小麦肉桂醇脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：小麦肉桂醇脱氢酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肉桂醇脱氢酶及其编码基因与应用，特别涉及一种来自于小麦的肉桂醇脱氢酶及其编码基因与其在培育抗倒伏植物中的应用。
背景技术：
：在包括蕨类、裸子植物和被子植物在内的维管植物中，木质素的出现对于植物向陆生进化具有重要作用，它使植物能够适应比较干燥的外界环境，并向更大的空间发展，从而形成了更为多样化的植物类群(Peter，G.andNeale，D.，2004，CurrentOpinioninPlantBiology7:737-742)。木质素的合成对于植物的生长发育也具有重要作用。木质素主要沉积在植物的导管、射线、厚壁细胞等的细胞壁上，能够增加细胞壁的机械强度，降低其通透性，因此，木质素的合成增强了植物的机械支持作用。在植物受伤和受到病虫害侵袭时，植物细胞能够迅速木质化以有效地保护其内部组织免受进一步的危害，因此增强了植物对于外界机械损伤和病虫害侵袭的抵抗力(Boerjan,W.，Ralph,J.,Baucher，M.，2003.A画.Rev,PlantBiol.,54:519-546.)。木质素属高分子有机酚类化合物，在地球上所有高分子有机化合物中，其含量居纤维素之后，居第二位。在植物体中通常占干重的10-20%，在树木中甚至可达30%。木质素生物合成是以苯丙氨酸为前体，经过一系列酶促反应，形成几种简单酚类的醇衍生物，被称为木质素单体(monolignol)，再由这些木质素单体聚合形成高分子木质素。构成木质素的单体主要有三类，即香豆醇(rcoumarylalcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和丁香醇(sinapylalcohol)。这三类化合物在结构上的区别是甲氧基的数量。不同种类的植物其木质素在组成上有明显的区别。裸子植物的木质素主要由松柏醇组成，双子叶植物的木质素由松柏醇和丁香醇组成，而单子叶植物的木质素则包括香豆醇、松柏醇和丁香醇等三种单体。此外，植物在不同的发育时期、不同的环境条件以及不同的部位，其木质素的组成也有明显的差异。木质素的生物合成反应涉及如下几个基本过程(1)苯丙氨酸经过氨解作用3形成肉桂酸(苯丙稀酸，cinnamicacid)，(2)羟基化和转甲基，在苯环的不同部位形成羟基和甲氧基，(3)已酰化，即在羧基侧链已酰化，(4)还原反应，使羧基侧链经过醛基最后形成醇(Zhan-BinLin，Qing-HuMa，YangXu，2003.ProgressinNaturalScience,13:321-328)。肉桂醇脱氢酶(cinnamylalcoholdehydrogenase,CAD，EC1.1.1.195)负责催化木质素合成的最后一步的氧化还原反应，即将各种醛类还原形成三种醇类包括香豆醇、松柏醇和丁香醇，这三种醇类既是木质素单体，再由这些木质素单体聚合形成高分子木质素。肉桂醇脱氢酶决定了植物体木质素合成的量和不同单体组成，是木质素合成反应中具有控制作用的关键酶。从20世纪70年代起，就有研究人员在连翘(Gross,GG等，1973，FEBSLett.31:283-286)和柳树(Mansell，RL等，1974，Phytochemistry13:2427-2435)等植物中报道过肉桂醇脱氢酶的活性，进一步从大豆(Wyrambik，D等，1975，EurJBiochem59:9-15)、烟草(Halpin，C等，1992，PlantPhysiol98:12-16)、桉树(Goffner，D等，1992，Planta188:48-53)、火炬松(0，Malley，DM等，1992，PlantPhysiol98:1364-1371)，云衫(Galliano,H等，1993，Phytochemistry32:557-563)、土当归(Hibino，T等，1993，Phytochemistry32:565-567)和菜豆(JacquelineGrima-Pettenati，J等，1994,Phytochemistry37:941-947)中得到了纯化的酶蛋白，对其生化特点的初步妍究证明它属于NADP类氧化还原酶。在此基础上，相关的肉桂醇脱氢酶的基因已经从烟草(Knight,ME等，1992，PlantMol.Biol.19:793-801)、桉树(Grima-Pettenati，J等，1993，PlantMol.Biol.21:1085-1095)、土当归(Hibino，T等，1993，PlantCellPhysiol.34:659-665)、杨树和苜蓿(VanDoorsselaere，J等，1995，PlantPhysiol.Biochem.33:105-109)、火炬松(0'Malley,DM等，1992，PlantPhysiol.98:1364-1371)、拟南芥(Kim,SJ等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:1455-1460)和百日草(Sato,Y等，1997，PlantPhysiol.113:425-430)中分离出来。