高严谨度条件被定义为最佳地，遵循 标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0. 3% SDS、200 毫克 /ml 剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交12至24小时。载体材料最终使 用2X SSC、0. 2% SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0128] 对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，非常高严谨度条件被定义为最佳地， 遵循标准 DNA 印迹（Southern blotting)程序，在 42°C下在 5X SSPE、0.3% SDS、200 毫克 /ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交12至24小时。载体材料最 终使用2X SSC、0. 2% SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0129] 在另一个实施例中，本发明涉及由与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的 成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性的多核苷酸编码的具有葡萄糖醛酸酯酶 活性的分离多肽。
[0130] 在另一个实施例中，本发明涉及SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的成熟 多肽的变体，这些变体在一个或多个（例如若干个）位置处包括取代、缺失和/或插入。优 选地，氨基酸改变的性质较小，也就是说不会显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基 酸取代或插入；典型地是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小段氨基或羧基末端延伸， 例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷 或另一功能而协助纯化的小段延伸，例如多组氨酸区段、抗原表位、或结合结构域。
[0131] 保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸及组氨酸）、酸 性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水性氨基酸（亮 氨酸、异亮氨酸及缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸）及小氨基酸（甘 氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸）。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本 领域已知的并且例如由11.诺伊拉特（他1^ &也）和1?丄.希尔（把11)，1979在蛋白质（11^ Proteins)，学术出版社（Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly〇
[0132] 可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基 酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
[0133] 可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（坎宁汉 (Cunningham)和威尔斯（Wells)，1989,科学（Science) 244:1081-1085)来鉴定多肤中的 必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所 得突变体分子的葡萄糖醛酸酯酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基 酸残基。还参见，希尔顿（Hilton)等人，1996,生物化学杂志271:4699-4708。也可结合假 定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标 记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参 见，例如，德弗斯（de Vos)等人，1992,科学255:306-312 ;史密斯（Smith)等人，1992,分子 生物学杂志224:899-904 ;乌乐达维尔（Wlodaver)等人，1992,欧洲生化学会联合会快报 309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。
[0134] 使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出 单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由 Reidhaar-Olson (瑞德哈尔-奥尔森）和 Sauer (萨奥尔），1988,科学 241:53-57 ;Bowie (鲍 依）和萨奥尔，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院院刊）86:2152-2156 ;W0 95/17413;或者WO 95/22625所描述的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展 不（例如洛曼（Lowman)等人，1991，生物化学（Biochemistry) 30:10832-10837 ;美国专利 号5, 223, 409 ;W0 92/06204)以及区域定向诱变（德比什尔（Derbyshire)等人，1986,基因 (Gene) 46:145;内尔（Ner)等人，1988, DNA 7:127)。
[0135] 可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克 隆的、诱变的多肽的活性（内斯等人，1999,自然生物技术17:893-896)。编码活性多肽的诱 变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些 方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
[0136] 在一个实施例中，引入SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6的成熟多肽中的 氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个。
[0137] 该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域 的N-末端或C-末端处融合。
[0138] 该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的 N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而 产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码 序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止 子的控制下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽（库珀 (Cooper)等人，1993,欧洲分子生物学学会杂志12:2575-2583 ;道森（Dawson)等人，1994， 科学 266:776-779)。
[0139] 融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌 之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以 下文献中披露的位点：马丁（Martin)等人，2003,工程微生物和生物技术杂志（J. Ind. Microbiol. Biotechnol.) 3:568-576 ;斯瓦蒂娜（Svetina)等人，2000，生物技术杂志 (J.Biotechnol.) 76:245-251 ;拉斯马森-威尔逊（Rasmussen-Wilson)等人，1997， 应用与环境微生物学（Appl. Environ. Microbiol. )，63:3488-3493 ;沃德（Ward)等 人，1995，生物技术（Biotechnology) 13:498-503 ;以及孔特雷拉斯（Contreras)等 人，1991，生物技术（Biotechnology) 9:378-381 ;伊顿（Eaton)等人，1986，生物化学 (Biochemistry) 25:505-512 ;柯林斯-瑞思（Collins-Racie)等人，1995，生物技术 13:982-987 ;卡特（Carter)等人，1989,蛋白质：结构、功能以及遗传学（Proteins:Struc ture, Function, and Genetics) 6:240-248 ;以及史蒂文斯（Stevens)，2003,世界药物发现 (Drug Discovery World)4:35-48〇
[0140] 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的来源
[0141] 本发明的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发 明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语"从...中获得"应意指由多核苷酸编码 的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个 方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
[0142] 该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如具 有葡萄糖醒酸酯酶活性的芽孢杆菌属（Bacillus)、梭菌属（Clostridium)、肠球菌属 (Enterococcus)、土芽抱杆菌属（Geobacillus)、乳酸杆菌属属（Lactobacillus)、乳球菌 属（Lactococcus)、海洋芽抱杆菌属（Oceanobacillus)、葡萄球菌属（Staphylococcus)、 链球菌属（Streptococcus)、或链霉菌属（Streptomyces)多肽；或一种革兰氏阴性细菌 多肽，如弯曲杆菌属（Campylobacter)、大肠杆菌（E.coli)、黄杆菌属（Flavobacterium) (例如约氏黄杆菌（Flavobacterium johnsoniae))、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺旋杆 菌属（Helicobacter)、泥杆菌属（Ilyobacter)、奈瑟氏菌属（Neisseria)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、沙门氏菌属（Salmonella)或脲原体属（Ureaplasma)多肽。
[0143] 在一个方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢 杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、短芽抱杆菌（Bacillus brevis)、环状芽抱杆菌 (Bacillus circulans)、克劳氏芽抱杆菌（Bacillus clausii)、凝结芽抱杆菌（Bacillus coagulans)、坚强芽抱杆菌（Bacillus firmus)、灿烂芽抱杆菌（Bacillus lautus)、迟 缓芽抱杆菌（Bacillus lentus)、地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱 杆菌（Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、或苏云金芽抱杆 菌（Bacillus thuringiensis)多月太。
[0144] 在另一个方面，该多肽是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟 亚种多肽。
[0145] 在另一个方面，该多肽是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链丝菌、 或变铅青链霉菌多肽。
[0146] 该多肽还可以是真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵母 属（Candida)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、酵母菌属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属（Yarrowia) 多肽；或丝状真菌多肽，例如枝顶孢霉属（Acremonium)、伞菌属（Agaricus)、链格孢 属（Alternaria)、曲霉属（Aspergillus)、短梗霉属（Aureobasidium)、葡萄座腔菌 属（Botryospaeria)、拟錯菌属（Ceriporiopsis)、毛 _ 壳属（Chaetomidium)、金抱 子菌属（Chrysosporium)、麦角菌属（Claviceps)、旋孢腔菌属（Cochliobolus)、鬼伞 属（Coprinopsis)、乳白蚁属（Coptotermes)、棒囊壳属（Corynascus)、隐丛赤壳菌属 (Cryphonectria)、隐球菌属（Cryptococcus)、色二抱属（Diplodia)、黑耳属（Exidia)、 线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰刀菌属（Fusarium)、赤霉属（Gibberella)、全鞭毛虫 属（Holomastigotoides)、腐质霉属（Humicola)、耙齿菌属（Irpex)、蘑燕属（Lentinula)、 小腔球菌属（Leptospaeria)、梨抱菌属（Magnaporthe)、黑果菌属（Melanocarpus)、 多孔菌属（Meripilus)、毛霉属（Mucor)、毁丝霉属（Myceliophthora)、新美鞭菌 属（Neocallimastix)、脉抱菌属（Neurospora)、拟青霉属（Paecilomyces)、青霉菌 属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、瘤胃壶菌属（Piromyces)、某真菌属 (Poitrasia)、假黑盘菌属（Pseudoplectania)、假披发虫属（Pseudotrichonympha)、 根毛霉菌属（Rhizomucor)、裂糟菌属（Schizophyllum)、柱顶孢属（Scytalidium)、踝 节菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳霉属（Thielavia)、弯颈 霉属（Tolypocladium)、木霉属（Trichoderma)、长毛盘菌属（Trichophaea)、轮枝孢属 (Verticillium)、小包脚燕属（Volvariella)或炭角菌属（Xylaria)多肽。
[0147] 在另一个方面，该多肽是卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁 维酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
[0148] 在另一个方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉（Acremonium cellulolyticus)、 棘抱曲霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、臭曲霉 (Aspergillus foetidus)、烟曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米 曲霉（Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌（Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子 菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicumΛ 热带金抱子菌（Chrysosporium tropicum)、带纹金抱子菌（Chrysosporium zonatum)、 杆抱状嫌抱（Fusarium bactridioides)、谷类嫌抱（Fusarium cerealis)、库威嫌 抱（Fusarium crookwellense)、大刀嫌抱（Fusarium culmorum)、禾谷嫌抱（Fusarium graminearum)、禾赤嫌抱（Fusarium graminum)、异抱嫌抱（Fusarium heterosporum)、 合欢木嫌抱（Fusarium negundi)、尖嫌抱（Fusarium oxysporum)、多枝嫌抱（Fusarium reticulatum)、粉红嫌抱（Fusarium roseum)、接骨木嫌抱（Fusarium sambucinum)、肤 色嫌抱（Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱嫌抱（Fusarium sporotrichioides)、硫色 嫌抱（Fusarium sulphureum)、圆嫌抱（Fusarium torulosum)、拟丝抱嫌抱（Fusarium trichothecioides)、壤片嫌抱（Fusarium venenatum)、灰腐质霉（Humicola grisea)、特 异腐质霉（Humicola insolens)、疏棉状腐质霉（Humicola lanuginosa)、白耙齿菌（Irpex lacteus)、米黑毛霉（Mucor miehei)、嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila)、粗糖链 抱菌（Neurospora crassa)、黄灰青霉、绳状青霉菌（Penicillium funiculosum)、产紫青霉 菌（Penicillium purpurogenum)、黄抱原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium)、无 色梭抱壳霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱壳霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭抱壳霉（Thielavia austral e ins is)、Thielavia fimeti、小抱梭抱 壳霉（Thielavia microspora)、卵抱梭抱壳霉（Thielavia ovispora)、秘鲁梭抱壳霉 (Thielavia peruviana)、毛梭抱壳霉（Thielavia setosa)、瘤抱梭抱壳霉（Thielavia spededonium)、耐热梭抱壳（Thielavia subthermophila)、土生梭抱壳霉（Thielavia terrestris)、哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康宁木霉（Trichoderma koningii)、长 枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesei)、或绿色木霉 (Trichoderma viride)多月太。
[0149] 将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态 (perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们 已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
[0150] 这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国 典型培养物保藏中心（ATCC)、德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心（Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心 (NRRL)。
[0151] 可以使用上述探针，从其他来源包括从自然界（例如，土壤、堆肥、水，等等）分离 的微生物鉴定并获得该多肽。用于从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。然后可 以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该 多肽的多核苷酸。一旦用这种或这些探针检测到编码一种多肽的多核苷酸，就可以通过使 用本领域普通技术人员众所周知的的技术分离或克隆该多核苷酸（参见，例如，萨姆布鲁 克（Sambrook)等人，1989,见上文）。
[0152] 结构域
[0153] 本发明还涉及催化结构域。
[0154] 在一个实施例中，该催化结构域与SEQ ID N0:2的氨基酸101至474具有至少 80%，例如至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或 100%的序列一致性。在一个方面，该催化结构域包括与SEQ ID N0:2的氨基酸101至474 有十个氨基酸不同，例如九个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、 四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸、或一个氨基酸不同的氨基酸序列。
[0155] 该催化结构域优选地包括SEQ ID N0:2的氨基酸101到474或其等位基因变体或 由其组成；或为其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。
