专利名称：一种陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因及其表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因及其 表达载体。
背景技术：
人类饮酒后90%的乙醇在肝内主要通过三个酶系统被氧化细胞质中的 乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)；微粒体乙醇氧化系统中的细胞色素 P4502E1 (CYP2E1)；过氧化物酶体中的过氧化物酶。ADH和CYP2E1是乙醇代谢的主要酶，产 生第一个和主要产物——乙醛，一种具有高细胞毒性，可诱导基因突变的致癌物质；乙醛经 乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALDH)转化成乙酸，通过TCA循环代谢为二氧 化碳和水。乙醛若未被及时降解会引起酒精敏感反应(表现为脸红、心搏快速、血压下降、 头晕、恶心、呕吐等)，还能导致器官病变。乙醛脱氢酶是一类依赖辅酶NAD(P)+催化内源及外源醛类底物为相应的羧酸类、 具有相似的一级特征结构的氧化还原酶类。该酶广泛于自然界中，在动物、植物和微生物中 均有发现，具有重要的生理代谢意义。据报道截止至2002年，已有555种编码ALDH的基因 被发现。迄今发现人体内至少有12种ALDH同工酶，常见的有ALDH1-ALDH4四种，分别由定 位于不同染色体的4个基因编码。其中，位于肝细胞线粒体内的ALDH2，由定位于人12号染 色体的ALDH2基因编码，与60%以上的乙醛代谢有关，可将乙醛转化为毒性较低、无致癌作 用的乙酸。ALDH2基因在外显子12处发生点突变(Glu487 Cys)，引起ALDH2失活。突变基 因ALDH2(2)对野生型ALDH2(1)为显性，这样的ALDH2 (2)纯合子和杂合子携带者的ALDH2 均无活性，表现出明显的遗传和疾病的多态性，多见于亚洲人种。这种人饮酒后乙醛不能及 时代谢，造成乙醛蓄积中毒，引起面红、头痛和恶心等不愉快反应，但是不易使人酗酒，有力 地保护了 ALDH2(2)携带者。相反，ALDH2(1)纯合型能及时代谢血中乙醛，饮酒出现轻松愉 快感，易成为酗酒人群，引发酒精性肝病。但若ALDH2(2)携带者饮酒后乙醛的天然抑制作 用被其嗜酒个性所抵消，高浓度的乙醛会长期积蓄在体内。即使比ALDH2(1)纯合型摄入的 酒精量少，杂合型习惯性饮酒者个体可能会有酒精性肝病的较高风险。基于酒精代谢中存在的ALDH基因多态性，开发高活性的ALDH是解酒制品研究的 重点方向之一。通过克隆高活性的ALDH基因，选择合适的高效表达系统，构建生产ALDH的 功能菌株来研制合适的解酒制品，将不仅有助于乙醛脱氢酶基因缺陷的人群饮酒后快速醒 酒、预防和治疗各种酒精性疾病，还能减轻和消除饮酒对人体健康的损害和对社会的不良 影响。本发明涉及的菌株陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2是本发明人从新 疆马奶葡萄中分离出的一株产ALDH的菌株，经过NCBI数据库搜索证实该菌株来源的ALDH 及其基因未见报道。因此通用生物信息学的方法，在NCBI数据库中已有的ALDH基因资源 中，通过简并PCR、Sitefing-PCR及 SEFAPCR 克隆了 陆生伊萨酵母 Issatchenkia terricola XJ-2的ALDH基因，并实现了其在大肠杆菌中的活性表达，为解酒制品的开发和应用提供依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种真核来源的编码乙醛脱氢酶 (ALDH)的功能基因。本发明的另一目的是提供含有该乙醛脱氢酶基因的重组表达载体。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种来自陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2的乙醛脱氢酶基因，该基 因序列为SEQ ID NO. 16。本发明所述乙醛脱氢酶基因的开放阅读框，该开放阅读框为完整的乙醛脱氢酶基 因开放阅读框，序列为SEQ ID NO. 17。本发明所述乙醛脱氢酶基因编码的乙醛脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ IDN0. 18。一种从陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2克隆乙醛脱氢酶基因的 方法在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶蛋白质序列的基础上，通过简并PCR、 Sitefinding-PCR及SEFA PCR技术从陆生伊萨酵母全基因组中克隆出乙醛脱氢酶基因。一种乙醛脱氢酶基因重组表达载体，该重组表达载体是将本发明所述的乙醛脱氢 酶基因插入表达载体所得，优选将本发明所述的乙醛脱氢酶基因插入载体pET_32a所得。本发明所述的乙醛脱氢酶基因在制备解酒制品中的应用。本发明所述的基因是一种真核来源编码乙醛脱氢酶的基因，在原核宿主中具有高 活性表达优势。其碱基组成为碱基数目百分比
