乳酸的制造方法

乳酸的制造方法
【专利摘要】本发明提供一种提高了乳酸生产能力的根霉属菌以及使用该菌制造乳酸的方法。一种提高根霉属菌的乳酸脱氢酶活性的方法、以及使用该根霉属菌的菌丝体制造乳酸的方法，其中，包含使根霉属菌的孢子在特定条件下在含有表面活性剂的培养液中发芽，获得菌丝体。
【专利说明】乳酸的制造方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乳酸的制造方法。

【背景技术】
[0002] 作为生物降解性塑料材料而受到关注的聚乳酸（poly-lactic acid、PLA)的原料 的乳酸是由来自植物的原料，通过生物学的生产法而获得的。因此，PLA被称为不增加大气 中的C0 2量的材料（碳中和材料）。乳酸中存在光学异构体的D-体和L-体，为了控制作为 塑料材料的聚乳酸的特性，需要光学纯度高的乳酸。
[0003] -直以来，作为生物学的乳酸生产方法，已知有将乳酸杆菌属(Lactobacillus)、 乳球菌属(Lactococcus)等乳酸菌在厌氧环境下培养，使之乳酸发酵的方法（非专利文献 1)。进一步，作为特异地生产L-乳酸的方法，已知有培养作为丝状菌的根霉属(Rhizopus) 的方法（专利文献1?3)。使用根霉属菌生产乳酸虽然具有获得光学纯度高的乳酸，可以 用比较简单的培养基组成进行培养等优点，但是，在生产速度方面还不能令人满意。
[0004] 在丝状菌的培养中，为了控制接种量，通常通过用斜面培养基等固体培养基使之 充分增殖来形成孢子，通过少量的表面活性剂使该孢子分散于无菌水等中，以每单位培养 基为一定量的孢子数量的方式进行接种来进行（例如专利文献2和4)。另外，作为通常的 丝状菌的培养法，已知有固体培养或者液体培养。使用了根霉属的物质生产中，主要使用液 体培养，此时菌体形态为纤维状、块状或者颗粒状等各种形态来利用（非专利文献2、专利 文献2?5)。
[0005] 使用了根霉属菌的乳酸生产中，为了提高其生产能力，对培养基条件、培养条件等 进行了各种研究（非专利文献3、专利文献3、4、6)。非专利文献4中发现了乳酸生产能力 与乳酸脱氢酶（LDH)活性相关，通过基因重组技术将LDH导入米根霉(Rhizopus oryzae) 中使之高度表达，从而成功地提高了乳酸生产能力。然而，不依靠基因重组而使根霉属菌的 LDH活性提高的方法还不明确。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1 :日本特开昭51-12990号公报
[0009] 专利文献2 :日本特开2000-037196号公报
[0010] 专利文献3 :日本特开2006-246846号公报
[0011] 专利文献4 :日本特开平6-253871号公报
[0012] 专利文献5 :日本特开平9-077803号公报
[0013] 专利文献6 :美国专利第4564594号公报
[0014] 非专利文献 1 :Enzyme and Microbial Technology (2000) vol. 26:87-107
[0015] 非专利文献2 :生物工程学会刊（2000)第78卷第12号：487-493
[0016] 非专利文献 3 :Applied Biochemistry and Biotechnology (1999) vol. 78:401-407
[0017] 非专利文献 4 :Appl ied Microbiology and Biotechnology (2004) vol.64:237-242


【发明内容】

[0018] 即，本发明提供一种提高根霉属菌的乳酸脱氢酶活性的方法，所述方法为包括下 述工序（A1)的提高根霉属菌的乳酸脱氢酶活性（LDH)的方法，
[0019] (A1)使根霉属菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中 发芽，获得菌丝体的工序，
[0020] 该表面活性剂是选自山梨糖醇酐脂肪酸酯、Ρ0Ε山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩 尔数为5以下的Ρ0Ε烷基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至 少1种。
[0021] 另外，本发明提供一种提高了乳酸生产能力的根霉属菌的生产方法，所述方法包 括通过上述本发明的LDH活性提高方法来获得提高了乳酸脱氢酶活性的根霉属菌。
[0022] 另外，本发明提供通过上述生产方法获得的根霉属菌。
[0023] 另外，本发明提供一种乳酸的制造方法，所述乳酸的制造方法包括下述工序（A1) 和（B)，
[0024] (A1)使根霉属菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中 发芽，获得提高了乳酸脱氢酶活性的菌丝体的工序；和
[0025] (B)将获得的菌丝体进一步在第3培养液中培养，获得乳酸的工序，
[0026] 该表面活性剂是选自山梨糖醇酐脂肪酸酯、Ρ0Ε山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩 尔数为5以下的Ρ0Ε烷基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至 少1种。

