醇脱氢酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶及酶工程领域，具体而言，涉及一种醇脱氢酶突变体及其应用。
【背景技术】
[0002] 酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工 业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须 借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概 括为三种：理性设计（rationaldesign)、非理性设计（irrationaldesign)和半理性设计 (semi-rationaldesign)〇
[0003] 理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变（Site-directed Mutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这 种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、 改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。
[0004] 定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又 结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因 进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅 是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构一功能关系研宄的重要手段。研宄表 明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获 得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特 之处。
[0005] 醇脱氢酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作 用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，醇脱氢酶通常作为一种非常重要的生物催 化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。如一种新的用于艾滋病治疗的非肽类抗 逆转病毒蛋白酶抑制剂地瑞那韦Oarunavir)。
[0006] 目前已知的醇脱氢酶可以作为生物催化剂，一步还原酮类底物，制备得到近乎单 一光学纯度的手性中间体（31?，345,641〇-六氢呋喃并[2,3-8]呋喃-3-醇，简化了合成步 骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如催化 反应后产生的非对映异构体含量较高、酶催化活性较低等。
[0007] 因此，仍需要对现有的醇脱氢酶进行改进，以提高其催化活性、底物特异性和/或 稳定性，进而改善现有技术中如立体选择性较低、后处理过程繁琐、生产成本高等问题。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供一种醇脱氢酶突变体及其应用，以提高其催化活性和立体选择 性。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种醇脱氢酶突变体，该醇脱 氢酶突变体的氨基酸序列是SEQIDNO:9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突 变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：：第40位、第87位、第194位和第331位，且 第40位的T突变为S、A或C;第87位的W突变为F、Y或H;第194位的V突变为I、L或E; 第331位的R突变为A、K或M;或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸 序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。
[0010] 进一步地，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQID NO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 或SEQIDNO:7 所示的氨基酸序列；或者 醇脱氢酶突变体的氨基酸序列与SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、 SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性。 [0011] 根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种醇脱氢 酶突变体。
[0012] 进一步地，DNA分子的序列为SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQ IDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16 或SEQIDN0:17;或者DNA分子的序列与SEQID N0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16 或SEQ IDNO: 17具有95%以上的同源性。
[0013] 根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种DNA分 子的序列。
【主权项】
1. 一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO :9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸序列具有如下至少1 个突变位点：：第40位、第87位、第194位和第331位，且所述第40位的T突变为S、A或 C ;第87位的W突变为F、Y或H ;第194位的V突变为I、L或E ;第331位的R突变为A、K或 M ;或者，所述醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变 位点，且是与所述发生突变的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体的氨基 酸序列为 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列；或者 所述醇脱氢酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6或SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列具有95%以上的 同源性。
3. -种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1或2中所述的醇脱氢酶突 变体。
4. 根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的序列为SEQ ID NO : 11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16 或 SEQ ID NO :17 ;或者 所述 DNA 分子的序列与 SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO :16 或 SEQ ID NO :17 具有 95% 以上的同源性。
5. -种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求3或4所述的DNA分子的序 列。
6. 根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22b(+)、 pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-1Ia(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、 pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、 pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、 pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、 pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、 pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-l、 pGEX-6p-l、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwinl、pEZZ18、pKK232-18、 pUC-18 或 pUC-19。
7. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5或6所述的重组质粒。
8. 根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或 真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5 α感受态细胞。
9. 一种生产醇类化合物的方法，包括醇脱氢酶对酮类化合物进行催化加氢以形成醇类 化合物的反应步骤，其特征在于，所述醇脱氢酶为权利要求1或2所述的醇脱氢酶突变体。
10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为通式I所示的酮类化 合物：
其中，Rl选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环 基、环状杂焼基或环状杂焼化焼基；R2选自焼基、环焼基、齒焼基或齒环焼基D
【专利摘要】本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及其应用。该脱氢酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少1个突变位点：第40位、第87位、第194位和第331位，且第40位的T突变为S、A或C；第87位的W突变为F、Y或H；第194位的V突变为I、L或E；第331位的R突变为A、K或M；或者，醇脱氢酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。具有上述至少一个突变位点或者保留上述突变位点且与其具有90％以上氨基酸序列同源性的醇脱氢酶突变体，其立体选择性和酶活性大大提高。
【IPC分类】C12P7-62, C12N1-21, C12N15-70, C12P17-18, C12N15-53, C12N9-04
【公开号】CN104531628
【申请号】CN201410814234
【发明人】洪浩, 詹姆斯·盖吉, 高峰, 刘立辉, 刘芳, 于文燕, 崔瑜霞, 唐芳荣, 张娜
【申请人】凯莱英医药集团（天津）股份有限公司, 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司, 天津凯莱英制药有限公司, 凯莱英医药化学（阜新）技术有限公司, 吉林凯莱英医药化学有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月23日