专利名称：：按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因序列。
背景技术：
：随着经济的高速发展，人民生活水平的不断提高，高品质的生活越来越受到人们的关注，这其中最重要的一条就是健康。但是经济的发展又伴随着人们饮食结构的改变，工作、生活压力的增大，运动的减少和居住生活环境的恶化等等对健康不利的因素，各种疾病特别是恶性疾病的发病率有逐年增高的趋势，其中肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位，在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌，在我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45%。为了预防和治疗这些恶性疾病，全国每年花费大量的人力和物力，但收效甚微。据统计，全球现在有1500万-2000万人酗酒，其中10%-20%的人有不同程度的酒精性肝病。在我国，也有不少人嗜好饮酒。据报道，适量饮酒对大多数人的健康并没有损害，少量饮用酒精性饮料，如葡萄酒，对身体还有一定的好处。但是，若长期过量饮酒，特别是饮用高度酒，会使肝细胞反复发生脂肪变性、坏死和再生，最终导致肝硬化、肝癌。另外，根据报道乙醛脱氢酶的补充可以减少心肌缺血/再灌注损伤，减少心肌细胞由于缺氧而引起的凋亡等。许多文献已经表明乙醛脱氢酶的存在对心肌细胞都有良好的保护作用。基于以上原因，社会迫切的需要一种行之有效的解酒、保肝的保健品出现。今年来出现一些含乙醛脱氢酶的解酒药的报道，但是乙醛脱氢酶至今获得途径的狭窄，成为该类保健品的瓶颈。
发明内容本发明的目的在于提供一种按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列，该基因序列在毕赤酵母中可表达。为实现上述目的，本发明的技术方案是按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列，其特征在于按照毕赤酵母偏好性设计的DNA分子，该分子编码具有与人乙醛脱氢酶2基因geneID217编码的蛋白在氨基酸水平相同的核苷酸序列。本发明按照毕赤酵母偏好性，通过重叠延伸法合成了ALDH2序列；该序列编码的蛋白具有与野生型人ALDH2在氨基酸水平上具有相同功能。所述的野生型人ALDH2为geneID217编码的氨基酸序列的多肽。所述的按毕赤酵母偏爱密码子设计的人乙醛脱氢酶2基因序列是指在人J丄Z)//2基因(geneID217)基础上[由Genebank上人XLD/ODNA(geneID217)序列]，删除UTR和信号肽并加上内切酶五coRI和内切酶I酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法将编码Ala的密码子GCG替换为GCU，将编码Arg的密码子CGC和CGG替换为AGA、AGG、CGU禾口CGA;共修改了28个碱基得到目的序列ALDH2;具体序列如下-CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCMCCAGCAGCCCGAGGTCT60TCTGCAACCAGATTTTCATAAACMTGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC120CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG180ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGMCAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG300ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAMTGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC480CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGMTTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCMCTGGAAACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG660TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG720TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG780GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT960TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTMGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG1200AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGMGTTCMGACCATAGAGGAGGTTGTTG1260GGAGAGCCMCAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACMAGGATTTGGACA1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA1500AGAACTCAGCGGCCGA1516设计的毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列按下列方法在毕赤酵母中表达用现有的重叠延伸法合成产人乙醛脱氢酶2序列(ALDH2)，用现有的常规方法将产人乙醛脱氢酶2连接在质粒pUC57上，得到质粒pUC57-ALDH2。并按常规化学转化法转化该质粒至大肠杆菌DH5a，得到大肠杆菌DH5a(pUC57-ALDH2)。用酚氯仿或DNA提取试剂盒从含有质粒pUC57-ALDH2的大肠杆菌DH5a(pUC57-ALDH2)中提取质粒pUC57-ALDH2;准备质粒pPIC9K和pUC57-ALDH2，分别用内切酶&oRI和内切酶A^I双酶切，并电泳回收酶切后的质粒pPIC9K和产人乙醛脱氢酶2序列。用T4连接酶连接酶切后的质粒pPIC9K和产人乙醛脱氢酶2序列，并按常规化学转化法转化该质粒至大肠杆菌DH5a，得到大肠杆菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)。用酚氯仿或DNA提取试剂盒从含有质粒pPIC9K-ALDH2的大肠杆菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)中提取质粒pPIC9K-ALDH2。用内切酶SacI线性化。得到的线性化pPIC9K-ALDH2电转导至巴斯德毕赤酵母(尸/cWapflWonJ)GS115。并筛选得到酶活较高的巴斯德毕赤酵母(尸/c/2/a;aWo/^)GS115-07ALDH2菌株。本发明的有益效果是该基因序列在毕赤酵母中可表达人乙醛脱氢酶2。所得到的一株巴斯德毕赤酵母(P/c/z/apaWo^)GS115-07ALDH2菌株可应用于解酒、保肝；具有解酒、保肝的效果。图1是质粒pUC57-ALDH2和质粒pPIC9K酶切回收片段图。泳道1、泳道2是质粒pUC57-ALDH2酶切回收图，泳道3是质粒pPIC9K酶切回收图。图2是大肠杆菌DH5a感受态细胞转化质粒pPIC9K-ALDH2菌液PCR图。具体实施例方式一、质粒pPIC9K-ALDH2的获得及其验证1.目的序列设计与合成按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列，其特征在于按照毕赤酵母偏好性设计的DNA分子，该分子编码具有与人乙醛脱氢酶2基因geneID217编码的蛋白在氨基酸水平相同的核苷酸序列。所述的按毕赤酵母偏爱密码子设计的人乙醛脱氢酶2基因序列是指在人^丄￡>//2基因(geneID217)基础上[由Genebank上人^LD//2DNA(genelD217)序列]，删除UTR和信号肽并加上内切酶五coRl和内切酶iVwI酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法将编码Ala的密码子GCG替换为GCU，将编码Arg的密码子CGC和CGG替换为AGA、AGG、CGU禾口CGA;共修改了28个碱基得到目的序列ALDH2;具体序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT60TCTGCMCCAGATTTTCATAMCAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC120CCACCGTCMTCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG180ATGTGGACMGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG300ACAGMCCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCMATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACAAGGCATGAAC480CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGAAACGTGGTTGTGATGMGGTAGCTGAGCAGACAC600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG660TCAACATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG720TGGACMAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTAATCCAGGTTGCTGCTG780GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGMCCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT960TTGTGGAGCGAAGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGAAGATCCTCGGCTACATCA1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTAAGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG1200AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG1260GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA1500AGMCTCAGCGGCCGA1516按上述目的序列ALDH2，用现有的重叠延伸法合成产人乙醛脱氢酶2序列(ALDH2)，用现有的常规方法将产人乙醛脱氢酶2(ALDH2)连接在质粒pUC57上，得到质粒pUC57-ALDH2;使用上海生工的高效制备感受态细胞试剂盒制备大肠杆菌DH5ot感受态细胞；将lOpL质粒pUC57-ALDH2与50pL大肠杆菌DH5a感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42。C热击l-2min;再放置在冰上冷却l-2min后加人500pL的LB培养基，37。C振荡培养lh;取100pL培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37'C培养过夜，得到的含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子，保存备用；2.质粒构建用酚氯仿或DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司Hl-l-3)从含有质粒pUC57-ALDH2的阳性转化子中提取质粒pUC57-ALDH2;准备质粒pPIC9K，并用内切酶￡coRI和内切酶iVo/I双酶切；①按下述原料配比选取质粒pUC57-ALDH2、WashSolution、内切酶五coRl、内切酶iVwI、小牛血清白蛋白和蒸馏水，在37T:酶切12h;电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收产人乙醛脱氢酶2序列(如图l，酶切验证回收的产人乙醛脱氢酶2序列为目的序列ALDH2);②按下述原料配比a.酶切质粒pUC57-ALDH2缓冲液WashSolution10nL，3nL，L，内切酶五coRl(20U4iL)内切酶iVwI(5U/(xL)小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)蒸馏水7质粒pPIC9K缓冲液WashSolution内切酶五coRl(20U&L)内切酶iVwI(5U/^L)小牛血清白蛋白BSA(lmg/mL)蒸馏水10(iL，3pL，3nL，l(VL，选取质粒pPIC9K、缓冲液WashSolution、内切酶五coRl、内切酶iVwI、小牛血清白蛋白和蒸馏水，在37'C酶切12h;电泳并用酚氯仿法或DNA提取试剂盒回收酶切后的质粒pPIC9K(如图1);b.连接按产人乙醛脱氢酶2序列和酶切后的质粒pPIC9K的摩尔比2:1混合，得到混合DNA，用T4连接酶连接；按下述原料配比T4连接酶lpL，T4连接酶缓冲液2pL，混合DNA7pL，选取T4连接酶、T4连接酶缓冲液和混合DNA，在4'C连接过夜，得到连接产物(pPIC9K陽ALDH2);连接产物(pPIC9K-ALDH2)转化大肠杆菌DH5a:将10pL上述连接产物(pPIC9K-ALDH2)与50pL大肠杆菌DH5a感受态细胞混合，冰上放置30min，然后在42。C热击l-2min;再放置在冰上冷却l-2min后加入500pL的LB培养基，37。C振荡培养lh;取100pL培养物涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37。C培养过夜，得到大肠杆菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)。