专利名称：表达抑制小麦籽粒多酚氧化酶的发卡rna的dna分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达抑制小麦籽粒多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。
背景技术：
面粉白度是衡量面粉品质的重要性状之一，受许多遗传和环境控制。影响面条、 馒头、饼干等面食品的外观和色泽，主要取决于类胡萝卜素(carotenoids)和多 酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PP0， EC 1.10.3.1)的含量。其中，多酚氧化酶 (PPO)与小麦面粉及其面食品在加工、贮藏中的褐变直接相关(Baik， 1995; Kruger， 1994; Hatcher， 1993)。同时，PPO种类的遗传变异和表达差异也决定小麦籽粒中 的PPO总活性高低，从而直接或间接影响面粉的白度。
尽管籽粒中大部分PPO在磨粉过程中随糊粉层(麸皮)而被除去，但面粉中的 残留足以严重影响面粉的白度、面食品的外观品质(如亮度、色泽)，并使其在je 藏过程中发褐发暗(Abrol， 1970; Kruger， 1994; Baik， 1995; Park, 1997; Anderson, 2001; Okot-Kotber， 2001; Soysal， 2004;李军红，2000;葛秀秀，2003)。这 种褐变严重影响小麦面粉及其面食品的品质，尤其是全麦食品，因而倍受面粉加工 业和育种家关注。
普通小麦是异源六倍体，PPO多基因家族成员众多，在天然突变体和人工诱变 体(如EMS诱变)中很难筛选到合适的隐性突变体，使传统杂交育种陷入了缺乏相 应育种材料的困境。
为了克服传统育种方法(如诱变育种)的局限，利用遗传工程技术引入基因获 得新性状或者消除基因去掉坏性状，已经广泛地、成功地应用于植物遗传改良和育 种中。近年来，转录后的基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing, PTGS) 已广泛地用于下调(down-regulate)植物代谢过程中的某些关键酶。
FAD2基因编码微生物脂肪酸"6-脱氢酶，由于该酶催化油酸(C18: 1A9)的 A12位置引入一个双键，形成亚油酸(C18: 2A9， 12)，故又名A12-脱氢酶。FAD2 在拟南芥基因组中为单拷贝。澳大利亚CSIR0 Plant Industry的Smith和 Waterhouse等人2000年在Nature报道，含有拟南FAD2内含子(Arabidopsis FAD2 intron)和发夹结构(hairpin structure)的沉默载体能导致几乎100%的PTGS。
3这种增强沉默效应的构建方式是将内含子连接在发夹结构的正义臂和反义臂之间， 即含内含子的发夹RNA (intron-containing hairpin RNA, ihpRNA)。该内含子的
切除可能有助于发夹臂互补配对、并促进二聚体的形成，因而能大幅度提高沉默效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达小麦籽粒抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子 及其应用。
本发明所提供的表达小麦籽粒抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子是由A、B 和C三个片段依次连接组成，所述A片段的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述 C片段与所述A片段反向互补。
其中，所述B片段没有特别的限制，优选为真核生物基因的内含子，如FAD2 内含子，所述B片段的核苷酸序列具体为序列表中的序列2。
含有所述DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌、扩增所述DNA分
子全长及其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
含有所述DNA分子的重组表达载体中启动所述DNA分子的启动子是小麦籽粒特
异表达的高分子量谷蛋白亚基1Dx5的强启动子，其核苷酸序列具体可为序列表中 序列3。
本发明的另一个目的是提供一种培育多酚氧化酶活性降低的小麦的方法。 本发明所提供的培育多酚氧化酶活性降低的小麦的方法，是将所述DNA分子导
