专利名称：检测乙醇脱氢酶1b基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合分子开关技术检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒和检测方法，特别涉及一种检测ADHlB基因rsl229984位点的单核苷酸多态性(SNP)的试剂盒以及PCR扩增方法，属于生物医学领域。
背景技术：
乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)介导的氧化途径是酒精代谢的主要途径，其多态性可以影响个体对酒精的代谢能力。ADHlB在第3外显子处发生G143A点突变形成ADH1B*2，使得其编码的亚单位β 的第47位的精氨酸被组氨酸替代，形成β 2。ADHlB*2/*2等位基因编码的酶活性是ADH1B*1/*1等位基因编码的酶活性的40倍，加速了乙醇向乙醛的转化，在短时间内乙醛即大量累积。ADHlB基因多态性在不同种族存在差异，在亚洲人和白种人中，ADH1B*2等位基因频率分别为60% 80%和0% 10%。乙醇脱氢酶IB的多态性对个体的饮酒行为和多种疾病易感性有着重要的影响。具有*2/*2基因型个体由于饮酒后血中乙醛含量迅速升高，其拟交感神经毒副作用刺激神经组织释放出儿茶酚胺作用于心血管系统和神经系统，诱发脸红、恶心、头痛等反应，这类反应引发的主观不适感降低了个体对饮酒的兴趣，促其主动放弃继续饮酒而阻抑过度饮酒的发生，因而此基因型被认为是饮酒的天然“抑制因子”。Muramatsu等对上海人和Thomasson等对中国台湾人的研究发现非饮酒者ADH1B*2等位基因频率高于饮酒者。饮酒不仅能引起许多社会问题，而且对机体也产生一定的损害，长期酗酒可诱发一系列心脑血管疾病，机体某些组织器官的损伤，对身体产生严重的损害甚至引起肿瘤的发生。饮酒的健康危害主要由酒精及其中间代谢物乙醛引起，国外动物学研究证实，酒精的中间代谢产物乙醛是一种肯定性的致癌 剂。ADH1B*2等位基因携带饮酒者有显著的肝脏酶(如碱性磷酸酶，r 一谷氨酰转移酶，丙氨酸转氨酶)水平的升高，而这些酶与酒精性肝脏疾病的发生有关；酒精中毒是导致心脏非缺氧性损伤的主要因素，乙醛的加速生成可造成心肌细胞损伤引起一系列心脑血管疾病；持续性饮酒者唾液中乙醛水平升高，还可导致上消化道肿瘤的发生。
发明内容
人乙醇脱氢酶IB基因遗传多态性直接或间接影响患者饮酒行为和多种疾病的发生。本发明提供一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合分子开关技术检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法。本发明采用的技术方案:一种检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒，所述试剂盒在一个PCR反应中对ADHlB基因上rsl229984SNP位点进行分型。所述试剂盒包括检测ADHlB基因rsl229984SNP位点的外侧双向引物和2条双向序列特异性引物。
所述检测ADHlB基因rsl229984SNP的引物碱基序列如下所示:外侧正向引物:AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCA外侧反向引物:GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAA
突变型引物:AACCACGTGGTCATCTGTGC野生型引物:TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA。所述的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒所采用的检测方法，对受检样本DNA用扩增缓冲液进行扩增，扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，扩增片段由大到小依次是:内对照459bp，野生型产物337bp和突变产物164bp，根据条带的有无判断SNP位点的基因型。
所述的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒的扩增方法，包括以下步骤:预变性由I次循环构成,其条件为:温度为94°C，时间为5分钟；PCR扩增由30次循环构成，其条件为:变性:温度为94°C，时间为30秒；退火:温度为56°C，时间为30秒；延伸:温度为72°C，时间为90秒；扩增结束后于4°C保存至电泳检测。本发明与现有技术相比具有下列优点和效果:(I)本发明采用单管双向等位基因特异性扩增技术，在一次PCR反应中即可判断SNP位点的基因型，提高检测效率降低检测成本。(2)本发明采用SNP敏感性分子开关技术，使3’端不能与模板互补的引物所引发的扩增非成熟性终止，无法形成产物，避免假阳性结果的产生。(3)引入内参，为阴性结果的判读提供依据，避免假阴性结果的产生。(4)本发明扩增后只需通过DNA凝胶电泳及凝胶成像系统即可完成检测，不需添置贵重设备，快速，准确，灵敏，特异，重复性好，大幅降低了检测成本和操作复杂程度，适合临床和科研使用。(5)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染。(6)本发明的试剂盒，提供2X扩增缓冲液，使用者只需加入全血裂解悬液和聚合酶即可进行扩增，减少了操作步骤，提高劳动速率，可以实现高效率检测。(7)本发明的试剂盒所提供的2X扩增缓冲液，加入了扩增指示染料和高分子沉降剂，扩增后即可直接进行凝胶电泳，无需加入loading buffer，避免人为错误。