【具体实施方式】
[0027] 本发明涉及提高根霉属菌的乳酸脱氢酶（LDH)活性或者乳酸生产能力的方法，使 用该方法获得的提高了 LDH活性或者乳酸生产能力的根霉属菌，以及使用该根霉属菌高效 制造乳酸的方法。
[0028] 本发明人们对于不依靠人工的基因重组技术而提高根霉属菌的乳酸生产能力的 方法进行了探讨。其结果，本发明人们发现，在特定的条件下使孢子在含有表面活性剂的培 养基中发芽，成长为菌丝体的根霉属菌展现了高的LDH活性，进一步具有高的乳酸生产能 力。另外，本发明人们发现，可以通过培养该根霉属菌，高效地制造乳酸。
[0029] 由本发明获得的根霉属菌的菌体具有高的LDH活性，还提高了乳酸生产能力。通 过培养该菌体，可以高效地制造乳酸。
[0030] 在一个实施方式中，本发明提供一种提高根霉属菌的LDH活性的方法。LDH是将丙 酮酸变换为乳酸的酶，有报告称LDH活性高的根霉属菌能生产出更多的乳酸。由本发明获 得的根霉属菌具有高的LDH活性或高的乳酸生产能力，作为乳酸制造用的根霉属菌有用。
[0031] 作为上述本发明的供给提高LDH活性的方法的根霉属菌，例如可以列举天生具 有LDH活性的根霉属菌、以及天生具有乳酸生产能力的根霉属菌。从提高LDH活性、提高 乳酸生产能力的观点出发，作为供给本发明的方法的优选的根霉属菌，可以列举米根霉 (Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、华根霉(Rhizopus chinensis)、黑 根霉(Rhizopus nigricans)、东京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小寿麥曲根霉(Rhizopus tritici)等。进一步，供给本发明的提高LDH活性的方法的根霉属菌，天生LDH活性或者 乳酸生产能力没有或者较弱，也可以是人工施加了提高LDH活性或者乳酸生产能力的变化 的根霉属菌。作为这样的根霉属菌的例子，可以列举向乳酸生产能力低的根霉（Rhizopus) 属菌株中导入了 IdhA基因的根霉（Rhizopus)属菌株。上述列举的根霉属菌中，从LDH活 性和乳酸生产能力的提高性的观点、获取性的观点出发，进一步优选为米根霉(Rhizopus oryzae)。作为优选的米根霉(Rhizopus oryzae)菌株，可以列举保藏并登记在作为菌株保 存机构的（独）制品评价技术基础机构的生物遗传资源中心（NBRC)中的米根霉(Rhizopus orvzae)的 NBRC 4707、NBRC 4785、NBRC 5384、以及 NBRC 5418。除了 NBRC 以外，这些菌株 可以从独立行政法人理化学研究所生物资源中心（Riken BRC)等购得。
[0032] 本发明的提高LDH活性的方法包括：使希望提高LDH活性或者乳酸生产性的上述 列举的根霉属菌的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获得 菌丝体的工序（以下，称为"工序（A1) "。）。
[0033] 供给工序（A1)的根霉属菌虽然优选全部为孢子，但也可以包含菌丝。根霉属菌的 孢子可以通过例如，将含有上述列举的根霉属菌的孢子悬浊液接种在培养基中静置培养， 经目视确认菌丝成长和孢子形成之后，将培养物悬浊于含有表面活性剂的液体中，静置之 后，将上清液作为孢子悬浊液回收来进行制备。回收的孢子悬浊液中的孢子数量可以在显 微镜观察下使用血细胞计数仪（hemocytometer)等计数。孢子悬池液可以经适当稀释调节 至所期望的孢子数。
[0034] 在工序（A1)中，将上述获得的孢子悬浊液接种至第1培养液中培养，使孢子发芽 并获得菌丝体。培养液中接种的根霉属菌的孢子数优选为IX 1〇2?5X104个-孢子/mL-培 养液、进一步优选为5X102?1X10 4个-孢子/mL-培养液、更优选为1X103?1X104 个-孢子/mL-培养液。对于工序（A1)中使用的孢子发芽用的第1培养液，可以利用市售 的培养基，例如、马铃薯葡萄糖培养基（以下称为PDB培养基，例如Becton, Dickinson and Company制造）、Luria_Bertani培养基（以下称为LB培养基"Daigo"，例如日本制药制造）、 营养肉汤（Nutrient Broth)(以下称为NB培养基，例如Becton, Dickinson and Company制 造）、沙氏培养基（SabouraucT s Culture)(以下称为SB培养基，例如0X0ID制造）等。根 据需要，从发芽率和菌体繁殖的观点出发，可以在工序（A1)所使用的第1培养液中适当添 加作为碳源的葡萄糖、木糖等单糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等低聚糖、或者淀粉等多糖；甘油、柠 檬酸等生物成分；作为氮源的硫酸铵、尿素等、氨基酸等；作为其他无机物的钠、钾、镁、锌、 铁、磷酸等各种盐类。单糖、低聚糖、多糖以及甘油的优选浓度为〇. 1?30% (w/v)、柠檬酸 的优选浓度为〇. 01?10% (w/v)、硫酸铵、尿素以及氨基酸的优选浓度为0. 01?1% (w/ v)、无机物的优选浓度为〇. 0001?〇. 5 % (w/v)。
