专利名称：山梨醇脱氢酶诊断试剂盒及山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测 定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
山梨醇脱氢酶能可逆地催化D-山梨醇氧化为D-果糖。人体内此酶 主要分布肝脏，肾、脑、心、脾等组织中含量极少，血清中此酶活力 很低，如酶活力升高，强烈提示肝损害。检测血清SDH在反映肝损伤 方面较ALT可能更具特异性。
山梨醇脱氢酶测定方法国内多采用终点法，此法无需特殊试剂和仪 器，适合基层实验室应用，但操作繁琐，需除蛋白，敏感性低，干扰 因素多，且不能用于自动生化分析仪。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶) 在340nm波长处吸光度的变化，得以测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方 法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的山梨醇脱氢酶诊断试剂 盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分 析仪上进行山梨醇脱氢酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。本发明山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法原理如下
山梨醇+辅酶 山梨醇脱氢酶 山梨糖+还原型辅酶
这种方法应用山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase ; EC 1.1.99.21)
酶促反应连续监测法。山梨醇脱氢酶酶解山梨醇反应，最终将辅酶(在 340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)， 从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量 340nm处吸光度上升的速度，可以测算山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂还是双剂，如下成分关系的本发明山梨醇脱氢酶诊断
试剂较为理想
缓冲液 lOOmmol/L
稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
山梨醇 30 mmol/L
本发明的山梨醇脱氢酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、山梨醇。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、山梨醇。 辅酶、山梨醇在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是
干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂还是双剂，本发明测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法， 其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的山梨醇脱氢酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
山梨醇 30mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测山梨醇 脱氢酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)， 延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇
脱氢酶的活性浓度大小。 实施例二
本实施例的山梨醇脱氢酶诊断试剂为双试剂，包括:
试剂1
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
100mmol/L
50 mmol/L
mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
山梨醇
100mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37"C，反应时间10分钟，起始 吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测山梨醇 脱氢酶样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应 (上升反应)，延迟时间大约l分钟左右，检测时间2分钟左右，理论 K值2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇 脱氢酶的活性浓度大小。 实施例三
本实施例的山梨醇脱氢酶诊断试剂为双试剂，包括
訓mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L
層mmol/L 50 mmol/L 2 mmol/L
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 山梨醇 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
测定山梨醇脱氢酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度 37°C，反应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测 试副波长405nm，被测山梨醇脱氢酶样品与试剂1、试剂2的体积比 例为4/40/10，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟 左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇 脱氢酶的活性浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实 施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
权利要求
1.一种利用酶比色法技术的山梨醇脱氢酶活性浓度测定方法，其方法原理如下山梨醇+辅酶 山梨醇脱氢酶 山梨糖+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小测定结果。
2. —种山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂 1——50 mmol/L辅酶 1- 6 mmol/L山梨醇 1- 50mmol/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、辅酶、山梨醇组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、山梨醇组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、山梨醇组成。 辅酶、山梨醇在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1－4000mmol/L或0.1％100％体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法技术的山梨醇脱氢酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定山梨醇脱氢酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、山梨醇及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出山梨醇脱氢酶的活性浓度大小。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N21/78GK101173896SQ200610097310
公开日2008年5月7日 申请日期2006年10月30日 优先权日2006年10月30日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司