专利名称：：嗜热长链烷醇醇脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种酶及其编码基因，特别涉及一种可以降解长链烷醇的醇脱氢酶及其编码基因。
背景技术：
：醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase,ADH，ECl.l丄l)，是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。该酶在生物催化、生物医学领域都有较为广泛的应用。在生物体内，很多醇类代谢都是通过醇脱氢酶催化完成的。在动物、植物、微生物、真核生物以及原核细菌中都己发现醇脱氢酶，至少有25个EC编号的酶被称为醇脱氢酶。醇脱氢酶来源广泛，种类繁多。目前已报道的可降解烷烃菌中的醇脱氢酶主要有以下三大类I型，Zi^+依赖的长链醇脱氢酶，每个亚基大约350个氨基酸残基；II型，短链醇脱氢酶，每个亚基含有250个氨基酸残基，如Bt-ADH;m型，Fe"依赖的醇脱氢酶，约38kDa大小(TomohisaKato等，JournalofBioscienceandBioengineering,2001.vol.91，No.l，100-102)。醇脱氢酶能够作用的底物种类繁多，包括乙醇在内的脂肪醇、芳香醇以及肉桂醇等。在醇脱氢酶研究方面，涉及的菌种有嗜热厌氧乙醇菌(T7zemo朋釘otetere&朋oi7cusJW200)、嗜热厌氧乙醇菌(T7zem2o朋aera6a"er"/2朋o/z'cm1ATCC31550)、极端嗜热菌(r/zermotoga/^/ogeasp.Nov)、牛分支杆菌(鄉co6acfen'wm6ov/sBCG)、酪酸梭状芽孢杆菌(C/o欲诚wm^，/cwmVPI1718);但研究最为清楚是酵母菌。酵母醇脱氢酶为四聚体，单个亚基肽链含347个氨基酸残基，亚基分子量35000。酵母醇脱氢酶对底物专一性强，对乙醇及其他直链伯醇活性较高，只对少数仲醇和侧链烷醇具有活性氨基酸残基序列的143283为辅酶结合区域，氨基酸残基序列的1142和284336为催化活性区域。辅酶和酶结合时酶构象发生变化，催化结构域旋转大约10。后转向辅酶结合结构域，后者旋转大约1.5°。两个结构域之间形成裂缝，两个结构域和裂缝组成一个腔袋，底物和辅酶就结合在中间形成的一个深腔袋中，腔袋一侧的侧链是疏水的，而另一侧侧链是亲水的，包含催化活性的Zn2+及其配位体(F.MarkDickinson等，Chemico-BiologicalInteractions130-132(2001)417-423;UedaM等，MethodsEnzymol.1990;188:171-5)。关于醇脱氢酶基因最新的专利和文献报道。如毛裕民等人报道了一种乙醇脱氢酶及其基因(第01126435.7号，申请日期2001.08.09);P.Hildebrandt等人报道了荧光假单胞菌(PseudomonasfluorescensDSM50106)的醇脱氢酶(ApplMicrobiolBiotechnol,59:483-487，2002);PeterJ.Holt等报道了嗜热厌氧乙醇菌(ThermoanaerobacterethanolicusJW200)的醇脱氢酶(FEMSMicrobiologyLetters,190:57-62，2000);Jean-MarcWilkin等人报道了牛分支杆菌(MycobacteriumbovisBCG)中的醇脱氢酶(Eur.J.Biochem，262:299-307，1999)。目前对微生物进行烷烃降解的功能和机制研究主要集中于假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、布劳氏菌属(Prauserella)、红球菌属(Rhodococcus)等七个种属的十几种菌株(P.Hildebrandt等，ApplMicrobiolBiotechnol,2002，59:483-487;PeterJ.Holt等，MicrobiologyLetters,2000，190:57-62;CelineRaynaud等，PNAS2003,April29:5010-5015;Jean-MarcWilkinl等，Eur.J.Biochem,1999,262:299-307;RyokoIwamoto等，ArchivesofBiochemistryandBiophysics,2002,398:203-212)，其烷烃降解途径中的各步反应的基因大多分散在基因组的不同位置，或在质粒中成簇排列(如PseudomonasputidaOCT质粒)。虽然对垸醇脱氢酶的研究报道较多，其作用的底物仍局限于中短链烷醇，尤其是乙醇和丁醇，以16C以上的烷醇为底物的醇脱氢酶还未见报道(AkioTani等，Appl.Environ.Microbiol,Dec.2000,p.5231-5235;Ishige，T.等，Appl.Environ.Microbiol.2000，66:3481-348;MESinger,JBacteriol.1985December;164(3):1017-1024;TKotani等，JBacteriol，Dec.2003，p:7120國7128;ChingT.Hou等,AppliedAndEnvironmentalMicrobiology,July1983,p.98-105;KesenMa等，JournalOfBacteriology,Feb.1999,p.1163-1170)。在石油烃降解途径中，长链烷醇脱氢酶是十分重要的关键酶，对该酶的研究为深入研究嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2降解长链烷烃代谢途径的机制提供了更有力的证据，也为探索其它烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础。同时，该酶的嗜热性及降解长链垸醇的能力具有重要的工业应用价值，可以应用于石油污染物和石油废水的处理过程和提高微生物石油采收率。因此有待于对长链醇脱氢酶进一步研究。