[0156] 在另一个实施例中，该催化结构域是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严 谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件（如以上定义的）下与 以下杂交的多核苷酸编码的：（i)SEQ ID N0:1的核苷酸33至1457,（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全长互补体（萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0157] 在另一个实施例中，该催化结构域是由与SEQ ID NO: 1的核苷酸33至1457或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所编码的。
[0158] 在另一个方面，编码该催化结构域的多核苷酸包括SEQ ID NO: 1的核苷酸33至 1457或由其组成。
[0159] 在另一个实施例中，该催化结构域是SEQ ID N0:2的氨基酸101到474的一个变 体，该变体在一个或多个（例如若干个）位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例 中，引入SEQ ID N0:2的氨基酸101到474的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目 是10个，例如1、2、3、4、5、6、8或9个。
[0160] 在一个实施例中，该催化结构域与SEQ ID N0:4的氨基酸94至460具有至少95%， 例如至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一个方面，该催 化结构域包括与SEQ ID N0:4的氨基酸94至460有十个氨基酸不同，例如九个氨基酸、八 个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸、或 一个氨基酸不同的氨基酸序列。
[0161] 该催化结构域优选地包括SEQ ID N0:4的氨基酸94到460或其等位基因变体或 由其组成；或为其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。
[0162] 在另一个实施例中，该催化结构域是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严 谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件（如以上定义的）下与 以下杂交的多核苷酸编码的：（i)SEQIDN0:3的核苷酸81至 1463，（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全长互补体（萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0163] 在另一个实施例中，该催化结构域是由与SEQ ID N0:3的核苷酸81至1463或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所编码的。
[0164] 在另一个方面，编码该催化结构域的多核苷酸包括SEQ ID N0:3的核苷酸81至 1463或由其组成。
[0165] 在另一个实施例中，该催化结构域是SEQ ID N0:4的氨基酸94到460的一个变体， 该变体在一个或多个（例如若干个）位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中， 引入SEQ ID N0:4的氨基酸94到460的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目是10 个，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 个。
[0166] 在一个实施例中，该催化结构域与SEQ ID N0:6的氨基酸26至392具有至少90%， 例如至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一 个方面，该催化结构域包括与SEQ ID N0:6的氨基酸26至392有十个氨基酸不同，例如九 个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两 个氨基酸、或一个氨基酸不同的氨基酸序列。
[0167] 该催化结构域优选地包括SEQ ID N0:6的氨基酸26到392或其等位基因变体或 由其组成；或为其具有葡萄糖醛酸酯酶活性的片段。
[0168] 在另一个实施例中，该催化结构域是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严 谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件（如以上定义的）下与 以下杂交的多核苷酸编码的：（i)SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491，（ii)其cDNA序列，或 (iii) (i)或（ii)的全长互补体（萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,同上）。
[0169] 在另一个实施例中，该催化结构域是由与SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491或其 cDNA序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %序列一致性的多核苷 酸所编码的。
[0170] 在另一个方面，编码该催化结构域的多核苷酸包括SEQ ID N0:5的核苷酸235至 1491或由其组成。
[0171] 在另一个实施例中，该催化结构域是SEQ ID N0:6的氨基酸25到392的一个变体， 该变体在一个或多个（例如若干个）位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中， 引入SEQ ID N0:6的氨基酸26到392的序列中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目是10 个，例如 1、2、3、4、5、6、8 或 9 个。
[0172] 本发明还涉及分离的多肽，所述分离的多肽包括选自下组的催化结构域，该组由 以下各项组成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0173] (a)与SEQ ID N0:2的氨基酸101至474具有至少80%序列一致性的一个催化结 构域；
[0174] (b)由一种多核苷酸编码的一个催化结构域，该多核苷酸在高或非常高严谨度条 件下与（i)SEQ ID N0:1的核苷酸33至1457、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的全 长互补体杂交；
[0175] (c)由与SEQ ID NO: 1的核苷酸33至1457或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
[0176] (e)在一个或多个（例如若干个）位置处包括取代、删除、和/或插入的SEQ ID NO: 2的氨基酸101至474的变体；以及
[0177] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化结构域的一个片 段。
[0178] 本发明还涉及分离的多肽，所述分离的多肽包括选自下组的催化结构域，该组由 以下各项组成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0179] (a)与SEQ ID N0:4的氨基酸94至460具有至少80%序列一致性的一个催化结 构域；
[0180] (b)由一种多核苷酸编码的一个催化结构域，该多核苷酸在高或非常高严谨度条 件下与（i)SEQ ID N0:3的核苷酸81至1463、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的全 长互补体杂交；
[0181] (c)由与SEQ ID N0:3的核苷酸81至1463或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
[0182] (e)SEQ ID N0:4的氨基酸94至460的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干 个）位置处包括取代、删除、和/或插入；以及
[0183] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化结构域的一个片 段。
[0184] 本发明还涉及分离的多肽，所述分离的多肽包括选自下组的催化结构域，该组由 以下各项组成：葡萄糖醛酸酯酶（EC 2. 4. 1. 17)
[0185] (a)与SEQ ID N0:6的氨基酸48至392具有至少80%序列一致性的一个催化结 构域；
[0186] (b)由一种多核苷酸编码的一个催化结构域，该多核苷酸在高或非常高严谨度条 件下与（i)SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全长互补体杂交；
[0187] (c)由与SEQ ID N0:5的核苷酸235至1491或其cDNA序列具有至少80%序列一 致性的一种多核苷酸编码的一个催化结构域；
[0188] (d) SEQ ID N0:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干个）位 置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
[0189] (e)SEQ ID N0:6的氨基酸21至392的一种变体，该变体在一个或多个（例如若干 个）位置处包括取代、删除、和/或插入；以及
[0190] (f)具有葡萄糖醛酸酯酶活性的（a)、(b)、（c)、（d)或（e)的催化结构域的一个片 段。
[0191] 本发明还涉及纤维素结合结构域。
[0192] 在另一个实施例中，该纤维素结合结构域是由在非常低严谨度条件、低严谨度条 件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件（如以上定义 的）下与以下杂交的多核苷酸编码的：（i)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的核苷 酸，（ii)其cDNA序列，或（iii)⑴或（ii)的全长互补体（萨姆布鲁克（Sambrook)等人， 1989,同上）。
[0193] 在另一个实施例中，该纤维素结合结构域是SEQ ID N0:2的一个变体，该变体在 一个或多个（例如若干个）位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个方面，引入SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目是10个，例如1、 2、3、4、5、6、8、或 9 个。
[0194] 可操作地连接到该纤维素结合结构域的催化结构域可以来自水解酶、异构酶、连 接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢 酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内 切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖 苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化 物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖 苷酶。编码催化结构域的多核苷酸可以从任何原核、真核或其他来源获得。
[0195] 多核苷酸
[0196] 本发明还涉及编码如以上所述的本发明的多肽、催化结构域或纤维素结合结构域 的分离的多核苷酸。
[0197] 用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的并且包括分离自基 因组DNA或cDNA或其组合。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周 知的聚合酶链反应（PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达 库抗体筛选来实现。参见例如，伊尼斯（Innis)等人，1990, PCR:方法和应用指南（PCR:A Guide to Methods and Application),学术出版社，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例 如连接酶链式反应（LCR)、连接激活转录（LAT)和基于多核苷酸的扩增（NASBA)。这些多核 苷酸可以从任何相关的微生物克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等 位基因或物种变体。
[0198] 编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可以是 必需的。术语"基本上类似于"该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以 某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、pH最佳值 等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5的成 熟多肽编码序列、或其cDNA序列（例如其子序列）形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入 不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的 核苷酸取代，或通过引入可以产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代 的一般描述，参见例如福德（Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化（Protein Expression and Purification) 2:95-107。
[0199] 核酸构建体
[0200] 本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制 序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合 适的宿主细胞中的表达。
[0201] 可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载 体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术 是本领域熟知的。
[0202] 控制序列可以是启动子序列，S卩，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核 苷酸进行表达的一种多核苷酸。启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。该启动 子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂 合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获 得。
[0203] 用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例 是从以下各项中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽孢杆菌 α-淀粉酶基因（amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因（penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀 粉酶基因（amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因（sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基 因、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子（埃贡（Egon)等人，1988,基因69:301-315)、 天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因（dagA)、以及原核β -内酰胺酶基因（维拉-卡马洛夫 (Villa-Kamaroff)等人，1978,美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子（德 波尔（DeBoer)等人，1983,美国国家科学院院刊80:21-25)。另外的启动子描述于吉尔伯 特（Gilbert)等人，1980,科学美国人（Scientific American)242:74_94 中的"来自重组 细菌的有用蛋白"（"Useful proteins from recombinant bacteria"）、以及萨姆布鲁克 (Sambrook)等人，1989,见上文。
[0204] 用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例 是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸 稳定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性 蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶（W0 96/00787)、镶片镰孢淀粉 葡糖苷酶（W0 00/56900)、镶片镰孢 Daria (W0 00/56900)、镶片镰孢 Quinn (W0 00/56900)、 曼赫根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖 苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、 里氏木霉内切葡聚糖酶Π 、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木 霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β -木糖苷酶、以 及NA2_tpi启动子（来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的一种修饰的启动子，其中未 翻译的前导子已被来自编码磷酸丙糖异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替代；非限制 性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中未翻译的前导子 已被来自编码磷酸丙糖异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替代）；及其突 变型、截短型、以及杂合型启动子。
[0205] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、酿酒 酵母半乳糖激酶（GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADH1/GAP、ADH2/ GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶（ΤΡΙ)、酿酒酵母金属硫蛋白（CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷 酸甘油酸激酶。罗马诺斯（Romanos)等人，1992,《酵母》（Yeast)8:423-488描述了酵母宿 主细胞的其他有用的启动子。
[0206] 控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。终止子序 列与编码多肽的多核苷酸的3'-末端可操作地连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终 止子可以用于本发明中。
[0207] 丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基 苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀 菌胰蛋白酶样蛋白酶。
[0208] 用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细 胞色素 C (CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终 止子由罗马努斯等人，1992,见上文描述。
[0209] 控制序列还可以是一个合适的前导子序列，当被转录时是对于通过宿主细胞来翻 译而言重要的mRNA的一个非翻译区。该前导子序列与编码多肽的多核苷酸的5' -末端可 操作地连接。可以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何前导子序列。
[0210] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子从以下基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构 巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
[0211] 适用于酵母宿主细胞的前导子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶（EN0-1)、酿酒 酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（ADH2/GAP)。