入小麦中获得多酚氧化酶活性降低的小麦。
本发明的再一个目的是提供一种培育面粉白度改善的小麦的方法。 本发明所提供的培育面粉白度改善的小麦的方法，是将所述DNA分子导入小麦
中获得面粉白度改善的小麦。
序列表中的序列l所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
本发明利用小麦籽粒特异表达的高分子量谷蛋白亚基1Dx5的强启动子来启动 表达抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子，在转基因小麦中籽粒内源的/ po基因 的表达明显受到抑制，PPO同功酶活性降低，在不影响小麦营养生长和抗逆性的前 提下，可改善小麦面粉的白度。本发明将为小麦面粉白度的改良、品质育种提供理 论依据、实验方法和育种材料，对我国小麦品质改良和优质品种选育具有重要意义。
图1为pBAC47P+ppoIR载体的结构示意图。 图2为移栽的转pBAC47P+ppoIR载体的T。代小麦植株。 图3为转pBAC47P+ppoIR载体的小麦的Southern杂交检测。 图4为Southern杂交进一步确定的转pBAC47P+卯oIR载体的小麦的Northern 杂交结果。
图5为Southern杂交进一步确定的转pBAC47P+ppoIR载体的小麦的ppo基因 表达的半定量RT-PCR结果。
图6中转pBAC47P+ppoIR载体的中优9507的PP0活性。
具体实施例方式
实施例1、培育多酚氧化酶活性降低的小麦
一、RNA干扰载体pBAC47P+ppoIR的构建
通过比较籽粒PP0编码基因与叶片PP0编码基因的mRNA同源性，选取0.8Kb 的籽粒PP0靶基因片段。设计了一对引物TaPP0-sl和TaPP0-al; TaPP0-sl: 5， -CACCACGGCAACATCGACAGCCT-3，， TaPP0-al: 5' -ATACCACGGCGAGCCACCGACGC-3'。
采用Trizol RNA提取试剂盒(天根公司)提取总RNA，用M-MLV反转录试剂盒 (Promega公司)按说明书的两步法进行反转录-PCR (RT-PCR) ， PCR产物经过1% 琼脂糖凝胶电泳后，凝胶扫描仪(型号fti-500， pharmacia biotech公司)检测， 使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型，天根公司)回收0.8Kb片段，获得纯 化的目标基因片段，使用pGEM-T Easy Vector System (Promega公司)按照说明 书将该片段连接到pGEM-TEasy载体上。然后，热击转化感受态EcoliDH5 a ，铺平 板(操作按照《分子克隆》)筛选出的阳性克隆pTE-ppo送到上海生工公司测序。 测序结果表明该片段的核苷酸序列为序列表中的序列1，用TakaRa公司的EcoR I 同时酶切pTE-ppo和pBSK-FAD2Int9 (根据GenBank中的AJ27184. 1序列设计引物 FADI-5: 5， -GGTACCCGGGAATTCAGATCGTCCGTCGCTTCTCTTCCAT-3，和FADI-3: 5， -GAGCTCCCGGGCGGCCGCAAGCTTCTGCAGAAAACCAAAAGCAA-3，，以拟南芥基因组DNA 为模板进行PCR反应，通过Kpn I和Sac I双酶切将该PCR产物克隆到德国 Stratagene公司的pBluescript④II XR Predigested Vector)(酶切反应体系禾口 条件按照TakaRa说明书)，琼脂糖凝胶电泳后分别回收前者0. 8Kb片段和后者的大 片段，用T4 DNA连接试剂盒(Promega公司)将回收的0. 8Kb片段和大片段连接(反应体系和条件按照Promega公司说明书)得到重组DNA分子，热击转化感受态 EcoliDH5a，铺平板筛选阳性克隆，用引物TaPPO-sl和AtFAD2I9F
(5， -AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3，)进行PCR扩增，扩增出1.9Kb的片段，该克隆 含有ppo片段反向插入FAD2 Intron9下游的重组质粒pBSK-FAD2I9-ppo。