[0035] 进一步，在工序（A1)中使用的第1培养液含有选自山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙 烯（Ρ0Ε)山梨糖醇酐脂肪酸酯、氧化乙烯（E0)平均加成摩尔数为5以下的聚氧乙烯（Ρ0Ε) 烷基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少1种的表面活性 齐U。在这些表面活性剂的存在下，通过将根霉属菌从孢子培养为菌丝体，可以提高菌的LDH 活性和乳酸生产能力。上述表面活性剂中，从提高LDH活性和乳酸生产能力的观点、抑制培 养中的发泡的观点出发，优选为选自山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、E0平均 加成摩尔数为20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为5以下的聚 氧乙烯月桂基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及E0平均加成摩尔数为10的聚氧乙烯辛 基苯基醚中的至少1种，进一步优选为选自山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、 E0平均加成摩尔数为4的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为3或4的 聚氧乙烯月桂基醚、以及烯基琥珀酸盐中的至少1种，更优选为山梨糖醇酐单月桂酸酯。
[0036] 上述表面活性剂可以购入市场品。作为具体例子，作为山梨糖醇酐单月桂酸酯，可 以列举RHE0D0L (注册商标）SP-L10、RHE0D0L (注册商标）SUPER SP-L10 (都是花王制造）； 作为山梨糖醇酐单油酸酯，可以列举RHE0D0L (注册商标）SP-010V ;作为E0平均加成摩尔 数为20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯，可以列举RHE0D0L(注册商标）TW-L106、 RHE0D0L(注册商标）SUPER TW-L120(都是花王制造）；作为E0平均加成摩尔数为5以 下的聚氧乙烯月桂基醚，可以列举EMULGEN(注册商标）103、EMULGEN(注册商标）104P、 EMULGEN (注册商标）106(都是花王制造）；作为脱氧胆酸盐，可以列举脱氧胆酸钠（和光纯 药工业制造）；作为烯基琥珀酸盐，可以列举LATEMUL (注册商标）ASK (花王制造）；作为聚 氧乙烯烷基苯基醚，可以列举TRITON(注册商标）X-100(MP Biomedicals公司）等。
[0037] 在工序（A1)中使用的第1培养液中，添加选自上述表面活性剂中的至少一种即 可。该第1培养液中的上述表面活性剂的浓度，从提高LDH活性和乳酸生产能力的观点出 发，作为培养液中的最终浓度为0.01% (w/v)以上，优选为0.05% (w/v)以上，进一步优选 为0.1% (w/v)以上，更优选为0.2% (w/v)以上。另外，从同样的观点出发，该表面活性剂 在培养液中的最终浓度优选小于2.5% (w/v)，进一步优选小于1.5% (w/v)，更优选小于 1.0% (w/v)，进一步更优选小于0.8% (w/v)。进一步，工序（A1)中使用的培养液中的上述 表面活性剂的浓度，从提高LDH活性和乳酸生产能力的观点出发，作为培养液中的最终浓 度优选为0.01 % (w/v)以上且小于2.5% (w/v)，进一步优选为0.05% (w/v)以上且小于 1.5% (w/v)，更优选为0.1% (w/v)以上且小于1.0% (w/v)，进一步更优选为0.2% (w/v) 以上且小于0. 8% (w/v)。
[0038] 在工序（A1)中，使用含有上述表面活性剂的第1培养液来培养上述根霉属菌。培 养按照通常的顺序进行即可。例如，向包含含有该表面活性剂的第1培养液的培养容器中 接种根霉属菌孢子，一边以优选为80?250rpm、进一步优选为100?170rpm进行搅拌，一 边在25?42. 5°C的培养温度控制下培养优选为24?120小时、进一步优选为48?72小 时。供给培养的第1培养液的量可以根据培养容器进行适当调节，例如，在200mL容积的带 有挡板的烧瓶的情况下，为50?100mL左右即可；在500mL容积的带有挡板的烧瓶的情况 下，为100?300mL左右即可。通过该培养，根霉属菌孢子发芽，成长为菌丝体。