[0212] 控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3' -末端 并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可 以使用在选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列。
[0213] 丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：米曲 霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样 蛋白酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶。
[0214] 有用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由郭（Guo)和舍曼（Sherman)， 1995,分子细胞生物学（Mol. Cellular Biol. ) 15:5983-5990 描述。
[0215] 控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信 号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5' -端可以固有地包括在翻译阅读框架中 与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列 5末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信 号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可 简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导表达的多 肽进入选择的宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
[0216] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码序列： 芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌 β -内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT、nprS、 nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。其他信号序列由西莫宁（Simonen)和帕尔瓦（Palva)， 1993,微生物评论（Microbiological Reviews) 57:109-137 描述。
[0217] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下基因获得的信号肽编码 序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、 特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0218] 有用于酵母宿主细胞的有用的信号肽是从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的 基因获得。其他有用的信号肽编码序列由罗马努斯等人，1992,见上文描述。
[0219] 该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序 列。生成的多肽被称为前体酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原 (zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割 前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌 碱性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT)、嗜热毁丝霉漆酶（W0 95/33836)、曼 赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。
[0220] 在多肽的Ν-末端处信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，前肽序列定位成紧 邻多肽的Ν-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的Ν-末端。
[0221] 还可以希望添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表 达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括 调节化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母 中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、 米曲霉TAKA α -淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允 许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶 酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷 酸将与调节序列可操作地连接。
[0222] 表达载体
[0223] 本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组 表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组 表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码 该变体的多核苷酸。可替代地，通过将该多核苷酸或者包括该序列的核酸构建体插入到用 于表达的适当载体中可以表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中， 以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0224] 重组表达载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA 程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载 体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0225] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色 体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自 我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时， 被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用 单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主 细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
[0226] 该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个 或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗 性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0227] 细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予 抗生素抗性（例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性）的标记。酵母宿主细 胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主 细胞中使用的可选择标记包括但不局限于amdS (乙酰胺酶）、argB (鸟氨酸氨甲酰基转移 酶）、bar (草胺膦乙酰转移酶）、hph (潮霉素磷酸转移酶）、niaD (硝酸还原酶）、pyrG (乳 清苷-5' -磷酸脱羧酶）、sC(硫酸腺嘌呤基转移酶）、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶）、连 同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水 链霉菌（Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。
[0228] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因 组自主复制的一个或多个元件。
[0229] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或 者通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体 可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一 个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合 的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10, 〇〇〇个碱基对、400至10, 000个碱基对、以 及800至10, 000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此 夕卜，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同 源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0230] 对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复 制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语 "复制起点"或"质粒复制子"意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0231] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及ρΑΜβ 1的复制起点。
[0232] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、 ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
[0233] 适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是ΑΜΑ1和ANS1(格姆斯（Gems)等 人，1991，基因（Gene)98:61_67;卡伦（Cullen)等人，1987，核酸研究（Nucleic Acids Res. ) 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建 可根据W0 00/24883披露的方法完成。
[0234] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产 生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多 核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选 择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由 此该多核苷酸的另外的拷贝。
[0235] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普 通技术人员熟知的（参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989,同上文）。
[0236] 宿主细胞
[0237] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产 生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持 作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语"宿主细胞"涵盖 由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大 程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0238] 该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真 核细胞。
[0239] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但 不局限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢 杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不局限于弯曲杆菌 属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺旋杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门 氏菌属、以及脲原体属。
[0240] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉 芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿 烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞。
[0241] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球 菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种的细胞。
[0242] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、阿维链 霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及变铅青链霉菌细胞。
[0243] 通过原生质体转化（参见例如，常（Chang)和科恩（Cohen)，1979,分子和普通 遗传学（Mol.Gen.Genet.)168:lll-115)，使用感受态细胞（参见，例如，杨格（Young) 和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，细菌学杂志（J.Bacteriol. )81:823-829 ;或者杜博楠 (Dubnau)和大卫多夫-阿贝尔森（Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志（J.Mol. Biol. )56:209-221)、电穿孔（参见，例如，茂川（Shigekawa)和道尔（Dower)，1988,生物技 术（Biotechniques)6:742-751)、或者接合（参见，例如凯勒（Koehler)和索恩（Thorne), 1987,细菌学杂志（J.BacterioU 169:5271-5278)可以实现将DNA引入到芽孢杆菌属 细胞中。可以通过原生质体转化（参见，例如，哈那汗（Hanahan)，1983,分子生物学杂志 166:557-580)或者电穿孔（参见，例如，道尔（Dower)等人，1988,核酸研究16:6127-6145) 实现DNA到大肠杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化和电穿孔（参见，例如贡（Gong) 等人，2004，Folia Microbiol. (Praha) 49:399-405)、接合（参见，例如马卓德（Mazodier) 等人，1989,细菌学杂志171:3583-3585)或转导（参见，例如伯克（Burke)等人，2001，美国 国家科学院院刊98:6289-6294)实现向链霉菌属细胞中引入DNA。可以通过如下方式实现 将DNA引入到假单胞菌属细胞中：电穿孔（参见，例如，蔡（Choi)等人，2006,微生物学方法 杂志（J.Microbiol.Methods)64:391_397)、或接合（参见，例如，皮内多（Pinedo)和斯梅 茨（Smets)，2005,应用与环境微生物学（Appl. Environ. Microbiol.) 71:51-57)。可以通过 如下方式实现将DNA引入链球菌属细胞中：天然感受态（参见，例如，佩里（Perry)和藏满 (Kuramitsu)，1981，传染与免疫（Infect. Immun. )32:1295-1297)、原生质体转化（参见，例 如，卡特（Catt)和约里克（Jollick)，1991，微生物（Microbios)68:189-207)、电穿孔（参 见，例如，布克莱（Buckley)等人，1999,应用与环境微生物学65:3800-3804)、或接合（参 见，例如，克莱怀尔（Clewell)，1981，微生物学综述（Microbiol. Rev. )45:409-436)。然而， 可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
[0244] 宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
[0245] 宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的"真菌"包括子囊菌门、担子菌门、壶 菌门和接合菌门（如霍克斯沃思（Hawksworth)等人在安-倍氏菌物辞典（Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi),第 8 版，1995，国际 CAB,大学出版社，剑桥 (Cambridge),英国中所定义的）以及卵菌门（Oomycota)(如在霍克斯沃思（Hawksworth) 等人，1995,见上文，第171页中所引用的）和所有有丝分裂孢子真菌（霍克斯沃思 (Hawksworth)等人，I" 5,见上文）。
[0246] 该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，"酵母"包括产子囊酵母（内孢霉 目）、产担子酵母以及属于半知菌类（芽生菌）的酵母。由于酵母的分类在将来可能改变， 为了本发明的目的，酵母应如在酵母生物学与活性（Biology and Activities of Yeast) (斯金纳（Skinner)，F. A.，帕斯莫尔（Passmore)，S. M.和达文波特（Davenport)，R. R.编 著，应用细菌学研讨会系列第 9 期（Soc.App.Bacteriol. Symposium Series No. 9),1980) 中所述进行定义。
[0247] 酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属（Hansenula)、克鲁维酵母属、毕 赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、卵形 酵母、或解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica)细胞。
[0248] 真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌门（Eumycota)和卵菌 门的亚门（如由霍克斯沃思等人，1995,见上文所定义）的所有丝状形式。丝状真菌通常 的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体 壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母（如酿酒酵母）的 营养生长是通过单细胞菌体的出芽（budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
[0249] 丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金 孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰刀菌属、腐质 霉属、稻瘟菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌 属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳菌属、弯颈 霉属、检囷属、或木霉属的细胞。
[0250] 例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢 曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟錯菌、卡内基拟錯菌（Ceriporiopsiscaregiea)、 浅黄拟錯孔菌、潘诺希塔拟錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、环带拟錯 菌（Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、虫拟錯 菌、狭边金孢子菌（Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克悼金孢子菌 (Chrysosporiumlucknowense)、奠状金抱子菌（Chrysosporiummerdarium)、租金抱子菌、 女王杜香金孢子菌（Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖 鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异 孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢 镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛 霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、土生梭孢壳、 长绒毛栓菌、变色栓菌（Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、 或绿色木霉的细胞。