再用TakaRa公司的Not I同时酶切pTE-ppo和pBSK-FAD2I9-ppo (酶切反应体 系和条件按照TakaRa说明书)，琼脂糖凝胶电泳后分别回收前者0. 8Kb片段和后者 的大片段，用T4DNA连接试剂盒(Promega公司)将这两片段连接(反应体系和条 件按照Promega公司说明书)得到重组DNA分子，热击转化感受态EcoliDH5 a 、铺 平板筛选阳性克隆，用引物TaPPO-sl进行PCR扩增，扩增出2.7Kb的片段，该克隆 为ppo片断正向插入FAD2 Intron9上游的重组质粒pBSK-ppoIR。从而得到了该目 的基因片断的发夹RNA构件。
用BioLabs公司的Xmn I同时酶切pBAC47P (根据GenBank中的X12928. 4序列 设计引物lDxP-U: 5， -ATCGCAGCTGGCATGCAAATATGCAACATA-3'和lDxp-D: 5， -GAGTCGACCTCACCTTCAGCGACGAGAGCCAGGGGCA-3，，以小麦品种Cheyenne (钱尼) 基因组DNA为模板，进行PCR扩增，用PvuII和Sal I双酶切将该产物克隆到Promega 公司的pSP72载体得到pSP72-1DxP。用PvuII和HindIII酶切pSP72-1DxP，加入dNTP
(Promega公司)补平粘性末端得到片段A;用引物1DxP-5: 5， —CTGAAGCTTTGAGTGGCCGTAGAT—3，禾卩lDxP—3: 5， —TCACCGTGCACGCAGCCATG—3'， 以Cheyenne基因组DNA为模板进行PCR扩增得到约0. 33KB片段吧B，将片段A和 片段B用T4DNA连接酶连接，获得pBAC47P)和pBSK-ppoIR (酶切反应体系和条件 按照BioLabs说明书)，琼脂糖凝胶电泳后分别回收前者大片段和后者2. 7Kb片段， 用T4 DNA连接试剂盒(Promega公司)将这两片段连接(反应体系和条件按照Promega 公司说明书)得到重组DNA分子，热击转化感受态EcoliDH5a 、铺平板筛选阳性克 隆，从而得到RNA干扰载体pBAC47P+卯oIR。
二、 pBAC47P+ppoIR转化小麦
选择小麦籽粒PPO活性高的品种作为进行遗传转化的受体材料。用于小麦幼胚 培养的品种是中优9507和京花1号。
取授粉后12天的未成熟籽粒，用70%酒精漂洗2分钟，用0. 1%氯化汞消毒15 分钟，无菌水洗涤3次，在无菌条件下挑出幼胚接种于幼胚诱导培养基(MS基本培 养基中添加2mg/L 2、 4-D， 30g/L蔗糖，7g/L琼脂粉，pH5. 8)上3天。用基因枪法将pBAC47P+ppoIR载体和筛选标记基因载体p35SIH3 (以Promega公司的pSP72 载体为出发载体，在HindIII和Sal I之间插入CaMV 35S启动子，在Kpn I和EcoR I之间插入NOS终止子，在BamH I和Sac I酶切位点插入bar基因。CaMV 35S启动 子和N0S终止子来自于美国Clontech公司的pBI121载体。bar基因来源于植物表 达载体pBPC30)(张晓东，梁荣奇，陈绪清，杨凤萍，张立全。优质HMW谷蛋白亚 基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析。科学通报，2003， 48 (5): 474-479)(中国农业大学)共转化诱导培养3天的幼胚中。以只转入pBSK-FAD2Int9 和p35SIH3载体的幼胚作为对照。
转化后的幼胚在含Bialaphos (0. 5raM)的幼胚诱导培养基上筛选。抗性愈伤组 织转移至分化培养基(MS基本培养基添加lmg/L玉米素，lmg/L IAA， 0. 5mM Bialaphos， 30g/L蔗糖，7g/L琼脂粉；pH5.8)上，分化苗长出主茎后将其移至 生根壮苗培养基(MS培养基加10mg/L IAA， 80g/L蔗糖，7g/L琼脂粉;pH5. 8)上， 待幼苗长出2片新叶，3 — 4条主根后，洗净培养基，移栽到网室的覆盖塑料薄膜的 小畦中(图2)。
CTAB法提取pBAC47P+ppoIR转化的小麦T,代植株叶片基因组DNA。 PCR检测FAD2 Intron9和PP0基因鉴定pBAC47P+ppoIR转化阳性小麦，检测 FAD2 Intron9所用引物为Intron-3(5， -CCGCTCACGATAGATCTGCT-3，)和Intron-5 (5， -GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3，)。
检测FAD2 Intron9的反应体系25W
10XPCR buffer2.
dNTP2.
引物(10mM)l潜l
Intron-5(10mM)1,0Ml
rTaq(2. 5U)O.糾
基因组DNA (30ng/ixL)4. 0^1
ddH2014.