具体实施例方式本发明的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒，所述试剂盒可对ADHlB基因rsl229984SNP位点进行扩增分型检测，以外引物扩增产物为内参来检测扩增条件；2X缓冲包含SNP位点的野生型和突变型序列特异性引物、外侧序列上下游引物，通过扩增后DNA电泳条带的有无判断是否携带SNP位点的基因型表型；当其中野生型所对应的片段长度条带在扩增中得出阳性结果，突变型对应位置条带为阴性时判读为野生纯合型，相反为突变纯合型，野生型和突变型对应片段长度位置都出现阳性条带其结果为杂合型，通过DNA凝胶电泳综合分析确认受试者的基因型。所述检测ADHlB基因rsl229984SNP的引物碱基序列如下所示:F (外侧正向引物)AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCAR (外侧反向引物):GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAAM(突变型引物):AACCACGTGGTCATCTGTGCW (野生型引物):TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA本发明试剂盒的组分和含量包括:细胞裂解液，2 X扩增缓冲混合液，聚合酶，液体石蜡油。本试剂盒共40人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:全血基因组DNA的提取 取受检者外周静脉血300 μ 1，加入700 μ I细胞裂解液，颠倒混匀5次，12000rpm离心I分钟，倒去上清，并将离心管倒置在干净的吸水纸上停留2分钟，确保沉淀在管中，加Λ 300 μ I双蒸水，涡旋震荡混匀成细胞裂解悬液。步骤2 =PCR扩增反应配置反应体系:PCR管内加入细胞裂解悬液4.8 μ 1、加入5 μ I 2Χ扩增缓冲液和
0.2μ I聚合酶(2.5U/y I)混合构成独立的反应体系，加样后充分混匀，短暂离心，最后沿管壁轻轻加入20 μ I液体石蜡油封闭体系，具体见下表:
权利要求
1.一种检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在一个PCR反应中对ADHlB基因上rsl229984SNP位点进行分型。
2.根据权利要求1所述的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测ADHlB基因rsl229984SNP位点的外侧双向引物和2条双向序列特异性引物。
3.根据权利要求2所述的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述检测ADHlB基因rsl229984SNP的引物碱基序列如下所示: 外侧正向引物:AGGGTACAATACATGAGTGCCTGAATGCA 外侧反向引物:GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAA 突变型引物:AACCACGTGGTCATCTGTGC 野生型引物:TAGGTGGCTGTAGGAATCTGTCA。
4.一种权利要求1所述的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒所采用的检测方法，其特征在于，对受检样本DNA用扩增缓冲液进行扩增，扩增后经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，扩增片段由大到小依次是:内对照459bp，野生型产物337bp和突变产物164bp，根据条带的有无判断SNP位点的基因型。
5.一种采用权利要求1所述的检测乙醇脱氢酶IB基因多态性的试剂盒的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤: 预变性由I次循环构成，其条件为: 温度为94°C，时间为5分钟； PCR扩增由30次循环构成，其条件为: 变性:温度为94°C，时间为30秒； 退火:温度为56°C，时间为30秒； 延伸:温度为72°C，时间为90秒； 扩增结束后于4°C保存至电泳检测。
全文摘要
本发明公开了一种利用单管双向等位基因特异性扩增技术结合SNP敏感性分子开关技术检测乙醇脱氢酶1B基因多态性的试剂盒及其扩增方法和检测方法，所述试剂盒对乙醇脱氢酶1B上Arg47His(rs1229984)位点进行分型。所述试剂盒包含扩增缓冲液、聚合酶、细胞裂解液和甘油，可在一个PCR反应中完成对上述SNP位点的分型，从而了解受试者乙醇脱氢酶1B的基因型和其产物活性。
文档编号C12Q1/68GK103184267SQ20111044618
公开日2013年7月3日 申请日期2011年12月28日 优先权日2011年12月28日
发明者韩俊领, 杜宏伟, 周毓玲, 崔丽娟 申请人:协和干细胞基因工程有限公司, 天津滨海协和基因科技有限公司