专利名称：循环酶法测定乙醇浓度的方法及乙醇测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用循环酶法测定乙醇浓度的方法， 以及应用该方法配制的乙醇测定试剂盒。
背景技术：
乙醇(酒精)存在于大部分酒精类饮料中，其代谢的速率主要取决于体内酶的含量，具有较大的个体差异。众所周知，少量饮酒可以促进血液循环，但是大量酒精摄入则会导致酒精依赖，可造成精神和多器官功能损害，其中以对肝脏功能和精神功能的危害最为多见，也最为严重。乙醇的成瘾性、滥用和依赖是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生问题之一，在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的重要原因。因此血乙醇测定在急性乙醇中毒诊断及法医学鉴定中起着举足轻重的作用。生物样品中乙醇的定量测定方法主要有均相酶免疫测定法、气相色谱法、呼出气乙醇分析法和酶法等。气相色谱法被认为是乙醇测定的参考方法。气相色谱法首先用NaCl饱和液在一封闭的容器中将血清或血样稀释，在封闭容器的上部是挥发的气体。这样取样使标本清洁， 很小或没有基质影响。通过标准曲线可以完成峰值的定量。该方法的缺点是仪器昂贵，手续复杂不便推广。酶法自动分析法分乙醇氧化酶法和乙醇脱氢酶法，氧化酶法试剂组成简单，样品不需预处理，但特异性差，甲醇对测定干扰大，可出现假阳性。乙醇脱氢酶对于乙醇是相对特异的，不会与甲醇、丙酮或异丙醇等起催化反应，因此准确度和精密度较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用循环酶法测定乙醇浓度的方法。该方法结合运用酶循环法、酶比色法和酶偶联法，使反应专一性强，检测特异性高、灵敏度高、线性范围大，且成本低。本发明提供一种循环酶法测定乙醇浓度的方法，该方法包括以下步骤
(1)乙醇+辅酶I &麵麵·乙醛+还原型辅酶I ；
(2)还原型辅酶I +氧化型INT一辅酶I +还原型INT;(3)将最终反应物在505nm处测定吸光度的变化，计算出乙醇的含量。辅酶I和乙醇在乙醇脱氢酶的作用下生成乙醛和还原型辅酶，生成的还原型辅酶I在黄递酶的作用下，与色原物质氧化型INT (硝基四氮唑蓝)反应，生成红色的还原型 INT和辅酶I，将最终反应物在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长 505nm处的吸光度变化，即可通过化学反应计算出样品中乙醇的浓度。
该循环酶比色法因偶联了一个酶——黄递酶，解决了酶比色法检测需要加入反应促进剂使反应尽快达终，但反应促进剂又对乙醇脱氢酶有抑制作用的问题，并且乙醇脱氢酶的运用保证了反应的专一性和测定的高特异性，使其灵敏度及线性范围较现有技术的酶比色法大大提高，同时由于反应是循环往复地进行的，因此减少了原料的投入量，降低了成本。本发明还提供一种应用上述方法配制的乙醇测定试剂盒，该试剂盒稳定性好、准确度高，适用于推广应用。该试剂盒由以下组分构成
缓冲液0.05-0.5 M稳定剂0.1-10 g/L辅酶I0.05-10 g/L乙醇脱氢酶0.5-50 KU/L黄递酶0.05-50 KU/L氧化型INT0.1-10 g/L防腐剂0.1-10 g/L。所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、MES缓冲液、Good’ s缓冲液、硼酸缓冲液中的一种。所述稳定剂为丙二醇、乙二醇、甘油、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白中的至少一种。所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300中的一种或几种。所述辅酶I 为 NADP+、NAD+、Thio-NAD 中的一种。所述试剂配成单试剂或双试剂或三试剂。单试剂即试剂盒中只有一种试剂，该试剂由缓冲液、稳定剂、辅酶I、乙醇脱氢酶、 黄递酶、氧化型INT、防腐剂组成。所述双试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1由缓冲液、稳定剂、辅酶I组成，试剂2由缓冲液、乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT、防腐剂组成。所述三试剂由试剂1、试剂2和试剂3组成，其中试剂1由缓冲液、稳定剂、辅酶I 组成，试剂2由缓冲液、乙醇脱氢酶、黄递酶、防腐剂组成，试剂3由氧化型INT组成。所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以制成液体试剂，直接使用。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单试剂、双试剂还是三试剂，本发明测定乙醇浓度的试剂都较为理想，稳定性好、准确度高，适用于推广应用。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。实施例1 本实施例的乙醇测定试剂盒为单试剂，由以下组成构成
三羟甲基氨基甲烷缓冲液0.1 M
丙二醇 Thio-NAD
乙醇脱氢酶黄递酶氧化型INT 叠氮钠
10g/L 2g/L 50 KU/L 20 KU/L