反应条件95。C预变性3min后；94。C变性50Sec、 58。C退火40Sec、 72。C延伸 90Sec， 35个循环；最后72。C延伸7min。
PCR扩增出1. 1Kb的片段为FAD2 Intron9阳性的小麦。
PCR检测FAD2 Intron9为阳性的植株进行Southern杂交分析。以FAD2 Intron9 为探针。
Southern杂交结果如图3所示，PCR鉴定为阳性的小麦经Southern杂交进一
7PCR检测FAD2 Intron9为阳性的植株进行Southern杂交分析。以FAD2 Intron9 为探针。
Southern杂交结果如图3所示，PCR鉴定为阳性的小麦经Southern杂交进一 步确定为转pBAC47P+ppoIR载体的小麦。
图3中，M: DGIMarker (2642bp) ， +: pBAC47P+ppoIR载体，-对照，1-12为 PCR鉴定为转pBAC47P+ppoIR载体的小麦籽粒。
提取了 Southern杂交进一步确定的转pBAC47P+ppoIR载体的小麦灌浆期籽粒 总RNA，以进行Northern杂交分析(操作按照《分子克隆》进行)，从而以初步检 测转基因植株的ppo基因表达状况。
Northern杂交结果如图4所示，转pBAC47P+ppoIR载体小麦株系2-23， 2-29， 4-2， 4-5， 4-8， 4-20和4-29的谱带明显比第1泳道的对照浅，说明这7个植株的 / po基因表达减弱。
图4中1-15分别是对照、转pBAC47P+ppoIR载体小麦株系2-8、 2-13、 2-23、 2-29、 4-1、 4-2、 4-3、 4-4、 4-5、 4-7、 4-8、 4-20、 4-29和5-7。
提取了 Southern杂交进一步确定的转pBAC47P+ppoIR载体的小麦籽粒的总 RNA，反转录成cDNA;以反转录后的cDNA为模板，PP0-5 (GCCCGAGCAACACTGACT和 PP0-3 (TGGGTACGAGCGACACG)为引物检测ppo基因的表达；以actin基因为内参(引 物是Actin-F: GGAATCCATGAGACCACCTAC和Actin-R: GACCCAGACAACTCGCAAC。上海 生工生物技术有限公司合成)。以未转基因的小麦做对照。将PCR产物经过P/。琼脂 糖凝胶电泳后，在凝胶扫描仪(型号fti-500， pharmacia biotech公司)检测并 照像，并Multl Gauge图像分析软件分析其相对含量。
ppo基因的表达结果如图5所示，转pBAC47P+卯oIR载体的小麦籽粒中ppo基 因的表达与对照相比都有明显的下降。说明转pBAC47P+ppoIR载体的小麦中ppo基 因的表达受到了抑制。
图5中，l-20为各个转pBAC47P+ppoIR载体的小麦株系与对照的表达量的比值。
三、籽粒PP0酶活测定
籽粒PP0活性测定方法如下
取lg转pBAC47P+ppoIR载体的中优9507全麦粉(蒸馏水预先浸泡)，用磷酸 缓冲液(p服.O)和石英砂冰浴匀浆，离心后浸提24h。取浸提液0.2mL，冷冻离心 后，取0. 05mL上清夜加入到0. 4mL磷酸缓冲液(pH6. 0)中，与0. 2mL 100mmol/L邻
8(U/gXmin)。以中优9507全麦粉作为对照。 PPO活性二AAX1000/(mXT)
A A表示反应前后吸光度差值，m表示全麦粉重量(g) ， T表示反应时间(min)。 PPO酶活的测定结果如图6所示，转pBAC47P+ppoIR载体的中优9507籽粒中
PPO酶活与对照相比都有明显的下降。
图6中，1为对照，2-6为转pBAC47P+ppoIR载体的中优9507。 转pBAC47P+卯oIR载体的京花1号的结果与转pBAC47P+ppoIR载体的中优9507
相同。转pBAC47P+ppoIR载体的京花1号籽粒中PPO酶活与京花1号相比都有明显
的下降。
上述实验结果表明，转pBAC47P+卯oIR载体的小麦中籽粒内源的ppo基因的表 达受到抑制，降低了PP0同功酶的活性，因而能改良小麦面粉的白度。序列表
〈110〉 中国农业大学
<120>表达抑制小麦籽粒多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子及其应用
<130〉 CGGNARW92151
<160> 3
〈210〉 1
<211> 725
<212〉 腿 <213>人工序列
<220〉 〈230〉
<400> 1
caccacggca acatcgaccg cctgtggcac gtctggcgcc gcctccgccc gagcaacacc 60
gacttcaccg accccgactg gctcgacgcc gccttcctct tctacgacga ggaggcccgc 120
cccgtgcgcg tgcgcgtccg ggactgcctc gacccggccg cgctgcggta cacgtaccag 180
gacgtcggcc tgccgtggct caacgccagg ccggccaagg cgtccggcgg gacgccggcg 240
cccgccacaa ccggtaccct ccctgccacc ctggacagga ccatacgggt gacggtgacg 300
鄉ccc卿g tgtccaggag ccgccgggag aaggaggagg aggaggaggt gctggtcgtg 360