[0251] 可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方 法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023 和约尔顿（Yelton)等人，1984,美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森 (Christensen)等人，1988,生物 / 技术（Bio/Technology)6:1419_1422 中描述。用于转化 镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔（Malardier)等人，1989,基因（Gene) 78:147-156、以 及W0 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔（Becker)和瓜 伦特（Guarente)，在阿贝尔森（Abelson)，J.N.和西蒙（Simon), Μ· I.编，酵母遗传学与分 子生物学指南，酶学方法（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology)，第 194 卷，第 182-187 页，学术出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，纽 约；伊藤（11^〇)等人，1983，细菌学杂志（上1^(^61'；[01.) 153:163;以及哈尼恩（}1;[1111611)等 人，1978,美国科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 75:1920。
[0252] 产生方法
[0253] 本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其 野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及（b)回收该多肽。在一个优 选方面，该细胞是齿毛菌属（针对SEQ ID N0:2)、木霉属（针对SEQ ID N0:4)或毛壳菌属 (针对SEQ ID N0:6)细胞。在一个更优选方面，该细胞是一色齿毛菌（针对SEQ ID N0:2)、 里氏木霉（针对SEQ ID NO:4)或球毛壳菌（针对SEQ ID NO:6)。
[0254] 本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽的 条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及（b)回收该多肽。
[0255] 使用本领域熟知的方法，在适合产生该多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如， 可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，以 及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括连续，分批，分批补料，或固态 发酵）来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该 培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组 成（例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制备。如果多肽分泌到该营养培养基中， 那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回 收。
[0256] 可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法可 包括使用特异抗体、形成酶产物、或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的 活性。
[0257] 可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可以通过常规程序，包括，但不局 限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀，从营养培养基中回收该多肽。
[0258] 可以通过本领域已知的多种方法纯化该多肽，该方法包括但不限于色谱法（例 如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法）、电泳方法 (例如，制备性等电聚焦）、差别溶解度（例如，硫酸铵沉淀）、SDS-PAGE或提取（参见，例如， 蛋白纯化（Protein Purification)，编者 J. -C.詹森（Janson)和拉尔斯赖登（Lars Ryden)， VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。
[0259] 在一个替代方面，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作 该多肽的来源。
[0260] 植物
[0261] 本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括 本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。多肽或结构域可从植物或 植物部分回收。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改 善食品或饲料的质量，例如改善营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
[0262] 转基因植物可以是双子叶的（双子叶植物）或单子叶的（单子叶植物）。单子叶 植物的实例是草例如草地早熟禾（蓝草，早熟禾属），饲草例如羊茅属（Festuca)、黑麦草 属（Lolium)，温带草例如剪股颖属（Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高 粱、和玉蜀黍（玉米）。
[0263] 双子叶植物的实例是烟草、豆类（如羽扇豆（lupins)、马铃薯、糖甜菜（sugar beet)、豌豆、豆（bean)和大豆（soybean))、以及十字花科植物（十字花科（family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模型生物拟南芥）。
[0264] 植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分 的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织（parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞 区室，如叶绿体、质外体（apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植 物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部 分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、 糊粉和种皮。
[0265] 同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
[0266] 可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简 而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶 绿体基因组中并且将所得改性植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植 物或植物细胞。
[0267] 表达构建体方便地是核酸构建体，它包括编码多肽或结构域的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地与选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当调节序列连接。而 且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的宿主细胞的选择性标记，和将此构 建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列（后者取决于所用的引入DNA的方法）。
[0268] 例如基于希望在何时、何处、和怎样表达该多肽或结构域来确定调节序列，例如启 动子和终止子序列以及任选的信号序列或转运序列的选择。例如编码多肽或结构域的基 因的表达可以是组成型的或诱导型的，或者可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产 物可以被祀向至特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列由例如塔格（Tague)等人， 1988,植物生理学（Plant Physiology)86:506 描述。
[0269] 对于组成型表达，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子 (弗兰克（Franck)等人，1980,细胞（Cell)21:285-294 ;克里斯滕森等人，1992,植物 分子生物学（Plant Mol. Biol.) 18:675-689;张（Zhang)等人，1991，植物细胞（Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织 (例如种子、马铃薯块莖、和果实）（Edwards (爱德华兹）和Coruzzi (科鲁兹），1990, Ann. Rev. Genet.(遗传学年鉴）24:275-303)，或来自代谢库组织（例如分生组织）（Ito (伊 藤）等人，1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）24:863-878),种子特异性启动子， 例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子（Wu(吴）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学）39:885-889),来自豆球蛋白Μ的蚕豆启动子和来 自蚕豆的未知种子蛋白基因（Conrad(康拉德）等人，1998, J. Plant Physiol.(植物生理 学杂志）152:708-711)，来自种子油体蛋白的启动子（Chen(陈）等人，1998, Plant Cell Physiol.(植物与细胞生理学）39:935-941)，来自欧洲油菜的C藏蛋白napA启动子，或本 领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在W0 91/14772中所述的。此外，启动 子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番爺的rbcs启动子（Kyozuka(京冢）等人， 1993, Plant Physiol.(植物生理学）），102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基 因启动子（Mitra (密特拉）和Higgins (希金斯），1994, Plant Mol. Biol.(植物分子生物 学）26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子（Kagaya(加贺）等人，1995，Mol. Gen. Genet. (分子和普通遗传学）248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子 (Xu(徐）等人，1993, Plant Mol. Biol.(植物分子生物学）22:573-588)。同样，启动子可 通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质 (例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸，以及重金属）来诱导。
[0270] 还可使用启动子增强子元件，从而在植物中达到多肽或结构域的更高表达。例如， 启动子增强子元件可以是位于启动子和编码多肽或结构域的多核苷酸序列之间的内含子。 例如Xu(徐）等人，1993,同上披露了使用水稻肌动蛋白1基因的第一内含子来增强表达。
[0271] 该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那 些。
[0272] 可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规 技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电 穿孔（Gasser (加塞尔）等人，1990，Science (科学）244:1293 ;Potrykus (波特里库斯）， 1990，Bio/Technology (生物 / 技术）8:535 ;Shimamoto (岛本）等人，1989，Nature (自 然）338:274)。
[0273] 目前，根癌农杆菌介导的基因转移是用于产生转基因双子叶植物的所选方法（关 于综述，请参见霍伊卡（Hooykas)和施尔伯鲁特（Schilperoort)，1992,植物分子生物学 19:15-38)，并且还可被用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物常常使用其他的转化方 法。目前，用于产生转基因单子叶植物的所选方法是粒子（用转化DNA涂覆的微观的金或 鹤粒子）轰击胚愈伤组织或发育中的胚（克里斯托（Christou)，1992,植物杂志（Plant J.) 2:275-281 ;岛本，1994,生物技术当前述评（Curr. Opin. Biotechnol.) 5:158-162 ;瓦西 尔（Vasil)等人，1992,生物 / 技术 10:667-674)。如 Omirulleh(奥米如列）等人，1993， Plant Molecular Biology(植物分子生物学）21:415-428中所述，单子叶植物转化的替代 方法是基于原生质体转化。根据本披露使用的另外的转化方法包括美国专利号6, 395, 966 和7, 151，204中所述的那些（这二者都通过引用以其全文结合在此）。
[0274] 在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再 生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性 消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位 点特异性地切除选择基因。
[0275] 除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的 植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码 多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因 此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此 类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授 粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7, 151，204中。
[0276] 植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种 系、近交体、或杂交体的植物。
[0277] 可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另 一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导 致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数 据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本 杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种 质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
[0278] 本发明还涉及产生本发明多肽或结构域的方法，该方法包括：(a)在有益于产生 多肽或结构域的条件下，培养包括编码该多肽或结构域的多核苷酸的转基因植物或植物细 胞，以及（b)回收该多肽或结构域。
[0279] 葡萄糖醛酸酯酶活性的除去或降低
[0280] 本发明还涉及产生亲本细胞的突变体的方法，该方法包括破坏或缺失编码本发明 的多肽的多核苷酸或其部分，这导致突变体细胞比在相同条件下培养的亲本细胞产生的多 肽少。
[0281] 可以使用本领域熟知的方法通过降低或消除该多核苷酸的表达来构建突变体细 胞，例如插入、破坏、替换、或缺失。在一个优选方面，将该多核苷酸失活。例如，待修饰或失 活的多核苷酸可以是活性必需的编码区或其部分，或编码区的表达所需的调节元件。这种 调节或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响该多核苷酸的表达的 部分。可修饰的其他控制序列包括但不局限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽 序列、转录终止子、和转录激活因子。
[0282] 该多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞经受诱变，并且选择该多核苷酸的 表达被降低或消除的突变体细胞来进行。所述诱变可以是特异的或随机的，例如通过使用 适宜的物理或化学诱变剂、通过使用适宜的寡核苷酸、或通过对DNA序列PCR产生诱变来进 行。此外，诱变可通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
[0283] 适用于本发明目的的物理或化学诱变剂的实例包括紫外线（UV)照射、羟胺、N-甲 基-Ν'-硝基-N-亚硝基胍（MNNG)、0-邻甲基羟胺、亚硝酸、乙基甲磺酸酯（EMS)、亚硫酸氢 钠、甲酸和核苷酸类似物。
[0284] 当使用这些试剂时，诱变一般是在适宜条件下在所选的诱变处理试剂的存在下通 过孵育有待诱变的亲本细胞并筛选和/或选择展示基因表达降低或不表达的突变体细胞 来进行的。
[0285] 该多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因中或在其转录或翻译所需的调节元件 中插入、取代、或缺失一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或除去核苷酸从而形成终止 密码子的引入、起始密码子的除去、或开放读码框的改变。这些修饰或失活可根据本领域已 知的方法通过定点诱变或PCR产生的诱变来完成。尽管原则上，修饰可以在体内进行，即直 接在表达待修饰的多核苷酸的细胞上进行，但是优选的是如下所示例地在体外进行修饰。
[0286] 便利的消除或降低多核苷酸的表达的方法的实例是基于基因替换、基因缺失、或 基因破坏技术的。例如，在基因破坏方法中，将对应于内源多核苷酸的核酸序列在体外进行 诱变以产生缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中以产生缺陷基因。通过同源重组， 该缺陷的核酸序列替换内源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸还编码可用于选择 其中该多核苷酸已经被修饰或破坏的转化体的标记。在一个方面，用例如在此描述的那些 选择性标记来破坏该多核苷酸。
[0287] 本发明还涉及抑制具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽在细胞中的表达的方法，这些 方法包括向该细胞给予或在其中表达一种双链RNA (dsRNA)分子，其中该dsRNA包括本发明 的多核苷酸的一个子序列。在一个优选方面，该dsRNA长约15个、16个、17个、18个、19个、 20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个双核苷酸。
[0288] 该dsRNA优选是一个小干扰RNA (siRNA)或微小RNA (miRNA)。在一个优选方面，该 dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一个优选方面，该dsRNA是用于抑制翻译的微小 RNA。
[0289] 本发明还涉及此类双链RNA (dsRNA)分子，包括用于抑制该多肽在细胞中的表达 的SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列的部分。虽然本发明不局限于任何具体的作用机制，但 是该dsRNA可以进入一个细胞并且导致相似的或相同的序列的单链RNA (ssRNA)(包括内源 mRNA)的降解。当细胞被暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA选择性地被一种叫做RNA 干扰（RNAi)的过程所降解。
[0290] 本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一个方面，本发明提供了使用本发明的 dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。可以在体外、离体或体内进行该过程。在一个方面， 可以使用这些dsRNA分子来在细胞、器官或动物中产生功能缺失突变。用于制备并使用 dsRNA分子选择性降解RNA的方法在本领域中是熟知的；参见例如美国专利号6, 489, 127 ; 6, 506, 559 ;6, 511，824 ;以及 6, 515, 109。