挑取大肠杆菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)，接种到lmL含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37°C150r/min振荡培养过夜，离心，离心条件10000g离心lmin，弃上清，挑取少量菌体悬浮于20nL蒸馏水中，沸煮10min，离心，离心条件10000g离心lmin，取4jxL上清作模板，进行菌液PCR;PCR引物为5'AOX1(5，—gactggttccaattgacaagc-3，)和3'AOX1(5，-gcaaatggcattctgacatcctct-3');PCR体系(20pL):模板化L，上游引物(2mmol/L)2pL，下游引物(2mmol/L)2pL，10Xbuffer2pL，MgCl2(25腿ol/L)l单，dNTPs(2mmol/L)2pL，3.验证:Taq酶(5U/pL)0.5pL，蒸馏水6pL;混合后在PCR条件反应95。C3min,94。Clmin—「55。CL5min|25次72°Clmin~172。C8min,PCR产物琼脂糖电泳检测(错误！未找到引用源。)；菌液PCR阳性的进一步测序验证，大肠杆菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)中ALDH2序列为前述的目的序列ALDH2。按毕赤酵母偏好性设计人ALDH2的核酸序列与人ALDH2cDNA序列(丽一000690)比较Identity=98.13%(1472/1500)G即4.06%(16/1516)二、菌株的构建和筛选1.质粒的线性化与电转导质粒的线性化从大肠杆菌DH5a(pPIC9K-ALDH2)中提取质粒pPIC9K-ALDH2;采用内切酶&cI(2U4iL)5^L、小牛血清白蛋白(lmg/ml)3^L、缓冲液10XBufferG3pL、超纯水9nL和质粒pPIC9K隱ALDH210pL，在37。C孵育过夜；再用酚氯仿异戊醇=25:24:1，抽提线性化产物，然后用乙醇沉淀线性化产物，最后用1020^LTE缓冲液溶解，得到线性化质粒溶液；巴斯德毕赤酵母(尸/cWfl)GS115的电转导首先取0.2mL巴斯德毕赤酵母(尸/c/^户"加n's)GS115的一级种子液，接种到含50mlYPD培养基的300mL摇瓶中，使巴斯德毕赤酵母(P!'c/n'apa加n's)GS115菌体浓度生长至OD600=1.3-1.5，后收集菌体，用5.0mL灭菌超纯水洗涤菌体5次，最后用O.lmL、4"C的1M山梨醇来悬浮细胞；然后取90pL山梨醇悬浮细胞与10pL线性化质粒溶液混合，转入4'C的lmm电转杯中，在电转仪1200V、5ms的条件进行电转，电转导样品涂布到MD培养基上，3(TC培养2-3d，得到巴斯德毕赤酵母(尸/c//a;^Ww^)GS115-07ALDH2菌株；2.菌株的筛选从巴斯德毕赤酵母(尸/c/H'a/aWw^)GS115-07ALDH2菌株中挑选单菌落，进行诱导表达，首先采用SDS-PAGE电泳来剔除假阳性菌株；然后，再对阳性菌株进行再一次的诱导表达，检测方法改变为检测其上清液中的酶活，选取酶活最高的菌株的最佳菌株，即得到一株巴斯德毕赤酵母(Pz'cWa/aWw^)GS115-07ALDH2菌株(即一株重组毕赤酵母菌株)。三、一株巴斯德毕赤酵母(户/cWa;aWw^)GS115-07ALDH2菌株的鉴定1、上述步骤二得到的一株巴斯德毕赤酵母(尸/c/n'";"Woni)GS115-07ALDH2菌株(即一株重组毕赤酵母菌株)的形态特征与生理生化特性见表l。表1检测结果检测项目结果检测项目结果细胞形状球形-卵海藻糖+圆形纤维二糖-分裂方式芽殖淀粉-利用糖发酵D-木糖+葡萄唐+L-阿拉伯糖-蔗糖-D-核糖-半乳糖-鼠李糖+麦芽糖-柠檬酸+乳糖-2-酮葡萄糖+海藻糖+糊精+/陽棉子糖-e-甲基-D-葡糖苷+利用碳水化合物杏甘+半乳糖-熊果甘+葡萄糖+D-树胶醛糖+蔗糖-L-树胶醛糖+半乳糖-吐温80+麦芽糖-乳糖-表l中符号说明"+":90%以上的菌株为阳性，"-"90%以上的菌株为阴性表1说明该菌株的形态特征与生理生化特性与巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/apwtor^)GS115(为华中农业大学生命科学技术学院赠送)一致。2、上述步骤二得到的一株巴斯德毕赤酵母(尸/cWfl/arfor^)GS115-07ALDH2菌株的全细胞脂肪酸组份的鉴定，见表2。