发明内容本发明的一个目的是提供一种基因，其能编码一种嗜热长链烷醇醇脱氢酶；本发明的另一目的是提供一种其可以降解长链烷醇(16C以上)的嗜热长链烷醇醇脱氢酶；本发明的另一目的是提供一种能表达嗜热长链烷醇醇脱氢酶的重组质粒；本发明的再一目的是提供一种能产生嗜热长链烷醇醇脱氢酶的重组菌。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案本发明提出一种编码嗜热长链垸醇醇脱氢酶的基因，其具有选自于a)、b)或C)的核苷酸序列a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:l但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的醇脱氢酶的核苷酸序列。在本发明的一个实施例中，上述编码嗜热长链烷醇醇脱氢酶的基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本发明提出一种嗜热长链垸醇醇脱氢酶，其具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；e)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有醇脱氢酶的活性。在本发明的一个实施例中，上述嗜热长链烷醇醇脱氢酶具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。本发明提出一种表达嗜热长链垸醇醇脱氢酶的重组质粒，其至少包括上述编码醇脱氢酶的基因。在本发明的一个实施例中，上述重组质粒的载体为pET-28a(+)。本发明提出一种产生嗜热长链垸醇醇脱氢酶的重组菌，该菌内导入了上述编码醇脱氢酶的基因。在本发明的一个实施例中，上述重组菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21菌株。本发明还提供了一种嗜热长链烷醇醇脱氢酶的应用，其特征在于该酶用于石油污染物和石油废水的处理过程中。本发明还提供了一种嗜热长链烷醇醇脱氢酶的应用，其特征在于该酶用于在石油开采的过程中，以提高微生物石油采收率。应当指出的是，上述提到的术语"严格条件"在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格条件可以是，相互之间的同源性不小于70%的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于90%的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0,7%SDS)中，5(TC预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0,7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，50'C杂交12hr;弃杂交液，加入洗膜液1(2xSSC和0.1°/。SDS)，5(TC洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(0.5xSSC和0.1%SDS)，50。C洗膜30min。所属
技术领域：
的技术人员应该知道，本发明的编码醇脱氢酶的DNA序列，还包括编码对SEQIDNO:1所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。另外，对本发明的醇脱氢酶基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质，也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有醇脱氢酶活性的蛋白质。上面使用的术语"多个"可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。和已知的醇脱氢酶相比，本发明提出的醇脱氢酶是一种新型的醇脱氢酶，通过对本发明提出的醇脱氢酶基因推导的氨基酸序列比较分析，本发明的醇脱氢酶与其它已报道的酶的氨基酸序列相比，绝大多数相似性均小于45%。相似性高于45%的醇脱氢酶都未做功能鉴定，主要来源于嗜热芽孢杆菌(BacilluskaustophilusHTA426)(YP—148778,1);地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisATCC14580)(YP—080422.1);蜡状芽孢杆菌(BacilluscereusG9241)(ZPJ)0239930);苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensisstr.AlHakam)(YP_896094);苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensisserovarkonkukianstr.97-Z7)(YP—037785.1);錯状芽f包杆菌(BacilluscereusATCC10987)(NP—980044.1);蜡状芽孢杆菌(BacilluscereusE33L)(YP—085061.1)。由此可见，本发明的醇脱氢酶与其它已报道的醇脱氢酶的氨基酸序列相比后，相似性大于45%的已发现菌株中，基本上都进行了序列比对的研究，没有发现对相应菌株的醇脱氢酶基因的功能进行鉴定的相关文献。通过酶的氨基酸序列相似性，该发明的醇脱氢酶属于in型，F^+依赖的醇脱氢酶。