[0291] 本发明进一步涉及在编码该多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默 基因中包括破坏或缺失的亲本细胞的突变体细胞，这导致与亲本细胞相比，该突变体细胞 产生的多肽少或不产生多肽。
[0292] 这些多肽缺陷的突变体细胞作为用于原生和异源多肽的表达的宿主细胞尤其有 用。因此，本发明进一步涉及产生原生或异源多肽的方法，包括：(a)在有益于产生该多肽 的条件下培养该突变体细胞；并且（b)回收该多肽。术语"异源多肽"是指对该宿主细胞来 说不是原生的多肽，例如天然蛋白质的变体。该宿主细胞可以包括多于一个拷贝的编码该 原生或异源多肽的多核苷酸。
[0293] 可使用本领域已知的方法进行培养和目的产物的纯化。
[0294] 本发明用于生产基本上不含葡萄糖醛酸酯酶的产物的方法在真核多肽的生产中 是特别感兴趣的，尤其是真菌蛋白质，例如酶。葡萄糖醛酸酯酶缺陷的细胞还可用于表达药 学感兴趣的异源蛋白，例如激素、生长因子、受体等。术语"真核多肽"不仅包括原生多肽， 还包括经过氨基酸替代、缺失或添加的修饰或用以增强活性、热稳定性、pH耐受性等的其他 此类修饰的多肽，例如酶。
[0295] 在另一个方面，本发明涉及通过本发明的方法生产的基本上不含葡萄糖醛酸酯酶 活性的蛋白产物。
[0296] 处理纤维素材料的方法
[0297] 本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括：在本发明的具有 葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。在一个优选方 面，该方法进一步包括对降解的或转化的纤维素材料进行回收。
[0298] 本发明还涉及产生一种发酵产物的方法，这些方法包括：(a)在本发明的具有葡 萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物使纤维素材料糖化；(b)用一种或多 种（若干种）发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生该发酵产物；并且（c)从发酵中回 收该发酵产物。
[0299] 本发明还涉及对纤维素材料进行发酵的方法，该方法包括用一种或多种（若干 种）发酵微生物对纤维素材料进行发酵，其中纤维素材料是在本发明的具有葡萄糖醛酸酯 酶活性的多肽的存在下用酶组合物糖化的。在一个优选方面，发酵该纤维素材料产生一种 发酵产物。在另一个优选方面，该方法进一步包括从发酵中回收发酵产物。
[0300] 本发明的方法可被用于将一种纤维素材料糖化成可发酵糖，并且将这些可发酵糖 转化成许多有用的物质，例如燃料、饮用乙醇、和/或发酵产物（例如酸类、醇类、酮类、气体 等）。由该纤维素材料产生所希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解（糖化）、以及发 酵。
[0301] 根据本发明，可以使用本领域常规的过程来完成纤维素材料的加工。此外，可以使 用被配置为根据本发明进行操作的常规生物质加工装置来实施本发明的方法。
[0302] 分开或同时的水解（糖化）和发酵包括但不限于：分开水解和发酵（SHF)、同时 糖化和发酵（SSF)、同时糖化和共发酵（SSCF)、杂合的水解和发酵（HHF)、分开水解和共 发酵（SHCF)、杂合的水解和共发酵（HHCF)，以及直接微生物转化（DMC)。SHF使用分开 的处理步骤以首先将纤维素材料酶促水解为可发酵糖，例如，葡萄糖、纤维二糖、纤维三 糖、以及戊糖，并且然后将这些可发酵糖发酵成乙醇。在SSF中，纤维素材料的酶水解和 糖发酵成乙醇被组合在一个步骤中（菲利皮迪斯· G. P. (Philippidis, G. P.)，1996,纤维 素生物转化技术（Cellulose bioconversion technology),生物乙醇手册：生产和利用 (Handbook on Bioethanol:Production and Utilization),怀曼 *C. E (Wyman, C. Ε·)编辑， 泰勒-弗朗西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington, DC)，179-212))。 SSCF涉及多种糖的共发酵（希恩· J. (Sheehan, J.)和希默尔· Μ· (Himmel，Μ· )，1999,酶、 能量与环境：美国能源部研究和开发生物乙醇活性的战略性观点（Enzymes, energy and the environment:A strategic perspective on the U. S. Department of Energy' s research and development activities for bioethanol),生物技术进展（Biotechnol. Prog.) 15:817-827)。HHF涉及一个分开的水解步骤，并且另外涉及一个同时糖化和水解步 骤，这些步骤可以在同一反应器中进行。HHF过程中的步骤可以在不同的温度下进行，即高 温酶糖化，接着在发酵菌株能够耐受的更低温度下进行SSF。DMC将全部三个过程（酶产 生、水解以及发酵）组合在一个或多个（若干个）步骤中，其中相同生物被用来产生用于将 纤维素材料转化成可发酵糖的酶并且将可发酵糖转化成最终产物（林德· L. R. (Lynd，L. 1〇、韦默*?.<1.0^1!^1'，？.<1.)，范泽尔*1!1.(似112 71，1!〇、以及普利特瑞斯*1· S. (Pretorius，I. S.)，2002,微生物纤维素利用：基础与生物技术（Microbial cellulose utilization:Fundamentals and biotechnology)，微生物分子生物学综述（Microbiol. Mol. Biol. Reviews) 66:506-577)。在此应理解的是，本领域中已知的包括预处理、酶水解 (糖化）、发酵、或其组合的任何方法，可以用于实施本发明的方法。
[0303] 常规设备可以包括分批补料搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流搅 拌反应器、和/或连续活塞流柱式反应器（费尔南达.德.卡斯蒂柳斯.柯瑞芝（Fernanda de Castilhos Corazza)、弗拉维奥.法里亚.德.莫赖斯（FlcSvio Faria de Moraes)、 吉塞拉.玛丽亚.扎宁（Gisella Maria Zanin)以及伊沃.雷特泽尔（Ivo Neitzel)， 2003,用于纤维二糖水解的分批补料反应器的优化控制（Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis)，科技学报（自然科学版）（Acta Scientiarum. Technology) 25:33-38 ;古萨科夫·Α·ν· (Gusakov，A.V.)和辛捏特西·Α·Ρ· (Sinitsyn，Α· Ρ.)，1985,纤维素的酶水解动力学：1.分批反应器加工的数学模型（Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:1. A mathematical model for a batch reactor process)，酶与微生物技术（Enz. Microb. Technol. )7:346-352);摩擦反应器（隆 *S. K. (Ryu，S. K.)和李· J. M. (Lee，J. Μ.)，1983,通过使用摩擦生物反应器进行的废弃纤维素 的生物转化（Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor), 生物技术与生物工程（Biotechnol.Bioeng. )25:53-65);或具有由电磁场引起的强烈搅拌 的反应器（古萨科夫· A. V.、辛涅特西· A. P.、谢尔盖· I. Y. (Davydkin，I. Y.)、谢尔盖· V. Y.、普罗塔斯·〇. V. (PiOtas，0. V.)，1996,使用具有由电磁场引起的强烈搅拌的新型反应器 增强酶纤维素水角军（Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field)，应 用生物化学与生物技术（Appl.Biochem.Biotechnol. )56:141-153)。另外的反应器类型包 括：用于水解和/或发酵的流化床反应器、升流层（upflow blanket)反应器、固定化反应 器、以及挤出机型反应器。
[0304] 预处理。在本发明的方法的实践中，可以使用本领域R知的仟何预处理方法来破 坏植物细胞壁的纤维素材料组分（钱德拉（Chandra)等人，2007,底物预处理：木质纤维 素的有效酶水解的关键？（Substrate pretreatment:The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics ?)，生物化学工程 / 生物技术的进展（Adv.Biochem. Engin./Biotechnol.) 108:67-93;盖博（Galbe)和小林（Zacchi)，2007,用于高效生物乙 醇生产的木质纤维素材料的预处理（Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol production)，生物化学工程/生物技术的进展108:41-65 ;亨德 里克斯（Hendriks)和季曼（Zeeman)，2009,用以增强木质纤维素生物质的消化性的预处 理(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass)， 生物资源技术（Bioresource Technol.)100:10_18;莫热（Mosier)等人，2005,用于木 质纤维素生物质的预处理的有前景技术的特征（Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass)，生物资源技术 96:673-686;塔希尔扎 德（Taherzadeh)和卡里米（Karimi)，2008,预处理木质纤维素废弃物以改善乙醇和生物 气体产生：综述（Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production:A review)，分子科学国际杂志（Int.J. of Mol. Sci. )9:1621-1651 ;杨 (Yang)和怀曼,2008,预处理：释放低成本纤维素乙醇的关键（Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol)，生物燃料、生物产品与生物精炼（Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.) 2:26-40) 〇
[0305] 纤维素材料也可以在预处理之前使用本领域中已知的方法进行颗粒尺寸减缩、预 浸泡、润湿、洗涤、或调理。
[0306] 常规预处理包括但不局限于蒸汽预处理（用或不用爆发）、稀酸预处理、热水预处 理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆发、氨纤维爆发、有机溶剂预处理、和生物预处理。 另外的预处理包括氨渗滤、超声、电穿孔、微波、超临界co 2、超临界4〇、臭氧、以及Y辐射预 处理。
[0307] 可以在水解和/或发酵之前对纤维素材料进行预处理。优选在水解前进行预处 理。可替代地，可以同时用酶水解进行预处理，以释放可发酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或 纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖（即使在没有酶 的情况下）。
[0308] 蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质 素、半纤维素、和纤维素以使纤维素和其他级分，例如半纤维素可接近酶。纤维素材料经过 或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持 在其中持续希望的反应时间。蒸汽预处理优选在140°C -230°C，更优选160°C -200°C，并且 最优选170°C -190°C下执行，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的任意添加。蒸汽预处 理的停留时间优选是1-15分钟，更优选3-12分钟，并且最优选4-10分钟，其中最佳停留时 间取决于温度范围和化学催化剂的任意添加。蒸汽预处理允许相对较高的固体加载量，这 样使得纤维素材料在预处理过程中通常仅变得潮湿。蒸汽预处理经常与预处理后的材料的 爆发放料（explosive discharge)合并，这被称为蒸汽爆发，即，快速急骤蒸发至大气压和 材料的湍流，以通过破碎增加可接触的表面积（Duff (迪福）和Murray (默里），1996,生物 资源技术855:1-33 ;盖尔贝和赛琪，2002, Appl. Microbiol. Biotechnol.(应用微生物学与 生物技术）59:618-628 ;美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理过程中，半纤维素乙 酰基被裂解，并且所得到的酸自催化半纤维素部分水解成单糖和寡糖。仅在有限的程度上 去除木质素。
[0309] 经常在蒸汽预处理之前添加催化剂，如H2S04或S0 2 (典型地0. 3 %至3 % w/w)， 这降低时间和温度、增加回收率、并且改善酶水解（巴列斯特罗斯（Ballesteros)等人， 2006,应用生物化学与生物技术129-132:496-508 ;瓦尔加（Varga)等人，2004,应用生物化 学与生物技术113-116:509-523 ;萨斯那（Sassner)等人，2006,酶与微生物技术（Enzyme Microb. Technol. )39:756-762)〇
[0310] 化学预处理：术语"化学处理"是指能促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离 和/或释放的任何化学预处理。适合的化学预处理方法的实例包括：（例如）稀酸预处理、 石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆发（AFEX)、氨渗滤（APR)、以及有机溶剂预处理。
[0311] 在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸（典型地是H2S04)和水混合，以形成浆液，由 蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后急骤蒸发至大气压。可以用许多反应器设计来 进行稀酸预处理，例如，活可采用多种反应器设计来进行稀酸预处理，例如活塞流反应器、 逆流反应器或连续逆流收缩床反应器（达夫（Duff)和默里（Murray)，1996,同上；谢尔 (Schell)等人，2004,生物资源技术（Bioresource Technol. )91:179-188 ;李（Lee)等人， 1999,生物化学工程 / 生物技术进展（Adv. Biochem. Engin. /Biotechnol. )65:93-115)。
[0312] 还可以使用在碱性条件下的几种预处理方法。这些碱性预处理包括但不限于：石 灰预处理、湿氧化、氨渗滤（APR)、以及氨纤维/冷冻爆发（AFEX)。
[0313] 用碳酸钙、氢氧化钠、或氨，在85 °C _150°C的低温下进行石灰预处理，并且 停留时间为从1小时到几天（怀曼（Wyman)等人，2005,生物资源技术（Bioresource Technol. )96:1959-1966 ;莫热（Mosier)等人，2005，生物资源技术（Bioresource Technol.)96:673-686)〇 W0 2006/11089U W0 2006/11899, W0 2006/11900,以及 TO 2006/110901披露了使用氨的预处理方法。
[0314] 湿氧化是一种热预处理，其典型地在添加氧化剂（如过氧化氧或过压 氧）的情况下在180°C至200°C下持续5-15分钟进行（施密特（Schmidt)和汤姆 森（Thomsen)，1998,生物资源技术64:139-151 ;帕罗内（Palonen)等人，2004,应用生 物化学与生物技术117:1-17 ;瓦尔加等人，2004,生物技术与生物工程（Biotechnol. Bioeng. )88:567-574 ;马丁（Martin)等人，2006,化学技术与生物技术杂志（J.Chem. Technol. Biotechnol.) 81:1669-1677)。预处理优选以1 %至40 %干物质，更优选2 %至 30%干物质，并且最优选5%至20%干物质进行，并且经常通过添加碱如碳酸钠来增加初 始pH。
[0315] 湿氧化预处理方法的修改，称为湿爆发（湿氧化与蒸汽爆发组合）可以处理高 达30%的干物质。在湿爆发中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂（oxidizing agent)。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理（W0 2006/032282)。
[0316] 氨纤维爆发（AFEX)涉及在如90°C _100°C的中等温度和如17至20bar的高压下， 用液体或气态氨处理纤维素材料5至10分钟，其中干物质含量可以高达60% (格拉帕里 (Gollapalli)等人，2002,应用生物化学与生物技术98:23-35;俊达瓦特（Chundawat)等 人，2007,生物技术与生物工程（Biotechnol. Bioeng. )96:219-231 ;阿里扎德（Alizadeh) 等人，2005,应用生物化学与生物技术121:1133-1141 ;泰莫里（Teymouri)等人，2005,生物 资源技术96:2014-2018)。AFEX预处理导致纤维素的解聚和半纤维素的部分水解。木质 素-碳水化合物复合物被裂解。
[0317] 有机溶剂预处理通过使用含水乙醇（40% -60%乙醇）在160°C _200°C下萃 取30-60分钟而将纤维素材料脱木质素（潘（Pan)等人，2005,生物技术与生物工程 90:473-481 ;潘等人，2006,生物技术与生物工程94:851-861 ;库拉比（Kurabi)等人，2005， 应用生物化学与生物技术121:219-230)。通常加入硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理 中，大部分半纤维素被去除。
[0318] 适合的预处理方法的其他实例由舍尔等人，2003,应用生物化学与生物技术，第 105-108卷，第69-85页、和莫热等人，2005,生物资源技术96:673-686、以及美国公开申请 2002/0164730 描述。
[0319] 在一个方面，化学预处理优选是以酸处理进行，并且更优选持续稀酸和/或弱酸 处理。酸通常是硫酸，但也可以使用其他酸，如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯 化氢、或其混合物。弱酸处理优选在1-5,更优选1-4,并且最优选1-3的pH范围内进行。在 一个方面，该酸浓度在优选从〇. 01至20wt%酸，更优选0. 05至10wt%酸，甚至更优选0. 1 至5wt%酸，并且最优选0. 2至2. Owt %酸的范围中。使酸与纤维素材料相接触，并在优选 160°C _220°C，并且更优选165°C _195°C范围内的温度下保持从几秒到几分钟，例如1秒至 60分钟范围内的时期。
[0320] 在另一个方面，预处理是以氨纤维爆破步骤（AFEX预处理步骤）进行。
[0321] 在另一方面，预处理在水性浆料中进行。在优选的方面，在预处理过程中纤维素材 料以优选10_80wt %之间，更优选20-70wt %之间，并且最优选30-60wt %之间，例如50wt % 左右的量存在。预处理的纤维素材料可以不洗涤或使用本领域已知的任何方法洗涤，例如， 用水洗涤。
[0322] 机械预处理术语"机械预处理"是指各种类型的研磨或碾磨（例如，干磨、湿磨、或 振动球磨）。
[0323] 物理预处理：术语"物理预处理"是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤维 素材料中分离和/或释放的任何预处理。例如，物理预处理可包括辐射（例如微波辐射）、 汽蒸/蒸汽爆发、水热解及其组合。
[0324] 物理预处理可以包括高压和/或高温（蒸汽爆发）。在一个方面，高压意指在优选 约300至约600psi，更优选约350至约550psi，并且最优选约400至约500psi，例如450psi 左右的范围中的压力。在另一个方面，高温意指在约100至约300°C，优选约140至约235°C 范围中的温度。在一个优选方面，在分批过程中，以蒸汽枪水解器系统（例如从顺智公司 (Sunds Defibrator AB)，瑞典（Sweden)可获得的 Sunds 水解器（Sunds Hydrolyzer))来进 行机械预处理，该系统使用如上所定义的高压和高温。
[0325] 组合的物理和化学预处理纤维素材料可以物理地且化学地预处理。例如，该预处 理步骤可包括稀酸或弱酸预处理以及高温和/或高压处理。这些物理预处理和化学预处理 可以根据需要顺序地进行或同时进行。也可以包括机械预处理。
[0326] 因此，在一个优选方面，使纤维素材料经受机械、化学或物理预处理、或其任何组 合，以促进纤维素、半纤维素、和/或木质素的分离和/或释放。