在玉米(Halpin，C等,1998，PlantJ.14:545-553)、火炬松(MacKay，JJ等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:8255-8260)和拟南芥(Sibout，R等，2003，PlantPhysiol.132:848-860)中还鉴定出相关的突变体。在不同植物的基因组中，CAD具有不同的拷贝，其表达主要在根、茎等正在形成的木质化组织，与植物木质素的合成和组织的木质化密切相关，并进一步影响到病虫害的侵袭和抗逆境反应等相关的生理过程。人们利用模式植物烟草进行了转基因实验。结果表明，通过反义抑制使转基因烟草中肉桂醇脱氢酶的活性降低到正常植物的40%以下，则转基因烟草中的木质素组成发生明显的变化，其中，丁香醇含量明显减少，丁香醇/松柏醇的比值降低，烟草茎组织出现棕红色变，而烟草的生长和发育基本正常(Ralph，J等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:12803-12808)。在转基因杨树中，抑制肉桂醇脱氢酶的活性能明显改变树木的木质化过程，改善其在制浆造纸中的污染(Pilate，G等，2002，Nat.Biotechnol.20:607-612)，这证明CAD作为木质素合成的关键酶基因，在控制植物茎的木质化和相关的生理过程中具有重要作用，因而可在植物基因工程
技术领域：
中具有广泛的应用潜力。虽然肉桂醇脱氢酶具有重要的作用，但是对小麦(7>i"c,ae^jV^L.)肉桂醇脱氢酶基因的分离和鉴定工作，目前尚未有报道。无论在中国还是在世界范围内，小麦都是最重要的农作物之一。在生产实践中，由于小麦茎杆机械强度不足引起的倒伏可使产量损失20%以上。此外，由于病虫害侵袭所造成的损失也十分巨大。
发明内容本发明的目的在于提供一种肉桂醇脱氢酶。本发明提供的肉桂醇脱氢酶，命名为Ta-CADl，来源于禾本科的小麦，是如下a)或b)的蛋白:a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肉桂醇脱氢酶作用的由a)衍生的蛋白质。序列表2为肉桂醇脱氢酶的氨基酸序列，包括360个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占126个，亲水氨基酸占78个，碱性氨基酸占36个，酸性氨基酸占43个，该蛋白质的分子量为38.6KEi，等电点为5.9。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。为了使l)中的Ta-CAD1便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l所示的标签。表l.标签的序列标签序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述2)中的Ta-CADl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的Ta-CADI的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端第88到1170位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。本发明的另一目的在于提供编码肉桂醇脱氢酶的cDNA，命名为7s-6^7，也在本发明的保护范围内。肉桂醇脱氢酶的cDNA具体可为如下l)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中的序列l的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的自5'末端第88到1170位脱氧核糖核苷酸杂交且编码与植物抗倒伏相关的肉桂醇脱氢酶；3)与序列表中的序列1的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码与植物抗倒伏相关的肉桂醇脱氢酶。序列表l为编码小麦肉桂醇脱氢酶基因的全长cDNA，命名为7^-^/77。该序列共由1311个碱基组成，其中，5'端未翻译区包括87个碱基，3'端未翻译区包括141个碱基(其中包括15个碱基组成的PolyA)，编码区由1083个碱基(从88位到1170位)组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的Ta-CADl蛋白，编码区中，A占18.74%(203个)，C占30.84%(334个)，G占35.27%(382个)，T占15.14%(164个)，A+T占33.890/0(367个)，C+G占66.11%(716个)。在国际基因序列数据库(GenBanlAEMBIADDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-CAD1基因是小麦中未曾报道的新基因，它与从桉树(^c^j^fiAS^;/Mj7)、杨树(尸。