A46029. 15
C31519. 96
G33120. 98
T47229. 91
G+C64640. 94。本发明人在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶氨基酸序列的基础上，设计 简并引物，以陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)基因组DNA为模板，利用简并 PCR、Sitef inding-PCR以及SEFAPCR进行扩增，拼接所有扩增产物获得全长3255bp的序列， 其中在191处有起始密码子ATG，在1766bp处有终止密码子TAA，具有1578bp完整的开放 阅读框(ORF)。该ORF序列无内含子，编码525个氨基酸。编码产物分子量为57. 223kD，等 电点pi为5. 7。将该ORF序列两端分别加上BamHI和XhoI限制酶识别序列，与经相同限制 酶消化的pET-32a连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21 (DE3) pLysS,实现了异源表达。本发明的有益效果是1.本发明运用生物信息学，在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶蛋白质序 列的基础上，设计简并引物，通过简并PCR、Sitefinding-PCR和SEFAPCR技术，从陆生伊萨 酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)中克隆得到一种新型、高活性的乙醛脱氢酶基因。2.在该基因两端分别加上BamHI和XhoI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的 pET-32a连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21 (DE3)pLysS,实现了该陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因的异源表达，酶活达44. 23U/mL。3.利用本发明基因，实现在大肠杆菌中的重组表达，克服了发酵陆生伊萨酵母 (Issatchenkia terricola XJ-2)生产乙醛脱氢酶产量低的缺点，可提供大量的乙醛脱氢 酶进行解酒制品的研究；并且为构建安全的乙醛脱氢酶基因工程菌奠定了基础。
图1重组陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶表达载体构建示意图
具体实施例方式实施例1 陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脱氢酶基因的克 隆将陆生伊萨酵母(Issatchenkiaterricola XJ-2)接入 IOOmL YPD 培养基，30°C， 200rpm培养17h。离心收集菌体，用《分子克隆实验指南》中的酵母DNA的小量制备方法提 取陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)的基因组DNA。从NCBI网站中搜索几种酵母乙醛脱氢酶序列，进行生物信息学分析，用 C0DEH0P(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)禾呈序选择其中的两 处高度保守的氨基酸序列VCGQIIPWN和GEVCCAGS，据此设计了简并引物ALD-Fl (SEQ ID NO. 1)和ALD-Rl (SEQ ID N0. 2)，进行简并PCR扩增两个保守区之间的序列。在50 μ 1 体系中，引物 ALD-Fl (SEQ ID NO. 1)和 ALD-Rl (SEQ ID NO. 2)终浓度各为 0. 8 μ M，dNTPs终浓度为0. 2mM,陆生伊萨酵母基因组DNA 10ng, 2U Pfu DNA聚合酶。