专利名称：稳定的乙醇测定液体试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种稳定的乙醇测定液体试剂盒。
背景技术：
乙醇(酒精)存在于大部分酒精类饮料中，其代谢的速率主要取决于体内酶的含量，具有较大的个体差异。众所周知，少量饮酒可以促进血液循环，但是大量酒精摄入则会导致酒精依赖，可造成精神和多器官功能损害，其中以对肝脏功能和精神功能的危害最为多见，也最为严重。乙醇的成瘾性、滥用和依赖是当今世界范围内最严重的社会经济和公共卫生问题之一，在西方国家，酒精相关性肝病已成为死亡的重要原因。因此血乙醇测定在急性乙醇中毒诊断及法医学鉴定中起着举足轻重的作用。生物样品中乙醇的定量测定方法主要有化学比色法、酶终点比色法、均相酶免疫测定法、气相色谱法和呼出气乙醇分析法等。气相色谱法被认为是乙醇测定的参考方法。 气相色谱法首先用NaCl饱和液在一封闭的容器中将血清或血样稀释，在封闭容器的上部是挥发的气体。这样取样使标本清洁，很小或没有基质影响。通过标准曲线可以完成峰值的定量。缺点是仪器昂贵，手续复杂不便推广。酶法自动分析法分乙醇氧化酶法和乙醇脱氢酶法，氧化酶法试剂组成简单，样品不需预处理，但特异性差，甲醇对测定干扰大，可出现假阳性。乙醇脱氢酶对于乙醇是相对特异的，不会与甲醇、丙酮或异丙醇等起催化反应，因此准确度和精密度较高，并且其可在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行测定，速度快，与气相色谱法相关性好，其原理如下
乙醇+辅酶I+ 乙醇脱誦 > 乙醛+还原型辅酶I+H+
根据乙醇被乙醇脱氢酶氧化生成乙醛的同时伴有辅酶I生成还原型辅酶I，产生的还原型辅酶I可直接在340 nm处比色检测，利用还原型辅酶I的酶法同正在使用中的许多其他酶法相似，能在实验室现有的仪器上完成，这在医学上有合适的灵敏度。酶分析法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析的优点，但由于乙醇脱氢酶极不稳定，高浓度在近中性纯水中5°C时仅可稳定存在几天，在酸性(pH低于 6.0)和碱性(pH大于8. 5)溶液中不稳定，并且重金属和目前普遍使用的反应促进剂如盐酸氨基脲、甘氨酸等对其有明显抑制作用；此外，试剂中使用的辅酶I在该反应条件下不稳定；因此该试剂必须制成干粉试剂才能长期保存稳定，复溶后也必须尽快使用，否则在保存过程中由于乙醇脱氢酶和辅酶I降解速度较快对试剂性能会造成很大影响，无法满足临床检测需要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种准确度、精密度均较好，稳定性好，2 8°C 避光保存至少可稳定12个月，完全能满足临床检验要求的稳定的乙醇测定液体试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为稳定的乙醇测定液体试剂盒，该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1各组分及浓度为
缓冲液(pH 8. 5-9. 5) 0. 05 0. 5 M (mol/L) 反应促进剂广200 g/L
稳定剂0. Γ10 g/L
防腐剂0. ΓΙΟ g/L ；
试剂2各组分及浓度为 缓冲液(pH 6. 0-7. 0) 0. 05 0. 5 M
β -辅酶I (又称辅酶I或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)0. Γ10 g/L
乙醇脱氢酶0. 2 200 KU/L
复合稳定剂0. Γ10 g/L
激活剂0. 1 100 g/L
防腐剂0. Γ10 g/L。本发明上述试剂1中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液，磷酸钠缓冲液等中的一种，优选 4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。本发明上述试剂1中的反应促进剂为丁二酸、盐酸氨基脲、甘氨酸、双苷肽、乙醛脱氢酶等中的一种或几种(即两种或者两种以上的混合，混合的几种组分之间的配比关系没有要求)。本发明上述试剂1中的稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰_；35 (Brij-35),曲拉通 100 (曲拉通X-100)等非离子表面活性剂中的一种或几种。本发明上述试剂2中的缓冲液为羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液等中的一种，优选羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，PH 6. 0-7. 0。上述的复合稳定剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、蔗糖、海藻糖或血清白蛋白中的一种或几种与酶复合稳定剂M03 (ES-W03)，酶复合稳定剂M07 (ES-W07),酶复合稳定剂M08 (ES-W08)中的一种组成的(即复合稳定剂是从谷胱甘肽、半胱氨酸、蔗糖、海藻糖或血清白蛋白中的一种或几种再与酶复合稳定剂M03，酶复合稳定剂M07，酶复合稳定剂M08中的一种一起混合使用)。上述的激活剂为巯基乙醇、二巯基苏糖醇、半胱氨酸和乙二酸四乙酸二钠中的一种或几种(即两种或者两种以上的混合，混合的几种组分之间的配比关系没有要求)。本发明的防腐剂为叠氮钠或proclin系列防腐剂(如Proclin300)等。本发明试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即按照上述配方比例，分别将试剂 1和试剂2所述的各组分分别加入蒸馏水后各自混合搅勻即可。本发明试剂盒测定样本中的乙醇的测试条件如下温度30-37 °C ；比色杯光径为 1. 0 cm。检测主波长340 nm。应用本发明乙醇测定试剂盒测定样本中乙醇的方法如下样品(校准管以校准品做样品)加试剂1混勻，30-37°C孵育3-5 min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混勻， 30-37°C反应5 min后，读取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中样本用量2 μ ，试剂1用量200μ ，试剂2用量50 μι。
本发明试剂盒测定样本中乙醇含量按以下公式进行计算
乙醇浓度遍定-Μ空白xC标准 a I 准—空白 t^
本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在
(1)本发明通过在试剂2中添加复合稳定剂，保护了乙醇脱氢酶和辅酶I在PH 6. 0-7. 0 缓冲液中的稳定性，本发明试剂2-8°C保存至少可稳定12个月，完全能满足临床检验要求。(2)本发明通过在试剂2中添加激活剂，一定程度上规避了反应促进剂对乙醇脱氢酶的抑制作用。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明并不限于这些实施例。本发明的检测原理如下根据乙醇被乙醇脱氢酶氧化生成乙醛的同时伴有辅酶I 生成还原型辅酶I，产生的还原型辅酶I可直接在340 nm处比色检测，吸光度变化率与样本中的乙醇浓度成正比。实施例1