检测结果Volume:DATAFile:E091124.00ASampCtr:3Idnumber:1932Type:SampBottle:2Method:YEAST6Created:1/12/200910:24:34AMSampleID:GS115表2—株巴斯德毕赤酵母(P/cW"pa对oA)GS115-07ALDH2菌株的全细胞脂肪酸组份及其含量RTResponAr/HRFacECLPeakNameCommentlComment21.81941E+80.03—_6.994SOLVENTPEAK—<minrt2.11128800.03—■7.519—<minrt10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>ECLDeviation:0.003eferenceECLShift:0.002NumberReferencePeaks:1TotalResponse:130182TotalN謹d:130182PercentNamed:100.00%Totalamount:114616表2说明该菌株的全细胞脂肪酸组份与巴斯德毕赤酵母(P/c/z/a/7"对w^)GS115(为华中农业大学生命科学技术学院赠送)相似。3、上述步骤二得到的一株巴斯德毕赤酵母(户/c/n'a)GS115-07ALDH2菌株的18SrRNA基因序列如下TGAGCCATTCGCAGTTTCACCGTATAATGCTA该菌株的18SrRNA基因序列与巴斯德毕赤酵母(户/c^"/^tor^)GS115的18SrRNA基因序列完全相同。以上三方面检测结果说明，检测菌株为巴斯德毕赤酵母(尸/c/n'fl户aWw^)GS115。命名为一株巴斯德毕赤酵母(尸/cWa/^Ww^)GS115-07ALDH2菌株(即为一株重组毕赤酵母菌株)，己于2009年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号CCTCCN0:M208266。四、一株巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/a;^WoW;y)GS115-07ALDH2菌株应用将一株巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/a戸WW7、)GS115-07ALDH2菌株在BMGY培养基中培养24h，再收集菌体转入到BMMY培养基中诱导表达60h，离心(6000转/分)5分钟，取上清液加入质量浓度为250g/L的聚乙二醇PEG8000沉淀上清液中的人乙醛脱氢酶2，然后加入和上清液等体积的蒸馏水，溶解人乙醛脱氢酶2，得到含人乙醛脱氢酶2的酶液，最后采用壳聚糖来进行固定，固定具体过程如下①取3.00g壳聚糖(脱乙酰度>90%)，加入蒸馏水100mL，磁力搅拌10min，充分混匀；再加入lmL冰醋酸，磁力搅拌2h，得到壳聚糖胶液；②在磁力搅拌的情况下，向上述50mL壳聚糖胶液中，加入10mL含人乙醛脱氢酶2的酶液(浓度为100mg/mL),搅拌均匀后，再加入质量浓度为20mg/mL的焦磷酸钠溶液50mL，搅拌10min，静置固定化3h;得到初始固定化酶，用蒸馏水将多余的焦磷酸钠洗掉，得到固定化酶样品；③将上述固定化酶样品用冷冻干燥机干燥，在-50。C下干燥48h至干燥完全，得到固定化酶(产品)。所述的BMGY培养基1%(质量含量)酵母膏，2%蛋白胨，1.34%酵母氮源碱YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，4X1(T5%生物素，1%甘油，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH为6.0);余量为蒸馏水。所述的BMMY培养基1%酵母膏，2%蛋白胨，1.34%酵母氮源碱YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，4X1(T5%生物素，0.5%甲醇，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH为6.0)，余量为蒸馏水。12五、毕赤酵母基因表达产物乙醛脱氢酶的动物学检验将人乙醛脱氢酶2进行固定化处理，得到的样品来检验解救小鼠急性酒精中毒的能力。1、人乙醛脱氢酶2固定化处理动物的胃液pH值很低，而ALDH2极易分解，故用壳聚糖进行固定化处理后再进行小鼠灌胃实验。具体过程如下①取3.00g壳聚糖(脱乙酰度>90%)，加入蒸馏水100mL，磁力搅拌10min，充分混匀；再加入lmL冰醋酸，磁力搅拌2h，得到壳聚糖胶液；②在磁力搅拌的情况下，向上述50mL壳聚糖胶液中，加入10mL含人乙醛脱氢酶2的酶液(100mg/mL)，搅拌均匀后，再加入质量浓度为20mg/mL的焦磷酸钠溶液50mL，搅拌10min，静置固定化3h;之后得到初始固定化酶，用蒸馏水将多余的焦磷酸钠洗掉，得到固定化酶样品；③将上述固定化酶样品用冷冻干燥机干燥，在-50。C下干燥48h至干燥完全，固定化所得酶制剂置4°C保存。小数灌胃前取4g酶制剂加入到10mL1%CMC中制成悬浊液备用[因为固定化酶(产品)是固态，不方便喂养小鼠，所以将固定化酶(产品)做成悬浊液为方便喂养，所以后面所涉及到喂食的固定化酶(产品)都为这种悬浊液，取名为"固定化酶悬浊液"〗。2、醉酒剂量实验30只小鼠随机分为3组，每组10只。实验前禁食12h，不禁水。实验时各组小鼠分别按14mL/kg、16mL/kg、18mL/kg的剂量灌胃56。