扩增 程序为 940C 5min, 35 X (94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 60s)，72°C IOmin0 琼脂糖凝胶电泳，切胶， 采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与pMD19-T vector (TaKaRa, Dalian, China) 连接，转化 Ε. coli DH5a (Novagen，Germany，下同)，涂于含有 50 μ L X-gal/IPTG premix、 100μ g/mL氨苄青霉素的LB平板，37°C培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒， 确定连接成功后送到上海生工测序。乙醛脱氢酶基因保守区的旁邻序列由Sitefinding-PCR方法进行扩增。这种技 术涉及了两种衔头 SiteFinderl (SEQ ID N0. 3)和 SiteFinder2 (SEQ ID NO. 4)及与之对 应的衔头序列引物SFPl (SEQ ID N0. 5)、SFP2 (SEQ ID NO. 6)，还有2个已知基因特异弓丨 物GSP1、GSP2。以乙醛脱氢酶基因保守区序列的测序结果为基础，设计与SiteFinderl和 SiteFinder2 分别匹配的上游引物 GSP-Rl (SEQID N0. 7), GSP-R2 (SEQ ID NO. 8)和下游 引物 GSP-Fl (SEQ ID NO. 9)，GSP-F2 (SEQ ID NO. 10)。Sitefinding-PCR 扩增有 3 轮嵌套 反应程序。以SiteFinder-I扩增保守区序列5’端为例(保守区3’端序列的扩增则用 SiteFinder-2 替换 SiteFinder-I 并用特异引物 GSP-Fl，GSP_F2 替换 GSP-Rl，GSP_R2)。在 第一轮反应中，利用一个单一循环反应使SiteFinderl与基因组DNA退火，使SiteFinderl 与保守区序列 5，端连接。反应体系10XPCR buffer 2μ L,2. 5mM dNTP 2 μ L, 5U/ μ LTaq 聚合酶 0· 5 μ L，10 μ M Sitefinderl 1 μ L，基因组 DNA0. 5 μ L，ddH20 14 μ L, ^if 20 μ L ； 扩增程序:92°C 2min，95°C lmin，25°C lmin,以 0. 2°C /sec 升温至 68°C，68°C IOmin0 在随 后的第二轮反应中，以第一轮反应产物为模板，利用衔头序列引物SFPl (SEQ ID N0.5)与 基因特异引物GSP-Rl (SEQ ID N0. 7)对目标序列进行扩增；反应体系第一轮反应结束后立即将反应产物置冰上加入 10XPCR buffer 0. 5 μ L, 20 μ M SFPl 2. 5 μ L, 10 μ M GSP-Rl 1 μ L, ddH20 1 μ L，共计 25 μ L ；扩增程序94°C lmin，30X (95°C 10s, 68°C 6min)。在第三 轮反应中，将第二轮反应扩增产物稀释100倍作为模板，利用衔头引物SFP2(SEQ IDN0. 6) 与基因特异引物GSP-R2(SEQ ID NO. 8)继续使目的片段扩增并延伸；反应体系10XPCR buffer 5 μ L, 10 μ M SFP2 5 μ L，10 μ M GSP-R2 5 μ L，2· 5mM dNTP4 μ L, 5U/ μ L Taq 聚合酶 1 μ L，ddH20 28 μ L，稀释100倍的第二轮反应产物2 μ L，共计50 μ L ；扩增程序:72°C IOmin, 94°C lmin,30X (95 °C 10s，68 °C 6min)，72 °C IOmin0 PCR 结束后各取 5 μ L 反应液进行琼 脂糖凝胶电泳，确定有特异性条带出现。将PCR产物纯化后与pMD19-T载体连接，转化 Ε. (；01士0!15 0，涂于含有5(^1^ X-gal/IPTG premix、100 μ g/mL 氨苄青霉素 LB 平板，37°C培 养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。