[0327] 生物预处理：术语"生物预处理"是指促进纤维素、半纤维素、和/或木质素从纤 维素材料中分离和/或释放的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用溶解木质 素的微生物（参见，例如，舒· T. -A. (Hsu, Τ· -A. )，1996,生物质的预处理（Pretreatment of biomass),生物乙醇手册：生产和利用，怀曼*C.E.编辑，泰勒-弗朗西斯出版集团， 华盛顿特区，179-212;高希（Ghosh)和辛格（Singh)，1993,用于纤维素生物质的酶/微 生物转化的物理化学与生物处理（Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass),应用微生物学进展（Adv. Appl. Microbiol. )39:295-333 ;麦克米兰· J.D. (McMillan, J.D·)，1994,预处理木质纤 维素生物质：综述（Pretreating lignocellulosic biomass:a review)，用于燃料生产 的生物质的酶转化（Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production)，希默 尔· Μ. E.、贝克· J. 0.、以及奥弗伦· R. P. (Overend，R. P.)编辑，美国化学学会讨论会系列 566 (ACS Symposium Series 566)，美国化学学会（American Chemical Society)，华盛顿 特区，第 15 章；贡· C. S. (Gong, C. S.)、卡奥· N. J. (Cao, N. J.)、杜· J. (Du, J.)、以及曹· G. T. (Tsao，G.T. )，1999，由可再生资源生产乙醇（Ethanol production from renewable resources)，生物化学工程/生物技术的进展，舍佩尔· T.编辑，施普林格出版社德国海 德堡柏林（Berlin Heidelberg, Germany) ,65:207-241);奥尔森（Olsson)和哈恩-哈格 达尔（Hahn-Hagerdal)，1996,用于乙醇生产的木质纤维素水解物的发酵（Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production),酶与微生物技术（Enz. Microb. Tech.) 18:312-331 ;以及瓦蓝德（Vallander)和埃里克松（Eriksson)，1990，由 木质纤维素材料生产乙醇：技术现状（Production of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art),生物化学工程/生物技术的进展42:63-95)。
[0328] 趣化。在水解步骤（还称为糖化）中，将（例如预处理的）纤维素材料水解，以将 纤维素以及可替代地还有半纤维素分解成可发酵糖，如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿 拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶性寡糖。水解由酶组合物在本发明的具有葡萄糖醛酸 酯酶活性的一种多肽的存在下酶促进行。该组合物可进一步包括一种或多种（若干种）半 纤维素分解酶或木聚糖降解酶。还可顺序地添加这些组合物的酶。
[0329] 酶水解优选在易于由本领域技术人员确定的条件下、在合适的含水环境中执行。 在一个优选方面，水解在适合于一种或多种酶的活性，即对于该一种或多种酶来说最佳的 条件下进行。水解可以作为分批补料过程或连续过程进行，其中将预处理的纤维素材料 (底物）逐渐补料至例如含酶的水解溶液中。
[0330] 糖化通常在受控的pH、温度以及混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中进行。适 合的处理时间、温度以及pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。例如，糖化可以持续 长达200小时，但是典型地进行优选约12至约96小时，更优选约16至约72小时，并且最优 选约24至约48小时。温度在优选约25°C至约70°C，更优选约30°C至约65°C，并且更优选 约40°C至约60°C，具体地约50°C的范围中。pH在优选约3至约8,更优选约3. 5至约7,并 且最优选约4至约6、具体地约pH 5的范围中。干燥固体含量在优选约5wt %至约50wt %， 更优选约l〇wt%至约40wt%，并且最优选约20wt%至约30wt%的范围中。
[0331] 该酶组合物优选地包括多种具有纤维素分解活性和/或木聚糖降解活性的酶。在 一个方面，该酶组合物包括一种或多种（若干种）纤维素分解酶。在另一个方面，该酶组合 物包括一种或多种（若干种）木聚糖降解酶。在另一个方面，该酶组合物包括一种或多种 (若干种）纤维素分解酶和一种或多种（若干种）木聚糖降解酶。
[0332] 该一种或多种（若干种）纤维素分解酶优选是选自下组，该组由以下各项组成：内 切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。该一种或多种（若干种）木聚糖降解酶 优选是选自下组，该组由以下各项组成：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋 喃糖苷酶、木糖苷酶、以及葡糖醛酸糖苷酶。
[0333] 在另一个方面，该酶组合物进一步或甚至进一步包括一种具有纤维素分解增强 活性的多肽（参见，例如 W0 2005/074647、W0 2005/074656、以及 W0 2007/089290)。在 另一个方面，该酶组合物可进一步或甚至进一步包括一种或多种（若干种）另外的酶活 性以改善含纤维素材料的降解。优选的另外的酶是半纤维素酶（例如α-D-葡糖醛酸糖 苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、内切-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、a-半乳糖苷酶、内 切-a -L-阿拉伯聚糖酶、β -半乳糖苷酶）、碳水化合物-酯酶（例如乙酰基-木聚糖酯 酶、乙酰基-甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、葡萄糖醛酸酯酶）、果胶酶、蛋白酶、 木质素分解酶（例如漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、H202生产酶、氧化还原酶）、扩 张蛋白、膨胀素、或其混合物。在本发明的方法中，可以在发酵之前或过程中，例如在糖化过 程中，或在发酵微生物的繁殖过程中或之后添加这一种或多种另外的酶。
[0334] 该酶组合物的一种或多种（若干种）组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型 蛋白与重组蛋白的组合。例如，一种或多种（若干种）组分可以是用作宿主细胞以重组表达 该酶组合物的一种或多种（若干种）其他组分的细胞的原生蛋白质。该酶组合物的一种或 多种（若干种）组分可以作为单组分产生，然后将这些单组分组合以形成该酶组合物。酶 组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。
[0335] 用于本发明的方法中的酶可以处于适合用于此处所述的过程中的任何形式，例如 像去除或未去除细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化的或纯化 的酶制剂、或作为酶来源的宿主细胞。酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化 的液体、或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加如糖、糖醇或其它多 元醇等稳定剂和/或乳酸，对液体酶制剂进行稳定化。
[0336] 酶和具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的最佳量取决于若干因素，包括但不限于： 多种纤维素分解酶组分的混合物，纤维素底物，纤维素底物的浓度，纤维素底物的一种或多 种预处理、温度、时间、PH，以及发酵生物（例如，用于同时糖化和发酵的酵母）的纳入。
[0337] 在一个优选方面，一种或多种纤维素分解酶对纤维素材料的有效量是每g纤维素 材料约0. 5至约50mg、优选约0. 5至约40mg、更优选约0. 5至约25mg、更优选约0. 75至约 20mg、更优选约0· 75至约15mg、甚至更优选约0· 5至约10mg、并且最优选约2. 5至约10mg。
[0338] 在另一个优选方面，具有α -葡糖醛酸糖苷酶活性的一种或多种多肽对纤维素材 料的有效量是每g纤维素材料约〇· 01至约50. Omg、优选约0· 01至约40mg、更优选约0· 01 至约30mg、更优选约0. 01至约20mg、更优选约0. 01至约10mg、更优选约0. 01至约5mg、更 优选约〇. 025至约1. 5mg、更优选约0. 05至约1. 25mg、更优选约0. 075至约1. 25mg、更优选 约0. 1至约1. 25mg、甚至更优选约0. 15至约1. 25mg、并且最优选约0. 25至约1. Omg。
[0339] 在另一个优选方面，具有葡萄糖醛酸酯酶活性的一种或多种多肽对一种或多种纤 维素分解酶的有效量是每g -种或多种纤维素分解酶约〇. 005至约1. 0g、优选约0. 01至 约1. 〇g、更优选约〇. 15至约0. 75g、更优选约0. 15至约0. 5g、更优选约0. 1至约0. 5g、甚 至更优选约〇. 1至约〇. 5g、并且最优选约0. 05至约0. 2g。
[0340] 这些酶可以源自于或得自于任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳 动来源。术语"获得的"此处意指该酶可以是已从天然产生该酶作为原生酶的生物分离的。 术语"获得的"在此还意指该酶可能已在宿主生物中采用在此所描的方法重组产生，其中重 组产生的酶对于宿主生物是原生的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如，具有一个或 多个（若干个）缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶为原生氨基酸序列的突变 体和/或片段，或通过本领域已知的核酸改组方法产生的酶。原生酶的含义中涵盖天然变 体，而外源酶的含义中涵盖重组（如通过定点诱变或改组）获得的变体。
[0341] 具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽 可以是革兰氏阳性细菌多肽，如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的芽孢杆菌属、 链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌 属、或海洋芽孢杆菌属多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如具有纤维素分解酶活性或木聚糖降 解活性的大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺旋杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌 属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、或脲原体属多肽。
[0342] 在一个优选方面，该多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的嗜碱芽孢 杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强 芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜 热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
[0343] 在另一个优选方面，该多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的似马链 球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种多肽。
[0344] 在另一个优选方面，该多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的不产色 链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、或变铅青链霉菌多肽。
[0345] 具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选 地是一种具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的酵母多肽，如假丝酵母属（Candida)、 克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、酵母菌属（Saccharomyces)、 裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属（Yarrowia)多肽；或更优选地 是一种具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属 (Acremonium)、伞菌属（Agaricus)、链格抱属（Alternaria)、曲霉属（Aspergillus)、短 梗霉属（Aureobasidium)、葡萄座腔菌属（Botryospaeria)、拟錯菌属（Ceriporiopsis)、 毛 _ 壳属（Chaetomidium)、金孢子菌属（Chrysosporium)、麦角菌属（Claviceps)、旋 孢腔菌属（Cochliobolus)、鬼伞属（Coprinopsis)、乳白蚁属（Coptotermes)、棒囊壳 属（Corynascus)、隐丛赤壳菌属（Cryphonectria)、隐球菌属（Cryptococcus)、色二抱 属（Diplodia)、黑耳属（Exidia)、线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰刀菌属（Fusarium)、 赤霉属（Gibberella)、全鞭毛虫属（Holomastigotoides)、腐质霉属（Humicola)、 耙齿菌属（Irpex)、蘑燕属（Lentinula)、小腔球菌属（Leptospaeria)、梨孢菌属 (Magnaporthe)、黑果菌属（Melanocarpus)、多孔菌属（Meripilus)、毛霉属（Mucor)、毁 丝霉属（Myceliophthora)、新美鞭菌属（Neocallimastix)、脉抱菌属（Neurospora)、拟 青霉属（Paecilomyces)、青霉菌属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、瘤胃 壶菌属（Piromyces)、某真菌属（Poitrasia)、假黑盘菌属（Pseudoplectania)、假披发 虫属（Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属（Rhizomucor)、裂裙菌属（Schizophyllum)、 柱顶孢属（Scytalidium)、踝节菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭 孢壳霉属（Thielavia)、弯颈霉属（Tolypocladium)、木霉属（Trichoderma)、长毛盘菌 属（1'1'；[011(^1^63)、轮枝孢属（￥61'1：；[0；[11；[11111)、小包脚燕属（￥01￥31^6113)或炭角菌属 (Xylaria)多肽。
[0346] 在一个优选方面，该多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的卡尔斯伯 酵母、酿酒酵母、糖化酵母、格拉斯酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、或卵形酵母多肽。
[0347] 在另一个优选方面，该多肽是具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的解纤维 枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜 角质金抱子菌、Chrysosporium lucknowense、热带金抱子菌、Chrysosporium merdarium、 狭边金抱子菌（Chrysosporium inops)、租金抱子菌、Chrysosporium queenslandicum、 带纹金孢子菌（Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢、谷类镰抱、库威镰孢、大刀镰孢、 禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤 色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、 疏棉状腐质霉、白耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉菌、 黄抱平革菌、无色梭抱壳霉（Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、白毛梭抱 壳霉（Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳霉、卵孢梭 孢壳霉、秘鲁梭孢壳霉（Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳霉、毛梭孢壳霉、耐热梭孢壳 (Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、 绿色木霉、或褐孢长毛盘菌（Trichophaea saccata)多肽。
[0348] 还可以使用具有纤维素分解酶活性或木聚糖降解活性的多肽的化学修饰或蛋白 质工程化的突变体。
[0349] 酶组合物的一种或多种（若干种）组分可以是重组组分，S卩，通过克隆编码该单一 组分的DNA序列并且随后用该DNA序列转化细胞并且在宿主中表达产生（参见，例如，TO 91/17243和W0 91/17244)。优选宿主是异源宿主（酶对于宿主而言是异源的），但是在某 些条件下，宿主还可以是同源宿主（酶对于宿主而言是原生的）。还可以通过纯化来自发酵 液的这样一种蛋白来制备单组分纤维素分解蛋白。
[0350] 适用于在本发明中使用的商业化纤维素分解蛋白制剂的实例包括例如 CELLIC?CTec (诺维信 A/S)、CELLUCLAST?(诺维信 A/S)、N0V0ZYM?188 (诺维信 A/S)、 CELLUZYME?(诺维信 A/S)、CEREFL0?(诺维信 A/S)、以及 ULTRAFL0?(诺维信 A/S)、 ACCELERASE? (杰能科公司（Genencor Int.))、LAMINEX? (杰能科公司）、SPEZYME?CP (杰 能科公司）、R〇HAMENT?7069W (罗姆公司（R6hm (;mhl 丨））、FIBREZYME? LDI (并矢 国际公司（Dyadic International, Inc·))、FIBREZYME? I.I5R(并矢国际公司）、或 VISCOSTAR? 150L(并矢国际公司）。按从固体的约0. 001至约5. Owt%，更优选从固 体的约0. 025至约4. Owt %，最优选从固体的约0. 005至约2. Owt %的有效量添加这些纤维 素酶。按固体的从约〇. 001至约5. Owt%，更优选固体的从约0. 025至约4. Owt%，最优选 固体的从约0. 005至约2. Owt%的有效量添加这些纤维素酶。
[0351] 可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热 酸菌（Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶（TO 91/05039 ;W0 93/15186 ;美国专 利号 5, 275, 944 ;W0 96/02551 ;美国专利号 5, 536, 655 ;W0 00/70031 ;W0 05/093050);褐 色高温双歧菌（Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III (W0 05/093050);以及褐色高温双 歧菌内切葡聚糖酶V(W0 05/093050)。
[0352] 可以用于本发明的方法的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切 葡聚糖酶 1(彭蒂莱（Penttila)等人，1986,基因 45:253-263 ;GENBANK? 登录号 M15665); 里氏木霉内切葡聚糖酶Π (萨洛黑莫（Saloheimo)等人，1988,基因63:11-22;GENBANK? 登录号M19373);里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达（Okada)等人，1988,应用与环境微 生物学（Appl. Environ. Microbiol.)64:555-563, GENBANK? 登录号 AB003694);以及里 氏木霉内切葡聚糖酶V (萨洛黑莫等人，1994,分子微生物学（Molecular Microbiology) 13:219-228, GENBANK?登录号Z33381);棘孢曲霉内切葡聚糖酶（黄（0oi)等人，1990,核 酸研究18:5884);川地曲霉（spergillus kawachii)内切葡聚糖酶（坂元（Sakamoto)等 人，1995,当代遗传学（Current Genetics)27:435_439);胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶（萨里拉赫蒂（Saarilahti)等人，1990,基因90:9-14);尖镰 孢内切葡聚糖酶（GENBANK?登录号L29381);灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶（GENBANK? 登录号AB003107);热白丝菌（Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶（GENBANK?登录号 MAL515703);粗糙链孢菌内切葡聚糖酶（GENBANK?登录号XM_324477);特异腐质霉内切葡 聚糖酶V ;嗜热毁丝霉CBS 117. 65内切葡聚糖酶；担子菌纲（basidiomycete)CBS495. 95内 切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494. 95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6B内切葡 聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7C内 切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7F 内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏 木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶（GENBANK?登录号M15665)。