试剂1各组分及浓度为 磷酸钠缓冲液(pH 8. 5) 0. IM 盐酸氨基脲 2 g/L 吐温201 g/L
Proclin3000. 1 g/L ；
试剂2各组分及浓度为
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(PH 6.0) 0. 05 M
辅酶 I0. 5 g/L
乙醇脱氢酶 20 KU/L
海藻糖(复合稳定剂)10 g/L
ES-W03 (复合稳定剂)10 g/L
巯基乙醇(激活剂)2 g/L
Proclin300 0· 2 g/L。试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅勻即可。实施例2
试剂1各组分及浓度为
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(PH 9.5)0. 05 M 双苷肽5 g/L
吐温 8010 g/L
Proclin300 0. 2 g/L ；试剂2各组分及浓度为
3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液(pH 6.5) 0. 1 M 辅酶I 5 g/L 乙醇脱氢酶 50 KU/L 半胱氨酸(复合稳定剂)5 g/L ES-W07 (复合稳定剂)1 g/L 二巯基苏糖醇(激活剂) 10 g/L 叠氮钠 0. 1 g/L。实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。实施例3
试剂1各组分及浓度为
4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液(pH 9.5) 0. 1 M
甘氨酸 10 g/L
布里杰-35 5 g/L
叠氮钠 0. 1 g/L
试剂2各组分及浓度为
羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(pH 7.0) 0. 1 M
辅酶I5 g/L
乙醇脱氢酶50 KU/L
谷胱甘肽(复合稳定剂)2 g/L
ES-W08 (复合稳定剂) 2 g/L
半胱氨酸(激活剂) 10 g/L
乙二酸四乙酸二钠(激活剂)1 g/L
Proclin3000. 1 g/L。实施例3试剂盒的制备方法同实施例1。对照例1
按实施例3进行配制，但不添加复合稳定剂谷胱甘肽和ES-W08。对照例2
按实施例3进行配制，但不添加激活剂乙二酸四乙酸二钠。
实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。本发明试剂盒测定样本中的乙醇的测试条件如下温度30-37 °C ；比色杯光径为 1. 0 cm。检测主波长340 nm。应用本发明乙醇测定试剂盒测定样本中乙醇的方法如下样品(校准管以校准品做样品)加Rl混勻，30-37°C孵育3-5 min后读取吸光度AO，立即加入R2混勻，30_37°C反应5 min后，读取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中样本用量2 μ ，试剂1用量200 μ ，试剂2 用量50 μ 。
本发明试剂盒测定样本中乙醇含量按以下公式进行计算
权利要求
1. 一种稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1各组分及浓度为 缓冲液(pH 8. 5-9. 5) 0. 05 0. 5 M 反应促进剂广200 g/L稳定剂0. Γ10 g/L防腐剂0. ΓΙΟ g/L ；试剂2各组分及浓度为缓冲液(pH 6. 0-7.0)0.05 0. 5 Mβ-辅酶I0.Γιο g/L乙醇脱氢酶0.2"。200 KU/L复合稳定剂0.Γ10 g/L激活剂0.1g 100 g/L防腐剂0.Γ10 g/L。
2.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂1中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、磷酸钠缓冲液中的一种。
3.根据权利要求2所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂1中的缓冲液为4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂1中的反应促进剂为丁二酸、盐酸氨基脲、甘氨酸、双苷肽、乙醛脱氢酶中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂1中的稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰-35、曲拉通100中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂2中的缓冲液为羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液中的一种。
7.根据权利要求6所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂2中的缓冲液为羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液。
8.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂2中所述的复合稳定剂为谷胱甘肽、半胱氨酸、蔗糖、海藻糖或血清白蛋白中的一种或几种与酶复合稳定剂M03，酶复合稳定剂M07，酶复合稳定剂M08中的一种混合使用。
9.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于试剂2中所述所述的激活剂为巯基乙醇、二巯基苏糖醇、半胱氨酸、乙二酸四乙酸二钠中的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的稳定的乙醇测定液体试剂盒，其特征在于所述的防腐剂为叠氮钠或proclin系列防腐剂2。
全文摘要
本发明公开一种稳定的乙醇测定液体试剂盒，该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1为缓冲液(pH8.5-9.5)0.05~0.5M，反应促进剂1~200g/L，稳定剂0.1~10g/L，防腐剂0.1~10g/L；试剂2为缓冲液(pH6.0-7.0)0.05~0.5M，β-辅酶I 0.1~10g/L，乙醇脱氢酶 0.2~200KU/L，复合稳定剂0.1~10g/L，激活剂0.1g~100g/L，防腐剂0.1~10g/L。本发明的试剂盒具有准确度、精密度均较好，稳定性好，2～8℃避光保存至少可稳定12个月，完全能满足临床检验要求的优点。
文档编号G01N21/31GK102495220SQ20111034726
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者沃燕波, 邹炳德 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司