专利名称：D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种具有D-乳酸特异性的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本 发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有在 食品、饲料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等多领 域应用前景。L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、 明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微生 物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微生 物造成了污染。乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关 系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的卜5%。血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作 为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个重 要数据，供安排训练时参考。酶法分析是国际上公认的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳 如IFU (国际果汁生产者协会)，AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK， OICC, VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方》去。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用具有D-乳酸特异性的酶循环扩增》去(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺 色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400—700nm 波长处吸光度的上升，得以测定D-乳酸浓度的方法，同时，本发明还将给 出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在可见 光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行D-乳酸浓度测定，而且测定速度 快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下 D-乳酸+2高铁细胞色素0D-乳酸脱氢酶丙酮酸+2亚铁细胞色素c 丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸+水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水这种方法应用具有D-乳酸特异性的D-乳酸脱氢酶(D-Lactate dehydrogenase; EC 1.1.2.4; EC Ll.2.5)酶联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19) 及过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反应终点/速率比色法。D誦乳酸脱氢酶作为作用酶，功能为将D-乳酸酶解产生丙酮酸。丙氨酸脱氢酶也 作为作用酶，它的酶促作用使丙酮酸产生丙氨酸；甘氨酸氧化酶作为循环酶 可以一再将丙氨酸再次变回丙酮酸，使丙酮酸不断地被重复循环利用；同时 不断地重复循环产生过氧化氢。过氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1 l丄7)作 为显色酶，通过和过氧化氢的作用，使无色的还原型色原体组合氧化成有色 的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400—700nrn (根据还原型色原 体组合的不同而定)波长处测定染料一刚嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚 胺色原(Quioneiminedye)—含量高低的光吸收大小程度/速度，得出氨基酸 (氮)浓度大小测定结果。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液100mmol/L稳定剂500 mmol/L还原型辅酶0.25 mmol/L2高铁细胞色素c10 mmol/L氨离子20 mmol/LD-乳酸脱氢酶10000 U/L丙氨酸脱氢酶10000 U/L甘氨酸氧化酶10000U/L过氧化物酶30000 U/L还原型色原体组合0.1-20mmol/L所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配 对组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻哇酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一W- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗石比4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本发明的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、 丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、2高铁细胞色素 c、氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、D-乳酸脱氢酶、 丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离 子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、还原型辅酶、2高铁细胞色素 c、氨离子。 试剂2缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、 过氧化物酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶。 过氧化物酶、还原型色原体组合、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶在试剂l、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。实施例一本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为单试剂, 三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 2高铁细胞色素cD-乳酸脱氢酶丙氨酸脱氢酶甘氨酸氧化酶过氧化物酶4-氨基抗砒石碳酸包括100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L 10000U/L 10000U/L 30000 U/L 2 mmol/L 10 mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，测试主波 长505nm，测试副波长600nm，被测D-乳酸样品与试剂的体积比例为1/25， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约1分钟左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓 度大小。 实施例二本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为双试剂，包括试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶2高铁细胞色素c试剂22，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂D-乳酸脱氢酶100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L 0.2 mmol/L甘氨酸氧化酶 过氧化物酶100mmol/L 500 mmol/L 10000U/L 10000U/L 10000U/L 25000 U/L 0.6 mmol/L4-氨基抗砒试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间IO分钟，测试主波长14546nm，测试副波长600nm，被测D-乳酸样品与试剂的体积比例为1/20，反 应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约1分 钟左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓 度大小。 实施例三本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为三试剂，包括 试剂1三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂还原型辅酶2高铁细胞色素c试剂23_甲基_2_苯噻唑酮腙三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L0.6 mmol/L甘氨酸氧化 过氧化物酶双甲基苯胺100mmol/L 500 mmol/L10000U/L10000U/L20000 U/L 2 mmol/L试剂15三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/LD-乳酸脱氢酶 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，测试主波长 578nm，测试副波长660nm，被测D-乳酸样品与试剂的体积比例为1/30，反 应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点/速率法，延迟时间大约1分 钟左右，检测时间3分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓 度大小。申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原 体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不 另一一例举。总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分析仪器 得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质量污染。
权利要求
1.一种具有D-乳酸特异性的酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的D-乳酸浓度测定方法，其方法原理如下D-乳酸+2高铁细胞色素c D-乳酸脱氢酶丙酮酸+ 2亚铁细胞色素c丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸 +水+辅酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨离子+丙酮酸+ 过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出D-乳酸浓度大小测定结果。
全文摘要
本发明涉及一种利用具有D-乳酸特异性的酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、甘氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出D-乳酸浓度的大小。
文档编号C12Q1/00GK101324561SQ200710023230
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司