与现有技术相比，本发明采用上述技术方案的有益效果在于此外，本发明的醇脱氢酶不同于已报道的醇脱氢酶，经不同底物时酶活力检测，证明该酶具有耐高温降解长链烷醇的能力(大于16碳)。虽然该酶的最适底物是辛醇，但是对于十二醇至三十醇之间的长链醇具有一定的降解能力，最适反应温度为6(TC，具有很高的热稳定性，这正是其嗜热性的表现。长链烷烃的降解是由垸烃单加氧酶将烷烃羟化为长链垸醇，再由烷醇脱氢酶进一步脱氢为长链垸醛，再由全脱氢酶继续脱氢生成长链烷酸，在长链垸酸辅酶A连接酶作用下生成长链烷酸辅酶A后迸入三羧酸循环最终完全氧化为二氧化碳和水。在石油烃降解途径中，嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2中的长链烷醇脱氢酶是十分重要的关键酶，它能够耐高温并高效利用烷烃单加氧酶的催化产物长链烷醇，使其进一步脱氢，提高烷烃降解途径中的催化效率；另一方面，它有着比长链烷烃单加氧酶更广泛的底物范围，不仅能够催化长链烷醇，还对短链醇有很高的催化能力。因此，对长链烷醇脱氢酶的研究不仅有利于深入了解嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2降解长链垸烃途径的机制，为探索其它烷烃降解菌的代谢途径提供理论基础，对该酶构建高效表达工程菌株及大量纯化更具有广阔的工业应用前景和经济价值。基于本发明的长链烷醇醇脱氢酶的上述特性和功能，该酶可以在石油污染物和石油废水的处理中以及在提高微生物石油釆收率中广泛应用。一方面，该酶在高温下能降解长链烷醇，从而强化长链垸烃经过前述降解途径的反应，提高轻质烷烃与重质垸烃的比例、改善原油流动性等特性，有利于原油的开采，提高石油采收率；另一方面，该酶在高温下对长链烷烃的降解特性，对由油田开采、输油作业的跑漏、溢流所引起的环境石油污染物以及石油化工带来的高温石油废水的处理也具有良好的应用前景。图1为本发明实施例中的醇脱氢酶基因重组质粒的构建模式图。更新为清晰图表图2表示本发明醇脱氢酶SDS-PAGE电泳图图3表示本发明醇脱氢酶对不同底物的比活力图4表示本发明醇脱氢酶在不同温度下的比活力。图表使用黑色线条图5表示本发明醇脱氢酶在不同pH值下的比活力。图表使用黑色线条图6A和图6B表示本发明醇脱氢酶活力气相检测图具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。实施例一1.嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(CGMCCNo.1228)总DNA的提取研究证明，由嗜热脱氮芽孢杆菌(GeoZ)""7/wsAew2o<5femYn;/c"ra)NG80國2基因组能够分离出编码醇脱氢酶的基因。因此，在本实施例中，采用从中国天津大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮芽孢杆菌NG80-2(其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.1228，保藏日期为2004年10月09日，已申请国内发明专利并获得授权，发明名称嗜热脱氮芽孢杆菌及其筛选和应用，专利号ZL200410072759.7)，取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250微升50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入10微升0.4MEDTA(pH8.0)，混匀后37。C保温20min，之后加入30微升20mg/ml溶菌酶，混匀后37"C再保温20min，再加入5微升20mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20微升10%SDS，5(TC保温至溶液澄清，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提两次，氯仿:异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100微升TE缓冲液(pH8.0,10mMTris，lmMEDTA)，加入10mg/mlRNase2微升，65X:保温30min，分别用酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次，上清液加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50微升TE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=1.95，A260=0.73。2.本发明醇脱氢酶基因的克隆和筛选取前面所述的总DNA溶液0.5微升(约10ng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行20个循环PCR。设定的PCR循环参数如下95。C，5min;95°C，30s;50°C，45s;72°C，2min;72°C，5min;4°C，2hr引物序列如下上游引物5，-CGGAATTCATGCAAAATTTTACGTTTCGCA-3，；下游引物5，-ACGCGTCGACTTATAAAGACGCACGCAAAATG國3'，上述PCR产物用￡coRI和双酶切，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收l.lkb酶切产物片断。与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a后，涂于含50pg/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37。