jWl/w51tric/ocsipa)、火炬松W加staecfe)、烟草(WcotJ'朋sz^Asc湖)、土当归(Arah'ac。rt/at3)、苜蓿(i/Wc堪o5vs"ra)、拟南芥(AraWc1p57'5^3h'a朋)和百日草(力'/2/7J'se7e^3/Ls)中分离出的肉桂醇脱氢酶基因具有同源性。所述的高严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS)中，65。C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65'C杂交12hr;弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5%SDS)，65'C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1%SDS)，65。C洗膜30min。扩增上述7^-C4"7基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。含有7^-C4Z7基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有C4Z7基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pC細IA2301、pC細IA1301-UbiN、pBY505或其它衍生植物表达载体。使用7^-C4"7基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述重组表达载体的物理图谱可如图1和图2所示。上述重组表达载体可以是原核表达载体，如大肠杆菌表达载体，也可以是真核表达载体，如植物表达载体。本发明的另一目的在于提供与植物抗倒伏相关的肉桂醇脱氢酶的编码基因(7^-G4"7基因)在培育抗倒伏植物的应用。本发明的又一目的在于提供培育抗倒伏植物的方法，是将所述^Z/基因导7入植物中，得到抗倒伏的植物。所述dW基因通过上述重组表达载体导入植物中。携带有本发明的与植物抗倒伏相关的肉桂醇脱氢酶的7^-C4"7基因的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。当然，7^-C^7基因在培育抗倒伏的转基因植株的应用也可通过有性杂交方法，将fa-C4W基因转移到现有的植物生产品种中。被转化的植物宿主可以禾本科植物，具体可为小麦。将本发明的7^-C4AT基因导入大肠杆菌中，表达的蛋白质以松柏醛(Coniferaldehyde)为底物，其酶活性为94.49nmol/sec/mg，表明7a-6^Z^基因所编码的蛋白质具有肉桂醇脱氢酶的催化活性，可以催化合成松柏醇等木质素单体，因而能够控制小麦中的木质素合成。另外，对易倒伏(C6001)(沧州市农科院)和抗倒伏(H4564)(邯郸市农科院)小麦品种的不同发育时期的茎(从拔节期到乳熟期)中的7^-C^7基因进行Northern杂交，以检测该基因在不同品种中的表达量，结果发现茎的生长后期抗倒伏品种中的表达量明显高于易倒伏品种，而这一时期正是小麦需要更强的机械支持并容易发生倒伏的时候。此结果表明C^7基因不仅控制着小麦木质素的合成，而且与小麦茎的抗倒伏特性密切相关，控制7^-6^^基因的表达就能控制小麦的抗倒伏性状。因此，在植物茎组织中过量表达这种蛋白质及其基因，可以明显增强茎倒伏的能力，所以7^-C4Z/基因和其表达的蛋白质在禾本科作物的抗性育种方面具有重要意义。图l:表示T3-C4"7基因表达质粒；图2:表示7a-C4Z7基像游潜激表这载沐,.图3:小麦组织中7^-C^7基因表达产物的检测结果图。具体实施例方式实施例一、小麦中肉桂醇脱氢酶基因探针的分离及序列分析将小麦(T^'z^cMaesh'w加L，品种为H4564,河北省邯郸市种子公司)种植于温室中，正常浇水和施肥，至生长到2-3个节间，采集根、茎、叶组织，用TRI试剂(MolecularResearchCenter,Inc，Cincinnati,USA)提取总RNA，用PolyATtractmRNAIsolation试齐憶(P扁ega公司，Madison,USA)分离Poly(A)+RNA。反转录合成cDNA第一条链的条件为Poly(A)+RNAlug，5ymol/L引物5，-GACTCGAGTCGACATCGA(Th厂3，，0.5mmol/LdNTP，50单位RNasin，65。C保温10分钟，在冰上冷却后，加入200USuperscriptIIRNaseH—ReverseTranscriptase(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)，42。C保温1小时，加EDTA至终浓度10mM，并于95°C保温10分钟，在冰上冷却。