[0039] 本发明的提高LDH活性的方法，从提高LDH活性和乳酸生产能力的观点出发，优 选进一步包括：进一步培养工序（A1)所获得的菌丝体，使之增殖的工序（以下，称为"工序 (A2)"。）。工序（A2)中使用的增殖用的培养液（以下，称为"第2培养液"。）不特别限定， 只要是普通使用的含有葡萄糖的无机培养液即可，例如可以列举含有7. 5?30%葡萄糖、 0. 05?2 %硫酸铵、0. 03?0. 6%磷酸二氢钾、0. 01?0. 1 %硫酸镁?七水合物、0. 005? 0. 05%硫酸锌?七水合物、以及3. 75?20%碳酸钙（以上浓度都是％ (w/v))的培养液等， 优选可以列举含有10%葡萄糖、0. 1 %硫酸铵、0. 06%磷酸二氢钾、0. 025%硫酸镁?七水合 物、0. 009%硫酸锌?七水合物、以及5. 0%碳酸钙（以上浓度都是％ (w/v))的培养液。第 2培养液的量可以根据培养容器进行适当调节，例如，在500mL容积的带有挡板的烧瓶的情 况下，可以为50?300mL、优选为100?200mL。在此培养液中，将工序（A1)中培养的根霉 属菌菌丝体以作为湿重量为1?6g-菌体/100mL-培养基、优选为3?4g-菌体/100mL-培 养基的方式进行接种，一边以100?300rpm、优选为170?230rpm进行搅拌，一边在25? 42. 5°C的培养温度控制下培养12?120小时、优选为24?72小时。
[0040] 工序（A2)中使用的第2培养液没有必要含有在涉及第1培养液时列举的表面活 性剂，但是也可以含有。第2培养液中的该表面活性剂的浓度，从提高LDH活性和乳酸生产 能力的观点出发，优选为工序（A1)中使用的第1培养液中的该表面活性剂浓度的五分之一 以下、进一步优选为十分之一以下、更优选为二十分之一以下。例如，工序（A2)中使用的第 2培养液中的表面活性剂的浓度，从提高LDH活性和乳酸生产能力的观点出发，作为培养液 中的最终浓度优选为0.2% (w/v)以下，进一步优选为0.15% (w/v)以下，更优选为0.1% (w/v)以下，更优选为0.05% (w/v)以下，更优选为0.01% (w/v)以下。
[0041] 由上述工序（A1)或者工序（A2)获得的根霉属菌的菌丝体优选具有颗粒形状。进 一步，如果一个一个的颗粒明显独立，为表面光滑，且粒径在0. 5?5mm左右，并且相互具有 大致均匀的形状的颗粒，则在后述的乳酸制造过程中容易操作，并且即使重复使用形状也 难以破坏，因此，更优选之。可以通过改变培养的时间、温度、培养中的搅拌速度等来形成所 期望的大小或外观的颗粒。然而，在本发明的方法中，不一定需要将菌丝体颗粒化，另外，不 一定需要调节颗粒的大小或外观。
[0042] 接下来，将由上述工序（A1)或者工序（A2)获得的菌丝体作为提高了 LDH活性的 根霉属菌回收。菌丝体的回收方法不特别限制，可以通过倾斜法、过滤、离心分离等通常的 方法进行。
[0043] 由以上的本发明的提高根霉属菌的LDH活性的方法获得的根霉属菌因为提高了 LDH活性，因此具有更高的乳酸生产能力。因此，作为本发明的其它的实施方式，可以提供一 种包括上述工序（A1)、优选进一步包括上述工序（A2)的提高根霉属菌的乳酸生产能力的 方法。
[0044] 通过本发明的提高根霉属菌的LDH活性的方法，可以获得提高了 LDH活性和乳酸 生产能力的根霉属菌体。该根霉属菌在效率良好地制造乳酸方面有用。因此，作为本发明 的另一个实施方式，提供一种提高了 LDH活性或者乳酸生产能力的根霉属菌的生产方法， 该方法包括通过进行上述工序（A1)、优选进一步进行上述工序（A2)来获得提高了 LDH活性 或者乳酸生产能力的根霉属菌菌丝体。作为本发明的另外其它的实施方式，提供一种通过 进行上述工序（A1)、优选进一步进行上述工序（A2)而获得的提高了 LDH活性或者乳酸生产 能力的根霉属菌。
[0045] 此外，在其它实施方式中，本发明提供一种进一步包括培养通过上述工序（A1)、优 选进一步通过工序（A2)而获得的根霉属菌的菌丝体的工序（以下，称为"工序（B)"。）的 乳酸的制造方法。该本发明的乳酸的制造方法中，可以培养按照上述的顺序获得的提高了 LDH活性或者乳酸生产能力的根霉属菌的菌丝体，使该菌生产乳酸，之后回收生产的乳酸。
[0046] 在工序（B)中使用的乳酸生产用培养液（以下、称为"第3培养液"。）是含有葡 萄糖等碳源、硫酸铵等氮源以及各种金属盐等的可以生产乳酸的培养液即可。作为该工序 (B)中使用的第3培养液，例如可以列举含有7. 5?30 %葡萄糖、0. 05?2 %硫酸铵、0. 03? 0. 6%磷酸二氢钾、0. 01?0. 1 %硫酸镁?七水合物、0. 005?0. 05%硫酸锌?七水合物、以 及3. 75?20%碳酸钙（浓度都是％ (w/v))的培养液，优选可以列举含有12. 5%葡萄糖、 0. 1 %硫酸铵、0. 06%磷酸二氢钾、0. 025%硫酸镁?七水合物、0. 009%硫酸锌?七水合物、 以及5.0%碳酸钙（浓度都是％ (w/v))的培养液。
[0047] 工序（B)中使用的第3培养液的量可以根据培养容器进行适当调整，例如，在 200mL容积的三角烧瓶的情况下，为20?80mL左右即可；在500mL容积的三角烧瓶的情况 下，为50?200mL左右即可。在该第3培养液中，将上述的提高了 LDH活性或者乳酸生产能 力的根霉属菌体以作为湿重量为l〇g?90g-菌体/100mL-培养液、优选为15g?50g-菌 体/100mL-培养液的量方式进行接种，一边以100?300rpm、优选为170?230rpm进行搅 拌，一边在25?45°C的培养温度控制下培养4小时?24小时、优选为6小时?12小时。