分析测序结果，找到保守区与其旁邻序列的重叠区并拼接后提交至NCBI利用 Blastx比对，从已知序列中推测出乙醛脱氢酶ORF自起始密码子ATG开始的大部分片段， 但其3’端距终止子还缺400bp左右的片段。因此采用SEFAPCR法扩增该区域的序列。根 据Site-finding PCR法所扩增保守区下游序列设计嵌套引物SP1-SP5，其中SPl (SEQ ID NO. 11)，SP2 (SEQ ID NO. 12)，SP4(SEQID NO. 14)，SP5 (SEQ ID NO. 15)是根据已知序列设 计的特异性高退火的引物，SP3(SEQ ID NO. 13)是能够与已知序列部分退火配对的特殊引 物，是整个SEFAPCR的关键所在。SEFAPCR有三轮嵌套反应程序。第一轮扩增是先利用一 个单一循环反应以SP3为引物在低退火温度下利用其3’端的6个碱基在已知序列附近配 对，并以0.2°C/s的速度升至最高退火温度向已知序列方向扩增；反应体系2XGC buffer I 15μ L,2. 5mM dNTP 5 μ L, 5U/ μ L LATaq 聚合酶 0. 3 μ L，基因组 DNA 1 μ L，10 μ M SP3 0. 5μ L, ddH20 8. 2 μ L，共计 30 μ L ；扩增程序94°C 90s, 35°C 3min,以 0. 2°C /min 升温至 70°C，70°C 5min。反应结束后，取出PCR管加入10 μ M引物SPl 1. 5 μ L，使其在高退火温 度下扩增目的片段，扩增程序25X (94°C 30s, 70°C 5. 5min)；随后利用已有的反应体系进 行热不对称PCR，在目标片段得到大量扩增的同时，使SP3 “回头”与自身链配对并向5’ 端延伸，获得5，和3，端都含有和SP2配对的序列，扩增程序:2X (94°C 30s, 70°C 5min)， 94°C 30s, 55°C 30s, 70°C 5min)，共10个循环。第二轮反应以第一轮反应产物稀释10倍 为模板，以SP2为唯一引物进行巢式PCR扩增，使得PCR体系中两端包含SP2的目标条带 大量扩增。反应体系2XGC buffer I 15μ L,2. 5mM dNTP 5 μ L, 5U/ μ L LATaq 聚合酶 0. 3 μ L, 10 μ M SP2 1. 5 μ L，稀释 10 倍的第一轮反应产物 1 μ L，ddH20 7. 2 μ L，共计 30 μ L ； 扩增程序30Χ (94°C 3s, 70°C 5. 5min)。第三轮反应用于进一步甄别目标产物，以第二轮 反应产物的10倍稀释液为模板，以SP4为上游引物和SP5(位于SP2和SP3之间)为下游 引物进行热不对称PCR，使得PCR体系中两端分别包含SP4和SP5的目标条带大量扩增； 反应体系2 XGCbuffer I 15μ L,2. 5mM dNTP 5 μ L, 5U/ μ L LATaq 聚合酶 0. 3 μ L，10 μ M SP4 1. 5 μ L, 10 μ M SP5 0. 15 μ L,稀释 10 倍的第二轮反应产物 1 μ L, ddH20 7. 05 μ L,共计 30 μ L ；扩增程序:2Χ (94°C 30s, 70°C 5min)，94°C 30s, 55°C 30s, 70°C 5min)，共 10 个循环。 PCR结束后各取5 μ L反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确定有特异性条带出现。将PCR产物纯 化后与 PMD19-T vector 连接，转化 Ε. coli DH5 α，涂于含有 50 μ L X-gal/IPTG premix、 100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板，37°C培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒， 确定连接成功后送到上海生工测序。
用计算机软件DNAMAN分析所有PCR扩增产物测序结果，找到重叠区拼接，获得了 全长为3255bp的序列(SEQ ID NO. 16)，具有一个完整的1578bp的开放阅读框(SEQ ID NO. 17)，即陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因(ist-ALD)，编码一个由525个氨基酸组成的蛋白 质(SEQ ID NO. 18)。实施例2 陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脱氢酶基因原核 表达载体的构建(图1)根据获得的乙醛脱氢酶基因序列，设计两个引物，上游引物ALD-F2 (SEQ IDN0. 19) 加上BamHI识别序列，下游引物ALD-R2 (SEQ ID NO. 20)加上XhoI识别序列(下划线部分 为限制酶识别序列)。按照下列PCR体系加入各成分，扩增乙醛脱氢酶基因10XPfu PCR bufferlOyL, 10 μ M ALD-F2 4 μ L，10 μ M ALD-R2 4μ L,2. 5mM dNTPs 8 μ L，基因组 DNAlOng，Pfu DNA 聚 合酶 5U，ddH20 补至 100 μ L。PCR 程序为 94°C 5min，30X (94°C 30s, 60°C 50s, 72°C 4min)， 72°C IOmin。