第一轮PCR的引物为Dl:5，-TGyGGnrTnTGyCAydsnG-3'(其中y=C或T，r二A或G，s:C或G，d^A或G或T，r^A或C或G或T)，D2:5'-GACTCGAGTCGACATCG-3'条件为3uLcDNA反应液，luraol/L引物，0.4腿ol/LdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)，于95。C变性5分钟，50。C复性2分钟，72°C延伸40分钟，然后进行40个循环(95°C1分钟，55°C1分钟，72°C3分钟)，最后72'C延伸10分钟。第二轮PCR引物为D3:5-TAyCCnvTnrTnCCnGGnCAyCG-3'(其中y=C或T，r二A或G，v二A或C或G，『A或C或G或T)，D4:5-ACrAAnCkrTAnyknACrTC'-3，(其中y=C或T，r=A或G，k=G或T，n=A或C或G或T)，条件为使用1WL第一轮PCR反应液，于95。C变性5分钟，其它反应同第一轮。PCR产物经l.Oo/o琼脂糖凝胶电泳，采用Glass醒⑧DNAIsolation试剂盒(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)纯化电泳产物。纯化后连接在pGEM-TEasy载体上(Promega公司，Madison，USA)。连接条件为16°C12小时。转化受体菌为￡coh'DH5a，感受态细胞的制备采用CaCL处理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecularcloning:Alaboratorym肌ual，2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989)。将连接产物加入到感受态细胞中，冰浴30分钟，42t:热激90秒，加入LB液体培养基，37°C保温45分钟，涂布在含氨节青霉素(100ug/ml和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37。C培养过夜。白色克隆接种于LB液体培养基上(含氨苄青霉素100ug/ml)，37t:培养过夜，选择正常生长的菌体，提取质粒，进行酶切分析后，以ABI377DNA序列分析仪进行序列分析，确定小麦的肉桂醇脱氢酶基因探针。序列分析的结果表明，所分离的探针具有885个核苷酸，与烟草0Vico"朋sf3Z^c咖)和苜蓿(i/eo7c^"os^ira)中分离出的肉桂醇脱氢酶基因具有同源性。实施例二、小麦肉桂醇脱氢酶基因的筛选和序列分析以小麦茎Poly(A)+RNA为模板，以ZAP载体(Stratagene公司，Lajolla，CA，USA)合成cDNA，经过体外包装，构建成小麦茎的cDNA文库。取50ng探针DNA，加50uCi32P-dCTP进行标记，37。C保温l小时，加EDTA至终浓度10mM终止反应。探针通过S印hadexG-50柱后，于IO(TC煮沸10分钟，立即在冰上冷却，进行杂交。取50000pfu铺平板，并将其转移到硝酸纤维素膜上，于0.5MNa0H加1.5MNaCl变性2分钟，1.5MNaCl加0.5MTris-HCl(pH8.0)复性5分钟，0.2MTris-HC1(pH7.5)加2xSSC漂洗30秒，将膜夹在两层Whatman滤纸中，80。C真空烘烤2小时，之后加入杂交液(6xSSC，5xDenhardt，0.5%SDS，100ug/mL鱼精DNA，50%甲酰胺)，42"保温2小时，加入标记的探针，42。C杂交过夜，经过6xSSC加0.1%SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1xSSC加0.1%SDS于65。C洗两次，每次20分钟，之后于-8(TC下放射自显影，确定阳性克隆后，将噬菌斑取下，于SM溶液(Stratagene公司)中4"提取过夜，再按同样的程序进行两轮筛选。对于获得的阳性噬菌斑，将分离出的基因命名为插入到载体pBluescriptIISK(Stratagene公司，LaJolla，CA92037，USA)EcoRI—Xhol位点，将转化后的质粒命名为plTa-CAD1，经过酶切分析后，采用ABI377DNA序列分析仪进行序列分析。测得的的DNA序列如序列表中序列1所示，是小麦中肉桂醇脱氢酶基因。该序列共由1311个碱基组成，其中，5'端未翻译区包括87个碱基，3'端未翻译区包括141个碱基(其中包括15个碱基组成的PolyA)，编码区由1083个碱基(从88位到1170位)组成，其中A占18.74%(203个)，C占30.84%(334个)，G占35.27%(382个)，T占15.14%(164个)，A+T占33.89%(367个)，C+G占66.11%(716个)。在国际基因序列数据库(GenBanlAEMBlADDBJ)中的基因同源性分析表明，化-C4Z^基因是小麦中未曾报道的新基因，它与从桉树(&ca7yp"s^//wii)、杨树(尸opwJiA^rz'c力ocar;a)、火炬松(尸i"wstaeofe)、烟草0V/co"a/7<3taZac〃/z)、土当归(Ara7j.ac。ro^ts)、苜蓿(i/eo^.c財。sa"ra)、拟南芥(Ara&Wopw\s和百日草(力'"w'ae7ega/Ls)中分离出的肉桂醇脱氢酶基因具有同源性。