二锅头，观察12h。记录小鼠醉酒时间与醒酒时间以及醉酒率和死亡率。小鼠醉酒的判断标准是小鼠取背向位放入盒子中。若小鼠背向下的姿势可保持30s以上，则认为翻正反射消失，即为醉酒。剂量实验结果如表3;表3不同给酒剂量小鼠急性酒精中毒实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3、醉酒预防实验将40只小鼠(雌雄各半)预养3d，分成模型组、服用固定化酶悬浊液组。每组10只，各组小鼠实验前禁食12h，不禁水。模型组每只按20mL/kg的灌胃量灌注浓度为P/。的CMC，其余三组每组每只按20mL/kg的灌胃量灌注相应的固定化酶悬浊液。30min后各组小鼠均按16mL/kg灌胃56。二锅头，记录给白酒时刻、各组醉酒动物翻正反射消失时刻、翻正反射恢复时刻，进一步计算睡眠时间(小鼠翻正反射消失至翻正反射恢复的时间)，醉酒时间=翻正反射消失时刻一给酒时刻，醒酒时间亦即睡眠时间。4、醉酒治疗实验小鼠数目，分组及实验方法同前面醉酒预防实验，将灌酒和灌酶液的先后次序对调，改为灌酒30min后再喂固定化酶悬浊液。记录给酒后，小鼠的醉酒时间和醒酒时间。结果如表；表4小鼠的醉酒时间和醒酒时间预防实验治疗实验实验组别醉酒时间醒酒时间醒酒时间(min)PPP(min)(min)模型组固定化酶悬浊液组34.3±3.2946.1±3.98253.20±52.38<0.05190.30±15.42<0.05241.0±42.46187.卯±17.99<0.05由结果由表4可知，治疗实验和预防实验结果基本是一致的。喂了固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]的小鼠的醒酒时间，与对照组相比，均有不同程度的縮短。此外，在灌酒之前用固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]灌胃可以延缓小鼠的醉酒。说明固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]有显著的解酒效果。所选用醉酒时间是表示小鼠从喝酒到已经醉酒的时间，如果这个时间段越长，说明吃了本发明的固定化酶悬浊液后，小鼠可以有效的延长他们的醉倒。5、小鼠体内转氨酶的检测小鼠30只，随机分为空白组、模型组、服用固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]组共3组。每组10只，各组小鼠先禁食12h，不禁水。空白组不喂任何物质，模型组每只按20ml/kg的灌胃量灌注浓度为1%的CMC，其余三个实验组每组每只按20mL/kg的灌胃量灌注相应的酶液。30min后除空白组外其余各组小鼠均按16mL/kg灌胃56。二锅头。300min后所有组的小鼠均断头取血，并解剖取小鼠肝脏。用千分之一天平准确称取小鼠肝脏，按重量体积比加99倍生理盐水制成1%匀浆，3500r/min离心IO分钟，取上清待测。按照试剂盒说明书测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶。自断头取血后获得的血液样品制备血清，按照试剂盒说明书进行谷丙转氨酶、谷草转氨酶的测定。结果如表5。表5血液和肝脏中转氨酶活力测定结果_ALT/GPT(U/mg蛋白)AST/GOT(U/mg蛋白)实验组别-_血液P肝脏P血液P肝脏P空白组950±68470±78830±98364±282206±1模型组<0.051200±156<0.051923±165<0.05988±170<0.0535固定化酶1203±8<0.05606±78<0.05932±70<0.05420±72<0.05悬浊液组9_转氨酶检测结果可以看出固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]组显著低于模型组(模型组是每只按20mL/kg的灌胃量灌注浓度为1%的CMC，因为本发明的酶是悬浊在1%的CMC里，需要检测防醉酒到底是1%的CMC在起作用，还是本发明的酶在起作用，所以设这一个模型组来证明不是P/。的CMC在起作用)，且不同程度地高于空白组。三个实验组之间有明显差别，结果表明固定化酶悬浊液[即固定化酶(产品)]对小鼠的肝脏起到了明显的保护作用。权利要求1.