用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加BamHI、XhoI双酶切，灭活，乙 醇沉淀，ddH20重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-32a连接，转化大肠杆菌DH5a。 从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以 电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。实施例3 陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脱氢酶基因在大 肠杆菌中的表达将含有i st-ALD表达质粒pET-32a_i st-ALD转化大肠杆菌表达宿主菌株 BL21(DE3)pLysS，在含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上于37°C培养10-11小时后挑 取小菌落，接入添加100 μ g/mL氨苄青霉素和0.2% (w/v)葡萄糖的50mlLB液体培养基， 70-90rpm 30°C培养过夜，按照1 40的体积比取种子液加入到含有100 μ g/mL氨苄青霉 素和0. 2% (w/v)葡萄糖的IOOmL LB液体培养基，37°C 180rpm振荡2_3小时至OD6tltl约为 0.6时加IPTG(终浓度lOOyg/ml)于16°C诱导表达16h后离心收集菌体。破碎菌体，离 心收集上清液，作为乙醛脱氢酶粗酶液。其酶活测定方法3mL酶活测定体系中含有0. IM Tris-HCl 缓冲液(pH 8. 0), 2mM 乙醛，0. 5mM NAD+, 0. IM KCl, 0. IM 2-巯基乙醇以及一定浓 度的粗酶液，在25°C，340nm下测定NADH的浓度变化。以每分钟生成1 μ mol NADH所用的 酶量为1个酶活单位(U)。最终获得重组乙醛脱氢酶的酶活为44. 23U/mL。
权利要求
一种来自陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ 2的乙醛脱氢酶基因，其特征在于该基因序列为SEQ ID NO.16。
2.—种权利要求1所述乙醛脱氢酶基因的开放阅读框，其特征在于该开放阅读框为完 整的乙醛脱氢酶基因开放阅读框，序列为SEQ ID NO. 17。
3.权利要求1所述乙醛脱氢酶基因编码的乙醛脱氢酶，其特征在于其氨基酸序列为 SEQ ID NO. 18。
4.一种从陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2克隆乙醛脱氢酶基因的方法， 其特征在于在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶蛋白质序列的基础上，通过简并 PCR、Sitefinding-PCR及SEFAPCR技术从陆生伊萨酵母全基因组中克隆出乙醛脱氢酶基 因。
5.一种乙醛脱氢酶基因重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将权利要求1所 述的乙醛脱氢酶基因插入表达载体所得。
6.根据权利要求5所述的乙醛脱氢酶基因重组表达载体，其特征在于该重组表达载体 是将权利要求1所述的乙醛脱氢酶基因插入载体pET-32a所得。
7.权利要求1所述的乙醛脱氢酶基因在制备解酒制品中的应用。
全文摘要
本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因及其表达载体。该基因序列为SEQ ID NO.16，其开放阅读框序列为SEQ IDNO.17，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.18。将其插入表达载体后转化大肠杆菌，IPTG诱导表达。表达出的重组酶可催化乙醛氧化生成乙酸。本发明提供了一种新型、高活性的乙醛脱氢酶基因，利用本发明基因，实现在大肠杆菌中的重组表达，克服了发酵陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)生产乙醛脱氢酶产量低的缺点，可提供大量的乙醛脱氢酶进行解酒制品的研究；并且为构建安全的乙醛脱氢酶基因工程菌奠定了基础。
文档编号C12N9/02GK101985625SQ201010535839
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者别小妹, 吕凤霞, 姚正颖, 张充, 陆兆新 申请人:南京农业大学