[0048] 在工序（B)中使用的第3培养液中不需要含有第1培养液中所涉及的上述列举的 表面活性剂,但也可以含有。第3培养液中的该表面活性剂的浓度，从提高LDH活性和乳酸 生产能力的观点出发，优选为工序（A1)中使用的第1培养液中的表面活性剂浓度的五分之 一以下、进一步优选为十分之一以下、更优选为二十分之一以下。例如，工序（B)中使用的 培养液中的表面活性剂的浓度，从提高LDH活性和乳酸生产能力的观点出发，作为培养液 中的最终浓度优选为0.2% (w/v)以下、进一步优选为0.15% (w/v)以下、更优选为0.1% (w/v)以下、更优选为0.05% (w/v)以下、更优选为0.01% (w/v)以下。
[0049] 通过从上述第3培养液中回收培养上清液，可以获得乳酸。可以根据需要可以通 过倾斜法、膜分离、离心分离、电渗析法、离子交换树脂的利用、蒸馏、盐析等方法、或者这些 的组合，将该培养液中的乳酸以乳酸盐回收之后，从回收的乳酸盐中将乳酸单离或者精制。 通过以上的顺序，可以以高纯度并且高收率制造 L-乳酸。
[0050] 供上述乳酸制造的根霉属菌体可以为了乳酸制造而反复使用。即，从回收了乳酸 后的第3培养液中回收该菌体，再次用与上述同样的第3培养液对其进行培养，由此可以再 次制造乳酸。
[0051] 本发明的乳酸的制造方法可以是交替地进行菌的培养、培养液内积蓄的乳酸的回 收以及培养液的更替的分批式方法，也可以是间歇地或连续地更替一部分培养液，并同时 进行菌的培养和培养液中的乳酸的回收的半分批式或者连续的方法。
[0052] 另外，本发明作为例示的实施方式，包含以下的成分、制造方法、用途或者方法。但 是，本发明不受这些实施方式所限定。
[0053] 〈1> 一种提高根霉属菌的乳酸脱氢酶活性的方法，其中，所述方法包括使根霉属菌 的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获得菌丝体的工序。
[0054] 〈2> -种生产提高了乳酸脱氢酶活性的根霉属菌的方法，其中，所述方法包括使根 霉属菌的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获得菌丝体的 工序。
[0055] 〈3>-种提高根霉属菌的乳酸生产能力的方法，其中，所述方法包括使根霉属菌的 孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获得菌丝体的工序。
[0056] 〈4> 一种生产提高了乳酸生产能力的根霉属菌的方法，其中，所述方法包括使根霉 属菌的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获得菌丝体的工 序。
[0057] 〈5>上述〈1>?〈4>中，上述方法优选进一步包括使获得的菌丝体在第2培养液中 增殖的工序。
[0058] 〈6>-种根霉属菌，其中，是通过使根霉属菌的孢子在含有0.01 % (w/v)以上的表 面活性剂的第1培养液中发芽，获得菌丝体而生产的。
[0059] 〈7>-种根霉属菌，其中，是通过使根霉属菌的孢子在含有0.01 % (w/v)以上的表 面活性剂的第1培养液中发芽，使获得的菌丝体在第2培养液中增殖而生产的。
[0060] 〈8> -种乳酸的制造方法，其中，所述方法包括以下的工序，
[0061] (A1)使根霉属菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中 发芽，获得提高了乳酸脱氢酶活性的菌丝体的工序；和
[0062] (B)将获得的菌丝体在第3培养液中培养，获得乳酸的工序。
[0063] 〈9> 一种乳酸的制造方法，其中，所述方法包括以下的工序，
[0064] (A1)使根霉属菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性剂的第1培养液中 发芽，获得提高了乳酸脱氢酶活性的菌丝体的工序；
[0065] (A2)使工序（A1)中获得的菌丝体在第2培养液中增殖的工序；以及
[0066] (B)将工序（A2)获得的菌丝体在第3培养液中培养，获得乳酸的工序。
[0067] 〈10>上述〈8>?〈9>中，上述方法优选进一步包括将生产的乳酸回收的工序。
[0068] 〈11>上述〈1>?〈10>中，上述表面活性剂优选为选自山梨糖醇酐脂肪酸酯、Ρ0Ε 山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩尔数为5以下的Ρ0Ε烷基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、 以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一种，
[0069] 进一步优选为选自山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、E0平均加成摩 尔数为20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为5以下的聚氧乙 烯月桂基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及E0平均加成摩尔数为10的聚氧乙烯辛基苯 基醚中的至少1种，