按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列，其特征在于按照毕赤酵母偏好性设计的DNA分子，该分子编码具有与人乙醛脱氢酶2基因geneID217编码的蛋白在氨基酸水平相同的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列，其特征在于所述的按毕赤酵母偏爱密码子设计的人乙醛脱氢酶2基因序列是指在人J丄Z^T2基因(geneID217)基础上，删除UTR和信号肽并加上内切酶￡coRI和内切酶M)fI酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法将编码Ala的密码子GCG替换为GCU，将编码Arg的密码子CGC和CGG替换为AGA、AGG、CGU和CGA;共修改了28个碱基得到目的序列ALDH2;具体序列如下CGGAATTCTCAGCCGCCGCCACCCAGGCCGTGCCTGCCCCCAACCAGCAGCCCGAGGTCT60TCTGCAACCAGATTTTCATAAACAATGAATGGCACGATGCCGTCAGCAGAAAAACATTCC120CCACCGTCAATCCGTCCACTGGAGAGGTCATCTGTCAGGTAGCTGAAGGGGACAAGGAAG180ATGTGGACAAGGCAGTGAAGGCCGCCAGAGCCGCCTTCCAGCTGGGCTCACCTTGGAGAC240GTATGGACGCATCACACAGAGGCCGACTGCTGAACAGACTGGCCGATCTGATCGAGAGGG300ACAGAACCTACCTGGCTGCCTTGGAGACCCTGGACAATGGCAAGCCCTATGTCATCTCCT360ACCTGGTGGATTTGGACATGGTCCTCAAATGTCTCAGATATTATGCCGGCTGGGCTGATA420AGTACCACGGGAAAACCATCCCCATTGACGGAGACTTCTTCAGCTACACMGGCATGAAC■CTGTGGGGGTGTGCGGGCAGATCATTCCGTGGAATTTCCCGCTCCTGATGCAAGCATGGA540AGCTGGGCCCAGCCTTGGCAACTGGMACGTGGTTGTGATGAAGGTAGCTGAGCAGACAC600CCCTCACCGCCCTCTATGTGGCCAACCTGATCAAGGAGGCTGGCTTTCCCCCTGGTGTGG660TCMCATTGTGCCTGGATTTGGCCCCACGGCTGGGGCCGCCATTGCCTCCCATGAGGATG720TGGACAAAGTGGCATTCACAGGCTCCACTGAGATTGGCCGTGTMTCCAGGTTGCTGCTG780GGAGCAGCAACCTCAAGAGAGTGACCTTGGAGCTGGGGGGGAAGAGCCCCAACATCATCA840TGTCAGATGCCGATATGGATTGGGCCGTGGAACAGGCCCACTTCGCCCTGTTCTTCAACC900AGGGCCAGTGCTGCTGTGCCGGCTCCAGAACCTTCGTGCAGGAGGACATCTATGATGAGT960TTGTGGAGCGMGCGTTGCCAGAGCCAAGTCTCGTGTGGTCGGGAACCCCTTTGATAGCA1020AGACCGAGCAGGGGCCGCAGGTGGATGAAACTCAGTTTAAGMGATCCTCGGCTACATCA1080ACACGGGGAAGCAAGAGGGGGCTMGCTGCTGTGTGGTGGGGGCATTGCTGCTGACCGTG1140GTTACTTCATCCAGCCCACTGTGTTTGGAGATGTGCAGGATGGCATGACCATCGCCAAGG12Q0AGGAGATCTTCGGGCCAGTGATGCAGATCCTGAAGTTCAAGACCATAGAGGAGGTTGTTG1260GGAGAGCCAACAATTCCACGTACGGGCTGGCCGCAGCTGTCTTCACAAAGGATTTGGACA1320AGGCCAATTACCTGTCCCAGGCCCTCCAGGCTGGCACTGTGTGGGTCAACTGCTATGATG1380TGTTTGGAGCCCAGTCACCCTTTGGTGGCTACAAGATGTCGGGGAGTGGCAGGGAGTTGG1440GCGAGTACGGGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTCACAGTCAAAGTGCCTCAGA1500AGAACTCAGCGGCCGA1516。全文摘要本发明涉及一种基因序列。按毕赤酵母偏爱密码子设计人乙醛脱氢酶2序列，其特征在于按照毕赤酵母偏好性设计的DNA分子，该分子编码具有与人乙醛脱氢酶2基因geneID217编码的蛋白在氨基酸水平相同的核苷酸序列。所述的按毕赤酵母偏爱密码子设计的人乙醛脱氢酶2基因序列是指在人ALDH2基因(geneID217)基础上，删除UTR和信号肽并加上内切酶EcoRI和内切酶NotI酶切位点，再根据毕赤酵母密码子用法将编码Ala的密码子GCG替换为GCU，将编码Arg的密码子CGC和CGG替换为AGA、AGG、CGU和CGA；共修改了28个碱基得到目的序列ALDH2。该基因序列在毕赤酵母中可实现高效表达，可应用于解酒、保肝；具有解酒、保肝的效果。文档编号C12N15/53GK101649323SQ20091006271公开日2010年2月17日申请日期2009年6月16日优先权日2009年6月16日发明者吴元欣,池汝安,锦赵,赵玉凤,凡邓,雷明科,锟黄申请人:武汉工程大学