gaggggatcg agatcgccga ccatttcaac aagttcgtca agttcgacgt gttggtgaac 420
gagcccgagg gcggagtggg cagcacgccg gcgacggcga cggggtactg cgctgggagc ■
ttcgcgcata cgccgcacat ggtccggccc gaggagatga ggaagggacc ggtcaagacg 540
gtggcgaggt tcggcgtgtg cgacctgatg gacgacatcg gggcggacga cgaccagacg 600
gtggtggtgt cgctcgtacc caggtgcggc ggtgagctgg tcaccgttgg cggcgtcagc 660
atcagctacc tcaagtgaag ttacctaatg tggtccgctc tcgcgtcggt ggctcgccgt 720
ggtat 725
<210> 2
10〈211〉 1118
〈212〉 DNA <213>人工序列
〈220〉 <230>
〈400> 2
tCMC犯gCtgaaaactcaag3ctatgga^tagttttatcaaaaa^cagag60
catgcacaagaaacaa^gtggt^cga^ttcaaga^gtcttcagaca^atgatccaaagtg120
gg犯atcaggttgtga犯gggattgccacagcgtggaccaaaaggaataa180
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〈210〉 3 〈211〉 762〈212〉 DNA 〈213〉 人工序列
<220〉 〈230〉
<400〉 3
agctttgagtggccgt卿tttgca^a^gcaatggctaactx"tgccaaac60
cccaagaaggataatcacttttcttagatagaccaatatacaaacatcca120
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gaacagacc3atatacaaacatccacacttctgc^acaatacatcagaactaggattac480
gccgattacgtggctttagcagactgtccaa^a^tctgttttgc犯agctccaattgctc540
cttgcttatccagcttcttttgtgttggcaaactgcgcttttccaaccgattttgttctt600
ctcgcgctttcttcttaggctaaacaaacctcaccgtgcacgcagccatggtcctgaacc660
;ttcacctcgtccctataaaagcctagccaaccttcacaatcttatcatca720
cgagcaccacaaactagagatcaattcactgatagtccaceg762
1权利要求
1、表达抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子，由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述C片段与所述A片段反向互补。
2、 根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述B片段的核苷酸序列为 序列表中的序列2。
3、 含有权利要求1或2所述DNA分子的重组表达载体。
4、 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于启动权利要求1或2所 述DNA分子的启动子的核苷酸序列为序列表中序列3。
5、 含有权利要求1或2所述DNA分子的转基因细胞系或重组菌。
6、 扩增权利要求1或2所述DNA分子全长及其任意片段的引物对。
7、 权利要求1或2所述DNA分子在改良小麦面粉白度中的应用。
8、 一种培育多酚氧化酶活性降低的小麦的方法，是将权利要求1或2所述DNA 分子导入小麦中获得多酚氧化酶活性降低的小麦。
9、 一种培育面粉白度改善的小麦的方法，是将权利要求1或2所述DNA分子导 入小麦中获得面粉白度改善的小麦。
10、 一种DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列1。
全文摘要
本发明公开了一种表达抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。表达抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子，由A、B和C三个片段依次连接组成，所述A片段的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述C片段与所述A片段反向互补。所述B片段的核苷酸序列为序列表中的序列2。本发明利用小麦籽粒特异表达的高分子量谷蛋白亚基1Dx5的强启动子来启动表达抑制多酚氧化酶的发卡RNA的DNA分子，在转基因小麦中籽粒内源的ppo基因的表达明显受到抑制，PPO同功酶活性降低，在不影响小麦营养生长和抗逆性的前提下，可改善小麦面粉的白度。
文档编号C12N15/82GK101508990SQ20091008000
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者倪中福, 姚颖垠, 孙其信, 梁荣奇, 解超杰 申请人:中国农业大学