[0070] 更优选为选自山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、E0平均加成摩尔数 为4的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为3或4的聚氧乙烯月桂基醚、 以及烯基琥珀酸盐中的至少1种，
[0071] 尤其优选为山梨糖醇酐单月桂酸酯。
[0072] 〈12>上述〈1>?〈11>中，上述第1培养液中的上述表面活性剂的浓度，作为该培 养液中的最终浓度优选为0.01% (w/v)以上，进一步优选为0.05% (w/v)以上，更优选为 0.1 % (w/v)以上，进一步更优选为0.2 % (w/v)以上，而且优选小于2.5 % (w/v)，进一步优 选小于1.5 % (w/v)，更优选小于1.0 % (w/v)，进一步更优选小于0.8 % (w/v)，或者，
[0073] 作为培养液中的最终浓度优选为0. 01% (w/v)以上且小于2. 5 % (w/v)，进一步优 选为0.05 % (w/v)以上且小于1.5 % (w/v)，更优选为0.1 % (w/v)以上且小于1.0% (w/ v)，进一步更优选为0.2% (w/v)以上且小于0.8% (w/v)。
[0074] 〈13>上沭〈1>?〈12>中，上沭根霉属菌优选为米根霉（Rhizopus oryzae) > j#.一 步优选选自米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 4707、米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 4785、 米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 5384 以及米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 5418。
[0075] 〈14〉上述〈5>、〈7>以及〈9>?〈13〉中，第2培养液中的表面活性剂的浓度优选 为0.2 % (w/v)以下，进一步优选为(λ 15% (w/v)以下，更优选为(λ 1% (w/v)以下，更优选 为0.05% (w/v)以下，更优选为0.01% (w/v)以下。
[0076] 〈15>上述〈8>?〈14>中，第3培养液中的表面活性剂的浓度优选为0· 2% (w/v) 以下，进一步优选为0.15 % (w/v)以下，更优选为0.1 % (w/v)以下，更优选为0.05 % (w/ v)以下，更优选为0.01% (w/v)以下。
[0077] 〈16>上述〈1>?〈15>中，根霉属菌的孢子在第1培养液中以下述条件进行培养。
[0078] 搅拌：优选为80?250rpm、进一步优选为100?170rpm
[0079] 温度：优选为25?42. 5 °C
[0080] 时间：优选为24?120小时、进一步优选为48?72小时
[0081] 〈17>上述〈5>、〈7>以及〈9>?〈16>中，菌丝体在第2培养液中以下述条件进行 培养。
[0082] 搅拌：优选为100?300rpm、进一步优选为170?230rpm
[0083] 温度：优选为25?42. 5 °C
[0084] 时间：优选为12?120小时、进一步优选为24?72小时
[0085] 〈18>上述〈8>?〈17>中，菌丝体在第3培养液中以下述条件进行培养。
[0086] 搅拌：优选为100?300rpm、进一步优选为170?230rpm、
[0087] 温度：优选为25?45 °C
[0088] 时间：优选为4小时?24小时、进一步优选为6小时?12小时
[0089] 实施例
[0090] 以下展示实施例来更具体地说明本发明。
[0091] 制造例1孢子悬浊液的制备法
[0092] 将由作为菌株保存机构的Riken BRC(理研生物资源中心）获得的米根霉 (Rhizopus orvzae) TCM14625 株(=NBRC 5384)的孢子悬浊冻结保存样品（_80°C )在 PDA 培养基（Difco Potato Dextrose Agar，Becton, Dickinson and Company 制造）中接种 1 钼环，在30°C下静置培养7?10日。经目视确认菌丝成长和伴随孢子形成的菌丝末端的黑 色化，向其中加入生理盐水30?40mL，将菌丝和孢子一并使用钼环移至50mL容积的带盖离 心管（Greiner制造），在管内剧烈混合。将混合后的孢子悬池液用3GP100圆筒漏斗形玻璃 过滤器（柴田科学制造）过滤，将其作为孢子液。孢子液中的孢子数用生理盐水适当稀释， 用血细胞计数仪（血球计算盘，D = l/50mm · l/400mm2)测定。
[0093] 制造例2菌丝体的制备
[0094] 向200mL容积的带有挡板的三角烧瓶（旭硝子制造）中加入未添加有或以最终浓 度为0. 5% (w/v)添加有下述记载的表面活性剂的80mL PDB培养基，将制造例1中制备的 米根霉(Rhizopus oryzae)的孢子悬池液以成为1 X 103个-孢子/mL_培养基的方式进行 接种，然后，在27°C下以170rpm搅拌培养3天。因为菌丝体残留于过滤器上，所以将上述培 养物用预先杀菌处理过的网眼大小为250μπι的不锈钢筛（As One制造）过滤，在过滤器上 回收菌体。