10实施例三、小麦肉桂醇脱氢酶基因编码蛋白质的翻译人工合成一对引物，并分别引入EcoRI及NotI酶切位点，引物如下5'—引物5'—CGGAATTCATGGGCAGCGTCGACGCCTC—3，，3，-引物5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGCGGCGTCCTCGATG-3，。以实施例2所述的plTa-CAD1为模板，进行PCR扩增，扩增条件10ngDNA，lumol/L弓l物，0.4mraol/LdNTP，2.5UTaqDNA聚合酶(Gibco公司，GrandIsland,NY，USA)。于95。C变性5分钟，然后进行30个循环(95°C1分钟，55°C1分钟，72°C1.5分钟)，最后72。C延伸10分钟。PCR产物经l.O%琼脂糖凝胶电泳，采用61&551^乂DNAIsolation试剂盒(Gibco公司，GrandIsland,NY,USA)纯化电泳产物，用EcoRI及Notl双酶切后，连接在载体pET-28a(NovagenCompany,USA;CatNo.69872-3)的相应酶切位点(见图1)上，将获得的重组载体命名为p2Ta-CADl，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，转化细胞冰浴30分钟后，42t热激50秒，加入LB液体培养基，37'C保温45分钟，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。将抗性菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中37C震荡培养过夜，再进行1/100稀释后，37"C震荡培养2小时，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3小时，12000g离心10分钟，收集菌体，菌体加入100ul裂解液(50mMTris-HC1pH6.8,100mM二硫苏糖醇，2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油)，IO(TC煮沸5分钟，菌体蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳(凝胶浓度12%),以常规考马斯亮蓝(CommassieBlueR250)染色，结果显示证明乃-C4贝基因已在大肠杆菌中表达出预期的蛋白质，该蛋白质命名为Ta-CAD1，测得其序列如序列表中序列2所示，该蛋白质序列包括360个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占126个，亲水氨基酸占78个，碱性氨基酸占36个，酸性氨基酸占43个，该蛋白质的分子量为38.6KD，等电点为5.9。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。在本实施例中，小麦肉桂醇脱氢酶的编码基因也可以采用人工合成的方式获得。实施例四、肉桂醇脱氢酶活性的测定将不含7<3-C4Z7基因的载体pET-28a作为对照组，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，其表达步骤同实施例三相同。将实施例三中的和对照组中的经IPTG诱导后的大肠杆菌各取50ml，于4000g离11心10分钟，加入4ml菌体裂解液(20mMTris-HClpH7.5，lmMPMSF，2mM二硫苏糖醇，100ug/ml溶菌酶)，3(TC保15分钟，用超声波处理20次，4000g离心10分钟，取上清液进行酶活测定。酶活测定反应液包括200raM磷酸钾缓冲液(p朋.5)，O.lmMNADPH，70uM松柏醛(Coniferaldehyde)，50ul蛋白溶液，总体积500ul，在25°。下测定A340的降低来计算肉桂醇脱氢酶的活性。蛋白质含量按Bio-Rad公司的方法(Bradford,MM，1976，Anal.Biochem.，72:248-254)测定。结果显示，以松柏醛(Coniferaldehyde)为底物，对照组的酶活性为1.92nmol/sec/mg，肉桂醇脱氢酶活性为94.49nmol/sec/mg，表明基因所编码的蛋白质具有肉桂醇脱氢酶的催化活性，可以催化合成松柏醇等木质素单体，因而能够控制小麦中的木质素合成。实施例五、小麦组织中7^-^//基因表达产物的检测釆用Northernblot杂交检测小麦不同组织中的7^-C4"7基因的表达产物。分别从小麦根、茎、叶组织中分离提取总RNA样品，按常规方法在1.4%琼脂糖/甲醛变性凝胶电泳上分离，以20xSSC按毛细管法转移到尼龙膜上(转移时间12小时)，尼龙膜夹在两层Whatman滤纸中，80。C真空烘烤2小时，将膜放在杂交瓶中，之后加入杂交液(6xSSC，5xDenhardt，0.5%SDS，100ug/mL鱼精DNA，50%甲酰胺)10ml，42'C预杂交2小时，加入标记的肉桂醇脱氢酶基因探针，42t:杂交过夜，经过6xSSC加0.1%SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1xSSC加0.1%SDS于65t:洗两次，每次10分钟，于-8(TC下放射自显影一周。