[0353] 用于本发明的方法中的纤维二糖水解酶的实例包括但不限于：里氏木霉纤维二糖 水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、特异腐质霉纤维二糖水解酶I、嗜热毁丝霉纤维二 糖水解酶II、土生梭孢壳霉纤维二糖水解酶II (CEL6A)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I、以 及嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。
[0354] 有用于本发明的方法中的β_葡糖苷酶的实例包括但不限于米曲霉β_葡糖苷 酶、烟曲霉菌β-葡糖苷酶、巴西青霉ΙΒΤ 20888 β-葡糖苷酶、黑曲霉β-葡糖苷酶、以及 棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
[0355] 具有β -葡糖苷酶活性的米曲霉多肽可根据W0 2002/095014获得。具有β -葡糖 苷酶活性的烟曲霉菌多肽可根据W0 2005/047499获得。具有β-葡糖苷酶活性的巴西青 霉多肽可根据W0 2007/019442获得。具有β-葡糖苷酶活性的黑曲霉多肽可根据丹（Dan) 等人，2000,生物化学杂志（J. Biol. Chem. )275:4973-4980获得。具有β-葡糖苷酶活性的 棘孢曲霉多肽可根据川口（Kawaguchi)等人，1996,基因（Gene) 173:287-288获得。
[0356] β_葡糖苷酶可以是一种融合蛋白。在一个方面，β_葡糖苷酶是根据 W02008/057637获得的米曲霉β-葡糖苷酶变体BG融合蛋白或米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋 白。
[0357] 其他内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、以及β_葡糖苷酶披露于使用根据以下 的分类的许多糖基水解酶家族中：亨利萨特· B. (Henrissat Β.)，1991，基于氨基酸序 列相似性的糖基水解酶的分类（A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities),生物化学杂志（Biochem.J.) 280:309-316;以 及亨利萨特· B.和贝洛赫· A. (Bairoch A.)，1996,修正糖基水解酶的基于序列的分类 (Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases),生物化学杂 志 316:695-696。
[0358] 可用在本发明中的其他纤维素分解酶描述于以下中：EP 495257、EP 531315、EP 531372,W0 1989/09259,W0 1994/07998,W0 1995/2447UW0 1996/11262,W0 1996/29397, TO 1996/034108、TO 1997/14804、TO 1998/08940、TO 1998/012307、TO 1998/13465、 TO 1998/015619、TO 1998/015633、TO 1998/028411、TO 1999/06574、TO 1999/10481、 TO 1999/025846、TO 1999/025847、TO 1999/031255、TO 2000/009707、TO 2002/050245、 W0 2002/0076792, W0 2002/101078, W0 2003/027306, W0 2003/052054, W0 2003/052055, W0 2003/052056, W0 2003/052057, W0 2003/052118, W0 2004/016760, W0 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, TO 2008/008793、美国专利号4, 435, 307、美国专利号5, 457, 046、美国专利号5, 648, 263、 美国专利号5, 686, 593、美国专利号5, 691，178、美国专利号5, 763, 254、以及美国专利号 5, 776, 757。
[0359] 在本发明的方法中，可以使用具有纤维素分解增强活性的任何GH61多肽。
[0360] 在一个第一个方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包括以下基序：
[0361] [ILMV]-P-X (4, 5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X (4) - [HNQ]和 [Fff]-[TF] -K-[AIV],
[0362] 其中X是任何氨基酸，X (4, 5)是处于4个或5个连续位置的任何氨基酸，并且X (4) 是处于4个连续位置的任何氨基酸。
[0363] 包括以上提到的基序的多肽可以进一步包括：
[0364] H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]、
[0365] [EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]、或
[0366] H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]以及[EQ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X-[ILV],
[0367] 其中X是任何氨基酸，X(l，2)是处于1个位置或2个连续位置的任何氨基酸，X (3) 是处于3个连续位置的任何氨基酸，并且X(2)是处于2个连续位置的任何氨基酸。在以上 基序中，采用可接受的IUPAC单一字母氨基酸缩写。
[0368] 在一个优选方面，具有纤维素分解增强活性的多肽进一步包括 H-X (1，2)-G-P-X (3) -[YW] -[AILMV]。在另一个优选方面，具有纤维素分解增强活性的分离 多肽进一步包括[EQ] -X-Y-X (2) -C-X- [EHQN] - [FILV] -X- [ILV]。在另一个优选方面，具有纤 维素分解增强活性的多肽进一步包括H-X (1，2) -G-P-X (3) - [YW] - [AILMV]和[EQ] -X-Y-X (2 )-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。
[0369] 在一个第二方面，具有纤维素分解增强活性的多肽包括以下基序：
[0370] [ILMV]-P-x(4, 5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-X(3)-A-[HNQ]，
[0371] 其中x是任何氨基酸，x (4, 5)是处于4个或5个连续位置的任何氨基酸，并且x (3) 是处于3个连续位置的任何氨基酸。在以上基序中，采用可接受的IUPAC单一字母氨基酸 缩写。
[0372] 在本发明的方法中有用的具有纤维素分解增强活性的多肽的实例包括但不限于： 来自土生梭孢壳霉的具有纤维素分解增强活性的多肽（W0 2005/074647)、来自橙色嗜热子 囊菌的具有纤维素分解增强活性的多肽（W0 2005/074656)、来自里氏木霉的具有纤维素分 解增强活性的多肽（W0 2007/089290)、以及来自嗜热毁丝霉的具有纤维素分解增强活性的 多肽（TO 2009/085935、TO 2009/085859、TO 2009/085864、TO 2009/085868)。
[0373] 适用于本发明的商业木聚糖降解酶制剂的实例包括：例如SHEARZYME? (诺 维信公司A/S)、CELLICTMHTec (诺维信公司Λ S)、VISCOZYME? (诺维信公司A/ S)、ULTRAFLO? (诺维信公司 A/S)、PULPZYME? HC (诺维信公司 A/S)、 MULTIFECT? 木聚糖酶（杰能科（Genencor))、ECOPULP? ΤΧ-200Α(ΑΒ 酶制剂公 司（AB Enzymes))、HSP 6000木聚糖酶（帝斯曼）、DEP0L?333P(生物催化剂有限公司 (Biocatalysts Limit),英国威尔士（Wales, UK))、DEP0L?740L.(生物催化剂有限公司，英 国威尔士）以及DEP0L?762P(生物催化剂有限公司，英国威尔士）。
[0374] 有用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于：棘孢曲霉木聚糖酶 (GeneSeqP:AAR63790;W0 94/21785)、烟曲霉木聚糖酶（W0 2006/078256)、以及土生梭孢 壳霉 NRRL 8126 木聚糖酶（W0 2009/079210)。
[0375] 有用于本发明的方法的β_木糖苷酶的实例包括但不限于：里氏木霉β_木糖苷 酶（UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、埃默森踝节菌（SwissProt登录号Q8X212)、以及粗 糙链孢菌（SwissProt登录号Q7S0W4)。
[0376] 有用于本发明的方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于：红褐肉座菌 (Hypocrea jecorina)乙酰木聚糖酯酶（W0 2005/001036)、粗糙链孢菌乙酰木聚糖酯酶 (UniProt登录号q7s259)、土生梭孢壳霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶（W0 2009/042846)、 球毛壳菌乙酰木聚糖酯酶（Uniprot登录号Q2GWX4)、细毛壳菌（Chaetomium gracile)乙 酰木聚糖酯酶（GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢（Phaeosphaeria nodorum)乙 酰木聚糖酯酶（Uniprot登录号Q0UHJ1)、以及特异腐质霉DSM 1800乙酰木聚糖酯酶（W0 2009/073709)。
[0377] 有用于本发明的方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于：特异腐质霉DSM 1800 阿魏酸酯酶（W0 2009/076122)、粗糙链孢菌阿魏酸酯酶（UniProt登录号Q9HGR3)、以及费 希新萨托菌（Neosartorya fischeri)阿魏酸酯酶（UniProt登录号A1D9T4)。
[0378] 有用于本发明的方法中的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于：特异腐质霉 DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶（W0 2009/073383)以及黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶（GeneSeqP 登录号 AAR94170)。
[0379] 有用于本发明的方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于：棒曲霉 (Aspergillus clavatus) α -葡糖醒酸糖苷酶（UniProt登录号alccl2)、里氏木霉α -葡 糖醒酸糖苷酶（Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α -葡糖醒酸糖苷酶（UniProt登录 号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醒酸糖苷酶（Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉（Aspergillus terreus) α -葡糖醒酸糖苷酶（SwissProt登录号Q0CJP9)、以及烟曲霉α -葡糖醒酸糖苷 酶（SwissProt 登录号 Q4WW45)。
[0380] 有用于本发明的方法的酶和蛋白质可以通过在含有适合碳源和氮源以及无机盐 的营养培养基上，使用本领域中已知的程序发酵上述微生物菌株来产生（参见，例如，班尼 特· J. W. (Bennett，J. W.)和拉热· L. (LaSure，L.)(编辑），真菌中的更多基因操纵（More Gene Manipulations in Fungi),学术出版社，加利福尼亚州，1991)。适合的培养基可从 商业供应商获得或可以根据公开的组成（例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中）制 备。适合用于生长和酶产生的温度范围和其他条件在本领域中是已知的（参见，例如，贝 利· J. E. (Bailey, J. E.)和奥利斯· D. F. (Ollis，D. F.)，生物化学工程基础（Biochemical Engineering Fundamentals)，麦格劳-希尔图书公司（McGraw-Hill Book Company)，纽约， 1986)。
[0381] 发酵可以是导致酶表达或分离的任何细胞培养方法。所以，可以将发酵理解为包 括摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并且在允许表达或分离该酶的条件下在实验室或 工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵（包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态 发酵）。通过上述方法产生的所得酶可以从发酵培养基回收并且通过常规程序纯化。
[0382] 发酵。可以通过能够将糖直接或间接发酵成所希望的发酵产物的一种或多种(若 干种）发酵微生物发酵从水解的纤维素材料获得的可发酵糖。"发酵"或"发酵过程"是指 任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵方法还包括用于消费性醇工业（例如啤酒 和葡萄酒）、乳品工业（例如发酵的乳制品）、皮革工业和烟草工业的发酵方法。发酵条件 取决于所希望的发酵产物和发酵生物体，并且可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
[0383] 在发酵步骤中，预处理和酶水解步骤所导致的从纤维素材料释放的糖由发酵生物 (如酵母）发酵成一种产物，例如，乙醇。如上所述，水解（糖化）和发酵可以是分开的或同 时的。
[0384] 在实践本发明的发酵步骤中可以使用任何适合的水解的纤维素材料。通常基于所 希望的发酵产物（即，要从发酵获得的物质）和所采用的方法来选择材料，如本领域中所熟 知的。
[0385] 术语"发酵培养基"在此可理解为指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基， 如，由糖化过程产生的培养基，以及在同时糖化和发酵过程（SSF)中使用的培养基。
[0386] "发酵微生物"是指适用于所希望的发酵方法以产生发酵产物的任何微生物，包括 细菌和真菌生物体。发酵生物可以是(： 6和/或(：5发酵生物、或其组合。（：6和(：5发酵生物 二者均是本领域中所熟知的。适合的发酵微生物能够将糖（如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉 伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、或寡糖）直接或间接地发酵（即，转化）成所希望的发酵产 物。
[0387] 产生乙醇的细菌和真菌发酵生物的实例由琳（Lin)等人，2006,应用微生物学与 生物技术69:627-642描述。
[0388] 能够发酵C6糖的发酵微生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的酵 母包括酵母菌属菌株，优选酿酒酵母。
[0389] 能够发酵仏糖的发酵生物的实例包括细菌生物和真菌生物，如酵母。优选的 C5发酵酵母包括毕赤酵母属的菌株，优选树干毕赤酵母，例如树干毕赤酵母CBS 5773 ; 假丝酵母属的菌株，优选博伊丁假丝酵母（Candida boidinii)、芸薹假丝酵母（Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母（Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母（Candida diddensii)、 假热带假丝酵母（Candida pseudotropicalis)、或产朊假丝酵母（Candida utilis)。
[0390] 其他发酵生物包括发酵单胞菌属的菌株，例如运动发酵单胞菌；汉逊酵母属，例如 异常汉森酵母；克鲁维酵母属，例如脆壁克鲁维酵母（K.fragilis);裂殖酵母属，例如粟酒 裂殖酵母（S.pombe);以及大肠杆菌，尤其已被遗传修饰以提高乙醇产率的大肠杆菌菌株。
[0391] 在一个优选方面，酵母是酵母菌属种。在一个更优选方面，酵母是酿酒酵母。在另 一个更优选方面，酵母是糖化酵母（Saccharomyces distaticus)。在另一个更优选方面，酵 母是葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum)。在另一个优选方面，酵母是克鲁维酵母属。在 另一个更优选方面，酵母是马克斯克鲁维酵母。在另一个更优选方面，酵母是脆壁克鲁维酵 母。在另一个优选方面，酵母是假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是博伊丁假丝酵母。 在另一个更优选方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是迪丹斯假丝酵 母。在另一个更优选方面，酵母是假热带假丝酵母。在另一个更优选方面，酵母是产朊假丝 酵母。在另一个优选方面，酵母是棒孢酵母属（Clavispora)。在另一个更优选方面，酵母是 葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae)。在另一个更优选方面，酵母是仙人掌棒孢酵母 (Clavispora opuntiae)。在另一个优选方面，酵母是管囊酵母属。在另一个更优选方面， 酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一个优选方面，酵母是毕赤酵母属。在另一个优选方面，酵母是 树干毕赤酵母。在另一个优选方面，酵母是酒香酵母属（Bretannomyces)。在另一个更优选 方面，酵母是克劳森酒香酵母（菲利皮迪斯· G. P. (Philippidis，G. P.)，1996,纤维素生物 转化技术（Cellulose bioconversion technology)，生物乙醇手册：生产和利用（Handbook on Bioethanol :Production and Utilization)，怀曼.C.E (Wyman, C.E.)编辑，泰勒-弗朗 西斯出版集团（Taylor&Francis)，华盛顿特区（Washington, DC)，179-212))。
[0392] 能够有效地将己糖和戊糖发酵成乙醇的细菌包括，例如，运动发酵单胞菌和热纤 维梭菌（Clostridium thermocellum)(菲利皮迪斯，1996,见上文）。
[0393] 在一个优选方面,细菌是发酵单胞菌属。在一个更优选方面,细菌是运动发酵单胞 菌。在另一个优选方面，细菌是梭菌属。在另一个更优选方面，细菌是热纤维梭菌。
[0394] 适于乙醇生产的可商购的酵母包括，例如乙醇红酵母（ETHANOL REDTMyeast)(可 从富酶泰斯/乐斯富（Fermentis/Lesaffre)，USA获得）、FALI?(可从弗莱施曼酵母 (Fleischmann，s Yeast)，USA 获得）、SUPERSTART? 和 THERM0SACC? 新鲜酵母（可从乙醇 技术（Ethanol Technology)，WI，USA)、BI0FERM?AFT 和 XR(可从 NABC-北美生物产品公司 (North American Bioproducts Corporation), GA，USA 获得）、GERT STRAND?(可从 Gert Strand AB，瑞典获得）、以及FERMIOL?(可从帝斯曼食品配料部（DSM Specialties)获得）。
[0395] 在一个优选方面，发酵微生物已经经过遗传修饰，以提供发酵戊糖的能力，如利用 木糖的微生物、利用阿拉伯糖的微生物、以及共同利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0396] 将异源基因克隆到多种发酵微生物中已经构建出能够将己糖和戊糖转化成乙 醇（共发酵）的生物（陈（Chen)和霍（Ho)，1993,酿酒酵母中毕赤酵母木糖还原酶基 因的克隆和改善表达（Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae)，应用生物化学与生物技术 (Appl. Biochem. Biotechnol.) 39-40:135-147 ;霍等人，1998,能够有效共发酵葡萄糖和 木糖的遗传工程化的酵母菌属酵母（Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose)，应用与环境微生物学 64:1852-1859;科特（Kotter)和西拉塞（Ciriacy)，1993,酿酒酵母发酵木糖（Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae),应用微生物学与生物技术（八卩卩1· Microbiol. Biotechnol.) 38:776-783 ;维尔福森（Walfridsson)等人，1995，过表达编 码戊糖磷酸途径酶转酮醇酶和转醛醇酶的TKL1和TALI基因的木糖代谢酿酒酵母菌 株(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKLland TALlgenes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase)，应用与环境微生物学 61:4184-4190;凯拍（Kuyper)等人，2004,用 于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小代谢工程化：原理的证实（Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle)，欧洲微生物学会联合会酵母研究（FEMS Yeast Research)4:655_664;比尔（Beall)等人，1991，通过重组大肠杆菌从木糖和其他糖产 生乙酉享的参数石开究（Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli)，生物技术与生物工程（Biotech. Bioeng. )38:296-303;英格拉姆（Ingram)等人，1998,用于乙醇产生的细菌的代谢工 程化（Metabolic engineering of bacteria for ethanol production)，生物技术与 生物工程58:204-214 ;张（Zhang)等人，1995,产生乙醇的运动发酵单胞菌中戊糖代谢 途径的代谢工程化（Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis)，科学（Science)267:240_243;狄安妲（Deanda)等 人，1996,通过代谢途径工程化开发发酵阿拉伯糖的运动发酵单胞菌菌株（Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering)，应用与环境微生物学62:4465-4470 ;W0 2003/062430,木糖异构酶）。