[0095] 表面活性剂
[0096] 山梨糖醇酐单月桂酸酯：RHE0D0L (注册商标）SP-L10 (花王）
[0097] 山梨糖醇酐单油酸酯：RHE0D0L (注册商标）SP-010V (花王）
[0098] 聚氧乙烯（3)月桂基醚：EMULGEN (注册商标）103 (花王）
[0099] 聚氧乙烯（4)月桂基醚：EMULGEN (注册商标）104P (花王）
[0100] 聚氧乙烯（5)月桂基醚：EMULGEN (注册商标）106 (花王）
[0101] 聚氧乙烯（6)月桂基醚：EMULGEN (注册商标）108(花王）
[0102] 聚氧乙烯（4)山梨糖醇酐单月桂酸酯：RHE0D0L (注册商标）TW-L106(花王）
[0103] 聚氧乙烯（20)山梨糖醇酐单月桂酸酯：RHE0D0L(注册商标）TW-L120(花王）
[0104] 脱氧胆酸钠（和光纯药工业）
[0105] 烯基琥珀酸钾盐（28% ) :LATEMUL (注册商标）ASK (花王）
[0106] 聚氧乙烯（10)辛基苯基醚：TRITON(注册商标）X-100(MP Biomedicals)
[0107] (表面活性剂的名称中的"聚氧乙烯"后接的0内的数字表示E0的平均加成摩尔 数。）
[0108] 制造例3菌丝体的增殖
[0109] 在500mL容积的三角烧瓶内供给有无机培养液100mL(组成：10%葡萄糖、0. 1%硫 酸铵、0. 06%磷酸二氢钾、0. 025%硫酸镁?七水合物、0. 009%硫酸锌?七水合物、5. 0%碳 酸钙、浓度都是％ (w/v))中接种回收的菌体3.0?4.0g(湿重量），在27°C下以220rpm搅 拌培养约40小时。接下来，将用上述无机培养液进行过培养的培养物用预先杀菌处理过的 不锈钢网式过滤固定器（MILLIP0RE制造）过滤，在过滤器上回收菌体。进一步，在该过滤 固定器上用l〇〇mL的生理盐水将菌体洗涤。用于洗涤的生理盐水经抽吸抽滤除去。获得的 菌体用于以下的LDH活性评价以及乳酸发酵生产能力评价。
[0110] 试验例1 LDH活性评价-1
[0111] 将在制造例3中获得的根霉属菌的湿菌体6. 0g接种于在200mL容积的三角烧瓶 内供有乳酸生产评价用无机培养液40mL(组成：8. 0%葡萄糖、0. 1%硫酸铵、0. 06%磷酸二 氢钾、0. 025 %硫酸镁?七水合物、0. 009 %硫酸锌?七水合物、5. 0 %碳酸钙、浓度都是％ (w/ v))，在35°C下以170rpm进行搅拌培养。将根霉属菌体的搅拌培养进行4. 5小时，使用预 先杀菌处理过的不锈钢网式过滤固定器（MILLIP0RE制造）过滤菌体，在过滤器上回收菌 体。进一步，在该过滤器固定器上用100mL的生理盐水将菌体洗涤。用于洗涤的生理盐水 经抽吸过滤除去。将获得的菌体〇.3g回收于3mL粉碎管（安井器械制造），放入3mL用金 属锥（安井器械制造），盖上盖后使用液氮冷冻。将冷冻的3mL粉碎管提供于多珠振荡器 (Multi-Beads Shocker)(安井器械制造），在1700rpm下将菌体破碎10秒。之后，添加0. 1M Tris-HCl (pH7. 5) lmL，用多珠振荡器以1700rpm处理10秒。将处理液在15000rpm、4°C的条 件下离心分离5分钟，将获得的上清液作为菌体提取液。
[0112] LDH活性为将丙酮酸变换为乳酸的活性，是要求NADH作为辅酶的酶反应。将适当 稀释的菌体提取液10 μ L与150 μ L的反应液（组成：0. 1M Tris-HCl、700 μ M NADH)混合。 在30°C下静置5分钟。向其中添加预先加热至30°C的20mM丙酮酸钠溶液40 μ L，使酶反应 开始。通过测定该反应液的340nm的吸光度，可以测定LDH活性（参照非专利文献4)。1U 定义为1分钟内生产1 μ mol的NAD+的酶量。另外，蛋白质浓度的测定以BSA为标准，使用 T Protein Assay Dye Reagent Consentrate(Bio-Rad)〇
[0113] 将结果不于表1中。结果以未添加表面活性剂时的LDH活性为100时的相对值表 示。用添加了山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、E0平均加成摩尔数为20以下 的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为5以下的聚氧乙烯月桂基醚、脱 氧胆酸钠、烯基琥珀酸盐、或者E0平均加成摩尔数为10的聚氧乙烯辛基苯基醚的培养基由 孢子制备成菌丝体的根霉属菌体，与用没有添加表面活性剂的培养基由孢子制备成菌丝体 的根霉属菌（对照）相比较，具有高的LDH活性。另外，用添加了 E0平均加成摩尔数为6 的聚氧乙烯月桂基醚的培养基由孢子制备成菌丝体的根霉属菌体，与用没有添加表面活性 剂的培养基由孢子制备成菌丝体的根霉属菌（对照）相比较，确认了其LDH活性稍微降低。
[0114] [表 1]
[0115]

【权利要求】