C培养12小时，挑取单克隆转接到20mlLB培养基中进行培养(50jxg/mlKan)，37。C培养12小时后，提取质粒鉴定，插入有SEQIDNO:1的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1168(见图1)，将重组质粒pLW1168转入表达宿主大肠杆菌BL21(该菌株可向天津开发区厚普生物技术开发有限公司订购,货号为69387-3)中，得到含有该重组质粒的重组菌株为H1454,此重组质粒pLW1168可高频转化大肠杆菌BL21表达醇脱氢酶活性和抗卡那霉素性能。采用Sanger法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入片段含有一个长1161bp的开放阅读框架，编码一个由387个氨基酸组成的蛋白质。实施例二醇脱氢酶的纯化和特性将上述重组菌H1454单克隆接入20ml含50ug/mlKan的LB培养基中，37°C，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按l。/。(v/v)接种量接入200ml含50ug/mlKan的LB培养基(共10个摇瓶)，37°C，220rpm/min培养OD600为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.lmM，45°C，180rpm/min诱导2.5小时。离心收集菌体，悬于含50mMTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为醇脱氢酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带(见图2)。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此醇脱氢酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为45000道尔顿，与理论上推算的分子量(42800道尔顿)相似；等电点沉淀法测得的重组酶的等电点pl为5.18。该醇脱氢酶对C15C30的长链醇均有作用。实施例三1.测定本发明醇脱氢酶不同底物时的比活力对上述实施例二中制得的醇脱氢酶进行不同底物的测定，具体方法为配制200pl反应体系，辅酶NAD+的终浓度为lmM，分别加入lmM甲醇、乙醇、丁醇、己醇、辛醇、癸醇、十二醇、十四醇、十六醇、十八醇、二十醇、二十四醇、二十八醇、三十醇中的底物，一定浓度的醇脱氢酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl补至200pl。混匀，在60。C水浴中反应10分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。用l:l的三氯甲烷萃取，然后在340nm处测定光吸收。以每分钟生成lpmolNADH所需酶量定义为l个酶活力单位。测定结果参见图3，从该表中可以看出，该醇脱氢酶的最适底物是辛醇。2.测定本发明醇脱氢酶在不同温度下的比活力对上述实施例二中制得的醇脱氢酶进行最适反应温度的测定，具体方法为配制200iil反应体系，底物辛醇的终浓度为100mM，辅酶NAD+的终浓度为lmM，一定浓度的醇脱氢酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl补至200nl。混匀，分别于45。C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75。C水浴中反应10分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。用l:l的三氯甲烷萃取，然后在340nm处测定光吸收。测定结果参见图4。从该图中可以看出，该醇脱氢酶的最适反应温度约为6(TC。3.测定本发明醇脱氢酶在不同pH下的比活力对上述实施例二中制得的醇脱氢酶进行最适pH值的测定，具体方法为.-配制20(Hil反应体系，底物辛醇的终浓度为100mM，辅酶NAD+的终浓度为lmM，一定浓度的醇脱氢酶，分别用pH6.0、pH6.5、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0的缓冲液(配方见表l)补至200pl。混匀，在60。C水浴中反应10分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。用l:l的三氯甲烷萃取，然后在340nm处测定光吸收。测定结果参见图5，从该图中可以看出，该醇脱氢酶的最适pH值约为8.0。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.测定本发明醇脱氢酶受不同离子的影响对上述实施例二中制得的醇脱氢酶进行不同离子影响的测定，具体方法为配制200pl反应体系，底物辛醇的终浓度为100mM，辅酶NAD+的终浓度为lmM，分别加入FeCl2、FeS04、CuS04、MgCl2、CoCl2、ZnS04、MnCl2、A1C13、CaCl2、NiCl2、NaCl、KC1、EDTA至lmM或SDS至0.050/0，一定浓度的醇脱氢酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl补至200(xl。混匀，在60。C水浴中反应10分钟，反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。用l:l的三氯甲烷萃取，然后在340nm处测定光吸收。以每分钟生成lpmolNADH所需酶量定义为l个酶活力单位，测定结果参见表2。表2不同离子对该醇脱氢酶活力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5.本发明醇脱氢酶活力的气相检测对上述实施例二中制得的醇脱氢酶进行气相测定，具体方法为配制lml反应体系，底物十六醇的终浓度为0.5mM，表面活性剂与底物的w/w比为6%。辅酶NAD+的终浓度为lmM，一定浓度的醇脱氢酶，用50mMpH8.0的Tris-HCl补至lml。混匀，6(TC下反应一定的时间。反应结束后，冰浴5分钟，终止反应。加入含有十五烷作为内标的正己烷萃取，用agilent6820气相色谱仪系统测定反应底物的减少。测定结果参见图6A和图6B，从该图中可以看出，随反应时间延长，底物不断减少。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