lg/L 0.1 g/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。本发明试剂测定样本中乙醇的测试条件如下温度30-37°C ；比色杯光径为 1. Ocm0检测主波长505nm，副波长700nm。应用本发明乙醇测定试剂测定样本中乙醇的方法如下样品(校准管以校准品做样品)加上述制备的单试剂，混勻后立即读取吸光度A0，30-37°C反应5min后，读取吸光度 Al，ΔΑ = Al-AO0其中样本用量5-10 μ 1，单试剂用量300 μ 1。实施例2 本实施例的乙醇测定试剂盒为双试剂，由试剂1和试剂2组成，其中试剂1三羟甲基氨基甲烷缓冲液 0.2Μ海藻糖5g/LNAD+6g/L试剂2试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。测试条件同实施例1。应用本发明乙醇测定试剂测定样本中乙醇的方法如下样品(校准管以校准品做样品)加试剂1混勻，30-37°C孵育3-5min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混勻，30_37°C 反应5min后，读取吸光度Al，ΔΑ = Al-AO。其中样本用量30 μ 1，试剂1用量225 μ 1，试剂2用量75 μ 1。实施例3 本实施例的乙醇测定试剂盒为三试剂，由试剂1、试剂2及试剂3组成，其中试剂1
Good's缓冲液
乙醇脱氢酶黄递酶
50 KU/L 50 KU/L 10 g/L 0.1 g/L
氧化型INT Proclin 300
3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液 0. 5M甘油3g/LNADP+5g/L试剂2
三羟甲基氨基甲烷缓冲液0.1 M
乙醇脱氢酶30 KU/L
黄递酶40 KU/L
Proclin 3000.1 g/L试剂3氧化型INT 10g/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测试条件同实施例1。应用本发明乙醇测定试剂测定样本中乙醇的方法如下样品(校准管以校准品做样品)加试剂1和试剂2混勻，30-37°C孵育3-5min后读取吸光度A0，立即加入试剂3混勻，30-37°C反应5min后，读取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中样本用量30 μ 1，试剂1用量 200 μ 1，试剂2用量25 μ 1，试剂3用量75 μ 1。实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种循环酶法测定乙醇浓度的方法，其特征在于包括以下步骤(1)乙醇+辅酶I &,臓, > 乙醛+还原型辅酶I ；(2)还原型辅酶I +氧化型INT翅_ ,辅酶I +还原型INT;(3)将最终反应物在505nm处测定吸光度的变化，计算出乙醇的含量。
2.—种乙醇测定试剂盒，其特征在于由以下组分构成缓冲液0.05-0.5 M稳定剂0.1-10 g/L辅酶I0.05-10 g/L乙醇脱氢酶0.5-50 KU/L黄递酶0.05-50 KU/L氧化型INT0.1-10 g/L防腐剂0.1-10 g/L。
3.根据权利要求2所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、MES 缓冲液、Good’ s缓冲液、硼酸缓冲液中的一种。
4.根据权利要求2所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述稳定剂为丙二醇、乙二醇、甘油、海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述辅酶I为NADP+、NAD+、 Thio-NAD 中的一种。
7.根据权利要求2 6中任一项所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述试剂配成单试剂或双试剂或三试剂。
8.根据权利要求7所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述双试剂由试剂1和试剂2 组成，其中试剂1由缓冲液、稳定剂、辅酶I组成，试剂2由缓冲液、乙醇脱氢酶、黄递酶、氧化型INT、防腐剂组成。
9.根据权利要求7所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述三试剂由试剂1、试剂2 和试剂3组成，其中试剂1由缓冲液、稳定剂、辅酶I组成，试剂2由缓冲液、乙醇脱氢酶、黄递酶、防腐剂组成，试剂3由氧化型INT组成。
10.根据权利要求2所述的乙醇测定试剂盒，其特征在于所述试剂盒为干粉试剂盒或液体试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种循环酶法测定乙醇浓度的方法以及应用该方法配制的乙醇测定试剂盒。该方法为辅酶I和乙醇在乙醇脱氢酶作用下生成还原型辅酶，还原型辅酶I在黄递酶作用下与氧化型INT反应，生成红色的还原型INT，检测最终反应物的吸光度变化，即可计算出样品中乙醇的浓度。该试剂盒由以下组分构成缓冲液0.05-0.5M、稳定剂0.1-10g/L、辅酶I 0.05-10g/L、乙醇脱氢酶0.5-50KU/L、黄递酶0.05-50KU/L、氧化型INT 0.1-10g/L、防腐剂0.1-10g/L。该方法反应专一性强，检测特异性高、灵敏度高、线性范围大，成本低；该试剂盒稳定性好、准确度高。
文档编号G01N21/31GK102564979SQ20111038206
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者沃燕波, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技有限公司