1. 一种乳酸的制造方法，其中， 为包括下述工序（A1)和（B)的乳酸的制造方法， (A1)使根霉属菌的孢子在含有0. Olw/v%以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获 得提高了乳酸脱氢酶活性的菌丝体的工序；和 (B)将获得的菌丝体进一步在第3培养液中培养，获得乳酸的工序， 该表面活性剂为选自山梨糖醇酐脂肪酸酯、P0E山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩尔数 为5以下的P0E烷基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一 种。
2. 如权利要求1所述的方法，其中， 上述第3培养液中的上述表面活性剂的浓度为0. 2W/v%以下。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中， 上述第1培养液中的上述表面活性剂的浓度为〇. Olw/ν%以上且小于2. 5w/v%。
4. 如权利要求1?3中任一项所述的方法，其中， 上述表面活性剂是选自山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、E0平均加成摩 尔数为20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为5以下的聚氧乙 烯月桂基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及E0平均加成摩尔数为10的聚氧乙烯辛基苯 基醚中的至少一种。
5. 如权利要求1?4中任一项所述的方法，其中， 在上述工序（A1)和工序（B)之间进一步包括下述工序（A2)， (A2)使工序（A1)中获得的菌丝体在第2培养液中增殖的工序。
6. 如权利要求5所述的方法，其中， 上述第2培养液中的上述表面活性剂的浓度为0. 2W/v%以下。
7. 如权利要求1?6中任一项所述的方法，其中， 上述根霉属菌是米根霉(Rhizopus oryzae)。
8. 如权利要求7所述的方法，其中， 上述米根霉(Rhizopus oryzae)选自米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC4707、米根 霉(Rhizopus oryzae)NBRC 4785、米根霉(Rhizopus oryzae)NBRC 5384、以及米根霉 (Rhizopus oryzae)NBRC 5418。
9. 一种提高根霉属菌的乳酸脱氢酶活性的方法，其中， 为包括下述工序（A1)的提高根霉属菌的乳酸脱氢酶活性的方法， (A1)使根霉属菌的孢子在含有0. Olw/v%以上的表面活性剂的第1培养液中发芽，获 得菌丝体的工序， 该表面活性剂是选自山梨糖醇酐脂肪酸酯、P0E山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩尔数 为5以下的P0E烷基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一 种。
10. 如权利要求9所述的方法，其中， 上述第1培养液中的上述表面活性剂的浓度为〇. 〇lw/v%以上且小于2. 5w/v%。
11. 如权利要求9或10所述的方法，其中， 上述表面活性剂是选自山梨糖醇酐单月桂酸酯、山梨糖醇酐单油酸酯、E0平均加成摩 尔数为20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、E0平均加成摩尔数为5以下的聚氧乙 烯月桂基醚、脱氧胆酸盐、烯基琥珀酸盐、以及E0平均加成摩尔数为10的聚氧乙烯辛基苯 基醚中的至少一种。
12. 如权利要求9?11中任一项所述的方法，其中， 在上述工序（A1)之后进一步包括下述工序（A2)， (A2)使工序（A1)中获得的菌丝体在第2培养液中增殖的工序。
13. 如权利要求12所述的方法，其中， 上述第2培养液中的上述表面活性剂的浓度为0. 2W/v%以下。
14. 如权利要求9?13中任一项所述的方法，其中， 上述根霉属菌是米根霉(Rhizopus oryzae)。
15. 如权利要求14所述的方法，其中， 上述米根霉(Rhizopus oryzae)选自米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC4707、米根 霉(Rhizopus oryzae)NBRC 4785、米根霉(Rhizopus oryzae)NBRC 5384、以及米根霉 (Rhizopus oryzae)NBRC 5418。
16. -种提高了乳酸生产能力的根霉属菌的生产方法，其中， 包括通过权利要求9?15中任一项所述的方法获得提高了乳酸脱氢酶活性的根霉属 菌。
17. -种通过权利要求16所述的方法生产的根霉属菌。
【文档编号】C12R1/845GK104245918SQ201380020857
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月4日 优先权日:2012年4月19日
【发明者】壶井雄一, 高桥史员, 西村祐美, 泽田和久 申请人:花王株式会社