[0397] 在一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是酿酒酵母。在另一个优选方面，遗传修 饰的发酵微生物是运动发酵单胞菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是大肠杆 菌。在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)。 在另一个优选方面，遗传修饰的发酵微生物是克鲁维酵母属。
[0398] 本领域中熟知的是，以上所描述的生物体还可以用于产生其他物质，如在此所描 述。
[0399] 典型地向降解的木质纤维素或水解物中添加发酵微生物，并且进行发酵持续约8 至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26°C至约60°C之间，具体地约32°C 或50°C，并且在约pH 3至约pH 8,例如pH 4至5、6、或7左右。
[0400] 在一个优选方面，对降解的纤维素材料施用酵母和/或另一种微生物，并且进行 发酵持续约12至约96小时，如典型地24至60小时。在一个优选方面，温度优选在约20°C 至约60°C之间，更优选约25°C至约50°C，并且最优选约32°C至约50°C，具体地约32°C或 50°C，并且pH通常是从约pH 3至约pH 7,优选地在pH 4-7左右。然而，一些发酵生物 (例如细菌）具有更高的最适发酵温度。酵母或另一种微生物优选以每ml发酵液大约105 至1〇12,优选从大约1〇7至1〇1(1，特别是大约2X10 8个活细胞计数的量施用。关于使用酵 母进行发酵的进一步指南可以见于例如"醇教材"（"The Alcohol Textbook"）（K ·雅克 (K.Jacques)、T.P.里昂（T.P.Lyons)以及 D.R.凯尔索尔（D.R.Kelsall)编辑，诺丁汉大 学出版社（Nottingham University Press)，联合王国（United Kingdom) 1999)，其通过引 用结合在此。
[0401] 对于乙醇生产，在发酵之后，蒸馏发酵的浆料以萃取乙醇。根据本发明的方法获得 的乙醇可用作例如燃料乙醇、饮用乙醇，即可饮用的酒精，或工业乙醇。
[0402] 发酵刺激剂可以与在此所描述的任何方法组合使用，以进一步改进发酵方法，特 别是改进发酵微生物的性能，如，提高速度和乙醇产率。"发酵刺激剂"是指用于发酵微生 物（特别是酵母）生长的刺激剂。用于生长的优选发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维 生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐（酯）、烟酸、内消旋肌醇、硫胺、吡哆醇、对 氨基苯酸、叶酸、核黄素、以及维生素 A、B、C、D和E，例如参见阿尔弗雷多（Alfenore)等 人，通过在分批补料方法过程中的一种维生素补料策略改进乙醇产生和酿酒酵母的存活 力(Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feeding strategy during fed-batch process)，施普林格（2002)，其通过引用结 合在此。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Ζη、Μη和Cu营养素的矿物质 和矿物盐。
[0403] 发酵产物：发酵产物可以是由发酵得到的任何物质。该发酵产物可以是（不限 制）一种醇（例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇（glycerol)、甲醇、1，3_丙二醇、山梨 糖醇、以及木糖醇）；一种有机酸（例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2, 5-二 酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康 酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、以及木糖酸）；一种酮（例如，丙 酮）；一种氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸）；以及一 种气体（例如，甲烷、氢气（?)、二氧化碳（C0 2)、以及一氧化碳（C0))。发酵产物还可以是 作为高价值产物的蛋白。
[0404] 在一个优选的方面，发酵产物是一种醇。将理解，术语"醇"涵盖含有一个或多个羟 基部分的物质。在一个更优选方面，该醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选方面，该醇是丁醇。 在另一个更优选方面，该醇是乙醇。在另一个更优选方面，该醇是甘油。在另一个更优选方 面，该醇是甲醇。在另一个更优选方面，该醇是1，3-丙二醇。在另一个更优选方面，该醇是山 梨糖醇。在另一个更优选方面，该醇是木糖醇。参见，例如，贡*C.S. (Gong, C.S.)、卡奥·Ν. J. (Cao, N. J.，）、杜· J. (Du，J.)、以及曹· G. T. (Tsao, G. Τ·)，1999,由可再生资源生产乙醇， 生物化学工程 / 生物技术的进展（Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),舍佩尔· T. (Scheper, T.) 编辑，施普林格（Springer-Verlag)，德国海德堡柏林（Berlin Heidelberg, Germany), 65:207-241 ;西尔韦拉·ΕΜ· (Silveira, EE)和乔纳斯· R. (Jonas，R.)，2002,山梨糖 醇的生物技术生产（The biotechnological production of sorbitol)，应用微生物学 与生物技术59:400-408;尼加姆（Nigam)和辛格（Singh)，1995,用于木糖醇-一种糖替 代品的发酵产生工艺（Processes for fermentative production of xylitol - a sugar substitute)，加工生物化学（Process Biochemistry)30(2) :117-124 ;伊泽吉（Ezeji)、 库雷希（Qureshi)和布拉舍克（Blaschek)，2003,通过拜季林斯基羧菌BA101生产丙酮、 丁醇和乙醇并且通过气提原位回收（Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAlOland in situ recovery by gas stripping),微生物与生 物技术世界杂志（World Journal of Microbiology and Biotechnology) 19(6):595-603。
[0405] 在另一个优选方面，发酵产物是有机酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乙酸。 在另一个更优选方面，该有机酸是醋酮酸。在另一个更优选方面，该有机酸是己二酸。在另 一个更优选方面，该有机酸是抗坏血酸。在另一个更优选方面，该有机酸是柠檬酸。在另 一个更优选方面，该有机酸是2, 5-二酮-D-葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是甲 酸。在另一个更优选方面，该有机酸是反丁烯二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖 二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖酸。在另一个更优选方面，该有机酸是葡糖醛 酸。在另一个更优选方面，该有机酸是戊二酸。在另一个更优选方面，该有机酸是3-二羟基 丙酸。在另一个更优选方面，该有机酸是衣康酸。在另一个更优选方面，该有机酸是乳酸。 在另一个更优选方面，该有机酸是苹果酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙二酸。在另 一个更优选方面，该有机酸是草酸。在另一个更优选方面，该有机酸是丙酸。在另一个更优 选方面，该有机酸是琥珀酸。在另一个更优选方面，该有机酸是木糖酸。参见例如陈（Chen) 和李（Lee)，1997,用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的萃取发酵（Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass)应 用生物化学与生物技术（Appl. Biochem. Biotechnol.)，63_65:435_448。
[0406] 在另一个优选方面，发酵产物是一种酮。应理解的是，术语"酮"涵盖包含一个或 多个酮部分的物质。在另一个更优选方面，该酮是丙酮。参见，例如，库雷希和布拉舍克， 2003,见上文。
[0407] 在另一个优选方面，发酵产物是一种氨基酸。在另一个更优选方面，该有机酸 是天冬氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是谷氨酸。在另一个更优选方面，该氨基 酸是甘氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是赖氨酸。在另一个更优选方面，该氨基 酸是丝氨酸。在另一个更优选方面，该氨基酸是苏氨酸。参见例如理查德（Richard)和 马加里蒂（Margaritis)，2004,用于聚（谷氨酸）生产和其他微生物生物聚合物的分批 发酵动力学的实验建模（Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers),生物技术和生物 工程（Biotechnology and Bioengineering) 87 (4) : 501-515。
[0408] 在另一个优选方面，发酵产物是一种气体。在另一个更优选方面，该气体是甲烷。 在另一个更优选方面，该气体是H 2。在另一个更优选方面，该气体是co2。在另一个更优 选方面，该气体是C0。参见，例如，片冈· N. (Kataoka, N. )、A ·米亚（A. Miya)、以及K ·桐 山（K.Kiriyama)，1997,关于通过产氢厌氧细菌连续培养系统产生氢气的研究（Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria)，水科学与技术（Water Science and Technology) 36 (6-7) :41-47 ; 以及古那森兰· V. N. (Gunaseelan V. N.)，生物质与生物能源（Biomass and Bioenergy)， 第13 (1-2)卷，第83-114页，1997,用于甲烧生产的生物质的厌氧消化：综述（Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review)〇
[0409] 通並：。可以使用本领域中已知的任何方法可任选地从发酵培养基回收一种或多种 发酵产物，这些方法包括但不限于，色谱法、电泳程序、差别溶解度、蒸馏、或萃取。例如，通 过常规蒸馏方法从发酵的纤维素材料中分离和纯化醇。可以获得具有高达约96vol. %的纯 度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、引用乙醇，即饮用中性乙醇、或工业乙醇。
[0410] 信号肽
[0411] 本发明还涉及编码一种信号肽的一种分离的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至17、SEQ ID NO:4的氨基酸1至17或SEQ ID NO:6的氨基酸1至26或 由其组成。所述多核苷酸可以进一步包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质与信号肽和/或 前肽可操作地连接。该蛋白质优选地对于该信号肽来说是外源的。在一个方面，编码该信 号肽的多核苷酸是SEQ ID NO: 1的核苷酸33至83、SEQ ID N0: 3的氨基酸81至131、SEQ ID N0:5的氨基酸235至312。
[0412] 本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
[0413] 本发明还涉及产生蛋白的方法，该方法包括：（a)对包括这种多核苷酸的重组宿 主细胞进行培养；并且（b)回收该蛋白质。
[0414] 该蛋白质对于宿主细胞来说可以是原生的或异源的。术语"蛋白质"在此不意图 是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语"蛋白质"还涵盖组合 形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
[0415] 优选的是，蛋白质是激素或其变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道子。 举例来说，该蛋白质可以是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例 如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多 糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、 β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷 酶、变聚糖酶（mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解 酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β_木糖苷酶。
[0416] 该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
[0417] 通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
[0418] 实例
[0419] 菌株
[0420] 此处包括的酶是从包括以下各项的不同范围的微生物分离的：一色齿毛菌（SEQ ID Ν0:1+2)、里氏木霉（SEQ ID Ν0:3+4)和球毛壳菌（针对 SEQ ID Ν0:5+6)。
[0421] 培养基和溶液
[0422] 此处提供的反应条件、介质和溶液纳入用于启发，并且在技术人员发现适用时，可 被替代方法、反应条件以及介质替换。
[0423] 水解条件
[0424]
【权利要求】
1. 一种具有葡萄糖醛酸酯酶活性的分离的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组 成： (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、 至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%序列一致性；或 与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100 %序列一致性或 与SEQ ID N0:6的成熟多肽具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、 或100 %序列一致性； (b) 由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在高严谨度条件或非常高严谨度条 件下与⑴SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列、（ii)其cDNA序列、或（iii)⑴或（ii)的 全长互补体杂交；或 或在非常高严谨度条件下与（iv)SEQ ID勵:3的成熟多肽编码序列、（0其(^嫩序列、 或（vi) (iv)或（v)的全长互补体杂交； 或在非常高严谨度条件下与（vii)SEQ ID N0:5的成熟多肽编码序列、（viii)其cDNA 序列、或（ix) (vii)或（viii)的全长互补体杂交； (c) 由一种多核苷酸所编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序 列或其cDNA序列具有至少80 %、至少85 %、至少85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至 少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列一 致性或 与SEQ ID N0:3的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少90%、至少91%、至少 92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% 序列一致性或 与SEQ ID N0:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少85%、至少90%、至少 91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99 %或100 %序列一致性或 (d) SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的成熟多肽的一种变体，该变体在一个 或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及 (e) (a)、（b)、（c)或（d)的多肽的一个片段，该片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
2. 如权利要求1所述的多肽，该多肽包括序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中的一个或由其组成。
3. 如权利要求1-2中任一项所述的多肽，该多肽包括序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 或SEQ ID N0:6中的一个的成熟多肽或由其组成。
4. 如权利要求3所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸101至474、 SEQ ID NO:4的氨基酸94至460或SEQ ID NO:6的氨基酸21至392。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID N0:6的一个片段，其中该片段具有葡萄糖醛酸酯酶活性。
6. -种组合物，该组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的多肽。
7. -种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-5中任一项所述的多肽。
8. -种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求7所述的多 核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控 制序列。
9. 一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求7所述的多核苷酸，该多核苷 酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。
10. -种产生如权利要求1-5中任一项所述的多肽的方法，该方法包括： (a) 在有益于产生该多肽的条件下，培养一种细胞，该细胞在处于其野生型形式下产生 该多肽；并且 (b) 回收该多肽。
11. 一种产生具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的方法，该方法包括： (a) 在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求9所述的宿主细胞；并且 (b) 回收该多肽。
12. -种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：在如权利要求1-5中任一项所述的 具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
13. 如权利要求12所述的方法，其中该纤维素材料是经预处理的。
14. 如权利要求12或13所述的方法，其中该酶组合物包括选自下组的一种或多种酶， 该组由以下各项组成：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、蛋白 酶、漆酶、或过氧化物酶。
15. -种用于产生一种发酵产物的方法，包括： (a) 在如权利要求1-5中任一项所述的具有葡萄糖醛酸酯酶活性的多肽的存在下，用 一种酶组合物糖化纤维素材料； (b) 用一种或多种发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并 且 (c) 从发酵中回收该发酵产物。
【文档编号】C12N9/24GK104245930SQ201380021079
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月22日 优先权日:2012年4月23日
【发明者】J.波杰森, A.维克索-尼尔森, N.斯波德斯伯格, K.B.R.M.克罗格 申请人:诺维信公司