显影后的膜加入O.lxSSC加O.WSDS于95r洗两次，每次15分钟，之后加入含有18SrRNA探针的杂交液，42'C杂交过夜。将膜取出，按相同的程序洗膜，于-8(TC下放射自显影l小时。结果如图3所示，化-C4"7基因在正常小麦植株中主要在茎组织中表达，在根和叶中很少表达。表明此基因与茎的发育和木质化密切相关。实施例六、C4"/基因的功能分析对易倒伏(C6001)(沧州市农科院)和抗倒伏(H4564)(邯郫市农科院)小麦品种的不同发育时期的茎(从拔节期到乳熟期)中的7s-C^7基因进行Northern杂交，以检测该基因在不同品种中的表达(表l)，结果表明该基因在抗倒伏品种中的表达量在生长前期(拔节期或抽穗期)与易倒伏品种相当，但是在茎的生长后期(乳熟期)抗倒伏品种中的表达量明显高于易倒伏品种，而这一时期正是小麦需要更强的机械支持并容易发生倒伏的时候。此结果表明C4/^基因不仅控制着小12麦木质素的合成，而且与小麦茎的抗倒伏特性密切相关，控制C4ZV基因的表达就能控制小麦的抗倒伏性状。因此，在植物茎组织中过量表达这种蛋白质及其基因，可以明显增强茎倒伏的能力，所以此基因和蛋白质在禾本科作物的抗性育种方面具有重要意义。(小麦茎不同发育时期6^^基因的表达量的单位以C6001拔节期为ioo，计算其它的相对含量)表l.小麦茎不同发育时期化-""7基因的表达量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例七、抗倒伏植物的培养A.制备含有化-^"7基因的重组表达载体将含有7a-^Z^基因的载体p2Ta-CAD1，以Notl(购自NewEnglandBiolabs(Beijing)Ltd.,北京，中国)酶切后，用Klenow酶(购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司)补平，然后用Xbal(购自NewEnglandBiolabs(Beijing)Ltd.)酶切，回收1203bp的片段，连接到含有花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子和卡那霉素抗性选择基因标记的载体pBI121(Stratagene公司)Xbal-Small位点上，得到植物重组表达载体p3Ta-CADl(其物理图谱如图2所示)，通过酶切分析和序列分析证明此表达载体的完整性和正确性。B.含有7s-C4"7基因的重组细胞和重组植物的制备将步骤A得到的重组表达载体通过基因枪法或花粉管通道转化易倒伏的小麦品种的植物细胞，得到抗倒伏和抵御病虫害侵袭的重组细胞，将重组细胞培育成重组植物。序列表〈110〉中国科学院植物研究所<120〉小麦肉桂醇脱氢酶及其编码基因与应用<130〉CGGNAL92167<160>2<210〉1<211〉1311<212〉腿〈213〉小麦属小麦(W"，譜"簡L.)<400〉1tcggcacgaggcaaaggcaagtgcaagtcctcccaaatccacgcatccctcgcccgcgtc60tcctcccgttgccgcagcagcssg3gaatgggcagcgtcgacgcctccgagacgacggtc1203CCgggtgggccgccagggacgccaccggccacctctccccctacag3t3caccctcagg180ctgaagacgtggtgttgaaggttaagtactgcggcatctgccacactgac240gtccaccaggtcaagaacgacctcggtgcttcgaagtaccccatggtcccagggcatgag300gtggttggcg3ggtggtgg3ggtcgggccggaggtg3gc3agttccgggccggcgacgtg360gtgggcgtgggggtgatcgtggggtgctgccgcgactgccggccgtgcaaggccaacgtc420gagcagtactgcaacaagaagatctggtcgt3C朋Cg3Cgtctacaccgacggcaagccg480acgcagggcggcttcgcctccgccatggtcgtcgatcagaagttcgtggtgaagatcccc540gccgggctggcgccggagcaggcggcgccgctgctgtgcgcgggggtgacggtgtacagc600ccgctgaagcacttcgggctcatgacccccggcctccgcggcgggatactgggcctgggc660ggcgtgggccacatgggcgtgaaggtggccsagtcc3tgggccaccacgtgacggtgatc720agctcgtcca3CEL3g犯gCgggccgaggccatggacgacctgggcgccgacgcgtacctc780gtcagctccgac3ccgacc3gatggccgccgccgccgactcgctggactaceitcatcgac840