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的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围所做的更动与改进，都将落入本发明的保护范围。序列表〈110〉南开大学〈120〉嗜热长链烷醇醇脱氢酶及其编码基因与应用〈130〉7P13005-CN<160〉1〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉1164<212〉DNA〈213〉编码醇脱氢酶的核苷酸序列〈400〉1atgcaaaattttacgtttcgcaatccgaccaaactcatttttgggagaggaca犯ttgag60cagctc犯3g33gMgtgccgs犯tatggc犯3犯agtgctgcttgtctstgggggcggc120agcatt犯acgaaacggactatetgatgaagtcatgagcctattgax:ggacattggcgcc180gaagtcgttgaactgccaggcgtcgaaccg犯cccgcgcctttcgaccgtc犯犯aaggg240gt卿catttgcagacgggaaggaattgaatttttgcttgccgttggcggcggcagtgtg300atcgactgtacgaaagcgattgcagccggcgcg犯gtttgatggcgatccgtgggagttc360attacgaaaaaagcgactgtcactgaggcgttgccgtttgggacggtcctgacgctggca420gcgaccggctcgg犯stg犯cgccggatcggtgatcaccaattggg3g3cg犯Etga犯犯480tacggctggggcagcccggtgacattcccgcaattttcgattttggatccgacgtacacg540atgacggtgccgaaagaccataccgtttacggcatcgtcgatatgatgtcccatgtgttt600gagc组atttccatcatacgccgaacacgccgctgc肌gaccggatgtgcgaggcagtg660ttaaaaacggtcattgaggcggcgccaa犯ttggttgacgacttagagaactacgagctg720cgcg卿cgatcatgtactcgggcacgatcgccttaaacggctttttgcaaatgggcgtg780cgcggtgattgggcgacgcatgatatcgagcatgcggtctctgctgtatacgatatcccg,cacgccgggggattggccattttgttcccgaattggatgaaacatgtgcttgatgaaaat900gtcagccgtttcgcccaactggcggtgcgcgtctttgacgtcgatccgacgggc冊犯cg,gagcgcgacgtggcgcttgagggcatcgagcggttgcgcgcgttttggtcgagcctcggg1020gcgccgtctcgattggctgattatggcatcggcgaggaaaatctcgagctgatggcggat1080aaagcgatggcgtttggtgagtttggccgtttcaaaacgttaBa/tcgtgatgatgtgctc1140gccattttgcgtgcgtctttataa<210>2<211>387<212>PRT<213〉醇脱氢酶的氨基酸序列<400〉2MetGinAsnPheThrPheArgAsnProThrLysLeuliePheGlyArg151015GlyGinlieGluGinLeuLysGluGluValProLysTyrGlyLysLys202530ValLeuLeuValTyrGlyGlyGlySerlieLysArgAsnGlyLeuTyr354045AspGluValMetSerLeuLeuThrAsplieGlyAlaGluValValGlu505560LeuProGlyValGluProAsnProArgLeuSerThrValLysLysGly65707580ValAsplieCysArgArgGluGlylieGluPheLeuLeuAlaValGly859095GlyGlySerVallieAspCysThrLysAlalieAlaAlaGlyAlaLys100105110PheA印GlyAspProTrpGluPhelieThrLysLysAlaThrValThr115120125GluAlaLeuProPheGlyThrValLeuThrLeuAlaAlaThrGlySer130135140GluMetAsnAlaGlySerVallieThrAsnTrpGluThrLysGluLys145150155160TyrGlyTrpGlySerProValThrPheProGinPheSerlieLeuAsp165170175ProThrTyrThrMetThrValProLysA印HisThrValTyrGlylie180185190ValAspMetMetSerHisValPheGluGinTyrPheHisHisThrPro195200205AsnThrProLeuGinAspArgMetCysGluAlaValLeuLysThrVal210215220lieGluAlaAlaProLysLeuValAspAspLeuGluAsnTyrGluLeu225230235240ArgGluThrlieMetTyrSerGlyThrlieAlaLeuAsnGlyPheLeu245250255GinMetGlyValArgGlyAspTrpAlaThrHisA印lieGluHisAla1164260265270ValSerAlaValTyrA印lieProHisAlaGlyGlyLeuAlalieLeu275280285PheProAsnTrpMetLysHisValLeuAspGluAsnValSerArgPhe290295300AlaGinLeuAlaValArgValPheAspValAspProThrGlyLysThr305310315320GluArgAspValAlaLeuGluGlylieGluArgLeuArgAlaPheTrp325330335SerSerLeuGlyAlaProSerArgLeuAlaAspTyrGlylieGlyGlu340345350GluAsnLeuGluLeuMetAlaAspLysAlaMetAlaPheGlyGluPhe355360365GlyArgPheLysThrLeuAsnArgAspAspValLeuAlalieLeuArg370375380AlaSerLeu38权利要求1、编码嗜热长链烷醇醇脱氢酶的基因，其特征在于，该基因具有选自于a)、b)或c)的核苷酸序列a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；b)不同于SEQIDNO:1但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的醇脱氢酶的核苷酸序列。2、根据权利要求1所述的嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于，具有选自于下列d)、e)或f)的氨基酸序列d)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；e)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；f)上述e)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有醇脱氢酶的活性。3、根据权利要求2所述嗜热长链垸醇醇脱氢酶，其特征在于，所述醇脱氢酶具有与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少70%的同源性，同时具有该序列的蛋白质有醇脱氢酶的活性。4、根据权利要求3所述嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于，所述醇脱氢酶具有与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列至少90%的同源性，同时具有该序列的蛋白质有醇脱氢酶的活性。5、根据权利要求2所述嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于，所述具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-100个。6、根据权利要求5所述嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于，所述具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-10个。7、根据权利要求2所述嗜热长链烷醇醇脱氢酶，其特征在于，所述醇脱氢酶属于III型，F^+依赖的醇脱氢酶。8、一种表达嗜热长链烷醇醇脱氢酶的重组质粒，其特征在于，其至少包括权利要求1所述编码醇脱氢酶的基因。9、根据权利要求8所述的一种表达嗜热长链烷醇醇脱氢酶的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET-28a(+)。10、一种产生权利要求2所述的嗜热长链垸醇醇脱氢酶的重组菌，其特征在于，该重组菌内导入了权利要求1所述的编码醇脱氢酶的基因。11、根据权利要求10所述的一种产生嗜热长链烷醇醇脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌为大肠杆菌。12、根据权利要求11所述的一种产生嗜热长链烷醇醇脱氢酶的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株。13、权利要求2至7任一项所述的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的应用，其特征在于该酶用于石油污染物和石油废水的处理过程中。14、权利要求2至7任一项所述的嗜热长链烷醇醇脱氢酶的应用，其特征在于该酶用于在石油开采的过程中，以提高微生物石油采收率。全文摘要本发明涉及一种酶及其编码基因，特别涉及一种可以降解长链烷醇的醇脱氢酶及其编码基因。本发明的公开了一种基因，其能编码一种醇脱氢酶；这种醇脱氢酶可以降解长链烷醇的醇脱氢酶；并提供了为种能表达醇脱氢酶的重组质粒；和能产生醇脱氢酶的重组菌。该酶具有降解大于16碳的长链烷醇的能力，可广泛作用于C12～C30之间的长链醇，最适底物是辛醇。文档编号C09K8/582GK101381735SQ200710149540公开日2009年3月11日申请日期2007年9月6日优先权日2007年9月6日发明者露冯,刘雪倩,磊王申请人:南开大学