专利名称：D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
技术背景L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有 在食品、饲料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等 多领域应用前景。L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、 明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微 生物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微 生物造成了污染。乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关 系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5%。血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作 为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个 重要数据，供安排训练时参考。酶法分析是国际上公认的分析方法，己被多个国际权威组织或机构采 纳如IFU (国际果汁生产者协会),AIJN (欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟),及MEBAK， OICC, VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用具有D-乳酸特异性的双倍扩增法(Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及 偶联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原 型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定D-乳酸浓度的方法，同 时，本发明还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒，采用该试 剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行D-乳酸浓 度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。 本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下D-乳酸+辅酶D-乳酸脱氢酶丙酮酸+还原型辅酶 丙酮酸+辅酶八+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶八+还原型辅酶 这种方法应用具有D-乳酸特异性D-乳酸脱氢酶(D-lactic acid dehydrogenase; EC 1丄1.28 )偶联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase ; EC1.2丄51)酶促反应速率比色法/终点法。D-乳酸脱氢酶酶解D-乳酸反应 产生丙酮酸，同时将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶 (在340nm处有吸收峰)。D-乳酸脱氢酶酶解D-乳酸产生的丙酮酸，再通 过偶联丙酮酸脱氢酶的作用，又再次将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还 原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，由于二次将辅酶还原成为还 原型辅酶，因此可以将反应灵敏度提高二倍；从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算D-乳酸的浓度大小。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑， 无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理想缓冲液 100mmol/L稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L辅酶A 5 mmol/LD-乳酸脱氢酶 12000 U/L丙酮酸脱氢酶 12000 U/L本发明的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括-缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体 试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶。 辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位 置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A。 试剂2缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶。 试剂3缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶。辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶在试剂l、试剂2或试剂 3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定D-乳酸浓度的方法，其辅酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为单试剂，包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 100 mmol/L稳定剂 500 mmol/L辅酶 3 mmol/L辅酶A 5 mmol/LD-乳酸脱氢酶 12000 U/L丙酮酸脱氢酶 12000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用 前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37"C,反应时间10分钟，起始吸光 度《0.1,测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试 剂的体积比例为1/25,反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0 分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的 浓度大小。 实施例二
本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为双试剂，包括 试剂1
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 5Ommol/L 辅酶 ■ 3 mmol/L
辅酶A
5 mmol/L
试剂2
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 稳定剂
D-乳酸脱氢酶 丙酮酸脱氢酶
100 mmol/L
500 mmol/L
12000U/L
12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用,在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时间10分钟，起始吸光
度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试 剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟 时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的 浓度大小。 实施例三
本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂1
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 稳定剂
辅酶A
试剂2
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 稳定剂
丙酮酸脱氢酶
试剂3
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 稳定剂
D-乳酸脱氢酶
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 5 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L
100 mmol/L 500 mmol/L 12000U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定D-乳酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时 间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm, 被测D-乳酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方 向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析 仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的 浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色 原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同， 不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种具有D-乳酸特异性的双倍扩增法、酶比色法及酶联法的D-乳酸的浓度测定方法，其方法原理如下D-乳酸+辅酶D-乳酸脱氢酶丙酮酸+还原型辅酶丙酮酸+辅酶A+辅酶丙酮酸脱氢酶二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出D-乳酸的浓度大小测定结果。
2. —种D-乳酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——4000 mmoI/L辅酶 1- 6 mmol/L辅酶A 1- 6 mmol/LD-乳酸脱氢酶 1000——80000 U/L丙酮酸脱氢酶 1000——80000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶组成 单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶组成 双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶组成。辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶组成 多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、辅酶A组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、 D-乳酸脱氢酶组成。辅酶、辅酶A、 D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶在试 剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳 定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用具有D-乳酸特异性的双倍扩增法、酶比色法及酶联法技术的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、辅酶A、D-乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。
文档编号C12Q1/00GK101324556SQ20071002322
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月13日 优先权日2007年6月13日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司