accgtgcccgccaagcax:ccgctggagccctacctggcgctgctcaagatggacggcaag■ctggtgctgatgggcgtgatcgcggagccgctcagcttcgtgtcccccatggtgatgctg96014<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>130LysPheValValLys145ProLeuLeuCys135ProAlaGlyLeulie150GlyValThrValGlyLeuValGlyThrVal210LeuGly225AlaAlaMetAla165ProGlyLeuArgThr180MetGlyValLysHis195lieSerSerSerVal200LysGly185AlaLysAlaAspAlaAspAspTyr230LeuAspTyrlieAlaAspSer245ProTyrLeuAlaHisProLeuGlu260GlyVallieAlaValLeuMet275LeuGlyArgLysValMet290AspGluThrGluGlu305SerGinlieGluGlu280lieThrThr295LeuGinPheArgLeuGlySerGluAsn355Val325AsnVal310ValLysMetAspArg340lieGluAspAlaAspValArgAspAlaAla360Tyr345Tyr170Gly140AlaProGluGinAlaAla155160SerProLeuLysHisPhe175lieLeuGlyLeuGlyGly190HisHisValAsn215LeuValSerSerLysSerMetArgAlalie250LeuAsp235AspGlyCysSerGlu220ThrGly205AlaMetAspAspAspThrValLysMetAspLeu265ProLeuSerPhePhe300AspVal285lieValAspLys315ValAsnGinAlaGinMetAla240ProAlaLys255GlyLysLeu270SerProMetGlySerMetGlyTyr330ArgPheValValAsp350LeuThr320PheGlu335ValGly权利要求1、一种肉桂醇脱氢酶，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有肉桂醇脱氢酶作用的由a)衍生的蛋白质。2、权利要求1所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下l)或2)或3)的核苷酸序列1)序列表中序列l所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与序列表中序列1的核苷酸序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列；3)与序列表中序列1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的核苷酸序列。4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的物理图谱如图l或图2所示。6、权利要求2或3所述基因在培育抗倒伏的植物的应用。7、一种培育抗倒伏植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入植物中，得到抗倒伏的植物。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于是将权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入植物中。9、根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述植物为禾本科植物，所述未本科植物为小麦。10、扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。全文摘要本发明公开了一种小麦肉桂醇脱氢酶及其编码基因与应用。本发明提供的肉桂醇脱氢酶，是如下a)或b)的蛋白a)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与肉桂醇脱氢酶作用相关的由a)衍生的蛋白质。本发明还提供了肉桂醇脱氢酶的编码基因。该编码基因在培育抗倒伏植物中的应用，将所述编码基因导入植物中，被转化的植物宿主可为小麦。本发明的蛋白质以松柏醛为底物，其酶活性为94.49nmol/sec/mg，表明该蛋白能够控制小麦中的木质素合成。对易倒伏和抗倒伏小麦品种的茎的Ta-CAD1基因进行Northern杂交，表明Ta-CAD1基因不仅控制着小麦木质素的合成，还与小麦茎的抗倒伏特性密切相关。文档编号C12N5/10GK101508980SQ200910080159公开日2009年8月19日申请日期2009年3月24日优先权日2009年3月24日发明者马庆虎申请人:中国科学院植物研究所