专利名称：苹果多酚氧化酶的提取及测定方法
技术领域：
本发明是关于苹果多酚氧化酶的提取和测定方法，属于天然药物领域。
背景技术：
酶促褐变是果蔬加工过程中普遍存在的一种现象。酶促反应的发生不仅影响产品 的外观品质，同时营养成分及风味也会发生很大的变化，使产品质量下降，影响到产品的销 售和企业经济效益。尤其是发生在肉质颜色较浅的水果、蔬菜上的酶促褐变更为显著。在 热带鲜果中，酶促褐变导致的直接经济损失达50%。 酶促褐变反应非常迅速，甚至在极短的时间内便可发生。酶促褐变产生的原因主 要是当果蔬受到机械损伤或处于不良环境，如受冻、受热时，尤其是在加工过程中，果蔬内 的多酚类物质在多酚氧化酶的催化作用下氧化而呈现褐色。这些多酚类物质包括邻苯二酚 (儿茶酚)、绿原酸、咖啡酸、没食子酸等，它们在完整的细胞中作为呼吸传递物质，在酚_醌 之间保持着动态平衡。当新鲜的果蔬组织被损伤，氧大量侵入，酶原被激活，邻苯二酚类 物质经酶的催化作用氧化为邻苯醌类化合物，该化合物进一步聚合形成复杂聚合物黑素 (melanin)。 酶促褐变反应的发生必须具备三个条件多酚类物质、多酚氧化酶和氧。决定酶 促褐变率的最重要的因素即为组织中活性多酚氧化酶和酚类化合物的浓度、可利用的氧含 量、pH值和温度等。 多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,简称PP0)的系统命名是邻二酚氧-氧化还原 酶，广泛分布于自然界。多酚氧化酶是一种含铜的酶，必需以氧为受氢体，是一种末端氧化 酶。人们普遍认为多酚氧化酶是两种酶的复合体(1)酚羟化酶，又叫甲酚酶(cresolase)。 催化一元酚羟基化反应，生成相应的邻一二羟基化合物。(2)多元酚氧化酶，又叫儿茶酚酶 (catecholase)。催化邻_ 二酚氧化，生成邻_醌。以上两类反应都需要有分子氧的参加。 由果蔬酶促褐变产生的机理可知，抑制酶促褐变可从三方面人手(l)减少多酚类物质的 含量；(2)控制多酚氧化酶的活性；(3)降低氧浓度，从而控制褐变的发生。
果蔬的酶促褐变主要是由于多酚氧化酶催化酚类物质氧化而造成的。
世界苹果年产量约为3，200万公吨。美国所产的苹果通常有一半鲜食；约l/5用以 制醋、果汁、果冻、苹果泥等；约1/6做成罐装苹果酱及用作馅饼原料。在欧洲，很大部分苹 果用制苹果酒和白兰地。用制苹果酒的苹果占世界产量的1/4。美国、中国、法国、意大利和 土耳其是最大的生产国，法国、义大利、匈牙利、阿根廷、智利、南非和美国是最大的输出国。 苹果富含碳水化合物和维生素A、C，所含纤维量多，亦为身体所必需。1.苹果中的胶质和 微量元素铬能保持血糖的稳定，还能有效地降低胆固醇；2.在空气污染的环境中，多吃苹 果可改善呼吸系统和肺功能，保护肺部免受污染和烟尘的影响；3.苹果中含的多酚及黄酮 类天然化学抗氧化物质，可以减少肺癌的危险，预防铅中毒；4.苹果特有的香味可以缓解 压力过大造成的不良情绪，还有提神醒脑的功效；5.苹果中富含粗纤维，可促进肠胃蠕动， 协助人体顺利排出废物，减少有害物质对皮肤的危害；6.苹果中含有大量的镁、硫、铁，铜、碘、锰、锌等微量元素，可使皮肤腻、润滑、红润有光泽。 苹果营养丰富，是人们非常喜爱的水果之一。苹果中富含多酚类物质和多酚氧化 酶，在苹果的保鲜过程中，多酚氧化酶能催化酚类物质氧化发生酶促褐变反应，使苹果的品 质发生变化。如果能将苹果中的多酚氧化酶提取出来，那么对于高浓度苹果汁、苹果酱、苹 果酒等苹果加工产品的生产将具有重要意义。在本发明完成之前，未发现有对苹果多酚氧 化酶提取并测定的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种苹果多酚氧化酶的提取测定方法。
本发明的目的之二是为果蔬类产品的保鲜技术的开发提供一些资料。
本发明的技术解决方案如下 1.多酚氧化酶(polyphenol oxidase,简称PP0)的提取 苹果洗净后在低温下保温，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，用高速组织 捣碎机匀浆2min，而后用布氏漏斗抽滤滤饼用前一次1/2量的冷冻丙酮再次提取抽滤，得 到的白色物质冷冻真空干燥，即得PP0丙酮粉。 称取丙酮粉，溶于的预冷磷酸盐缓冲溶液中，用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过
滤，即得苹果PPO粗酶液。 2.多酚氧化酶测定方法在lml磷酸氢二钾-拧檬酸缓冲液中，用lm10. lmol/L邻苯二酚为底物，加lml酶 提取液，反应3min后，在分光光度仪扫描并观察吸收峰情况。测定时以水为空白，以热失活 的粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照。
3.PP0活性的测定 取磷酸盐缓冲溶液lml于lcm比色皿中，加人0. lmol/L邻苯二酚溶液lml。混匀 后在400mm处比色，从酶液加入后开始记时，每15s记录一次0D随时间的变化值，以最初直 线段的斜率(A0D/t)表求酶活力，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟引起 吸光度改变0. 001所需的酶量。 本发明采用有机溶剂提取苹果中的多酚氧化酶，并用分光光度计对物质的结构进 行鉴定。然后用比色法测定PP0活性。多酚氧化酶的提取对于高浓度苹果汁、苹果酱、苹果 酒等苹果加工产品的生产将具有重要意义。另外，还可以将提取出来的多酚氧化酶对其进 行抑制作用研究，寻找更佳的果蔬保鲜剂。
权利要求
苹果多酚氧化酶的提取及测定方法，其特征在于包括以下步骤(1)多酚氧化酶(简称PPO)的提取苹果洗净后在低温下保温，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，用高速组织捣碎机匀浆2min，而后用布氏漏斗抽滤滤饼用前一次1/2量的冷冻丙酮再次提取抽滤，得到的白色物质冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。称取丙酮粉，溶于的预冷磷酸盐缓冲溶液中，用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过滤，即得苹果PPO粗酶液。(2)多酚氧化酶测定方法在1ml磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液中，用1ml0.1mol/L邻苯二酚为底物，加1ml酶提取液，反应3min后，在分光光度仪扫描并观察吸收峰情况。测定时以水为空白，以热失活的粗酶液代替粗酶液在同样条件下测定为对照。(3)PPO活性的测定取磷酸盐缓冲溶液1ml于1cm比色皿中，加人0.1mol/L邻苯二酚溶液1ml。混匀后在400mm处比色，从酶液加入后开始记时，每15s记录一次OD随时间的变化值，以最初直线段的斜率(ΔOD/t)表求酶活力，一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟引起吸光度改变0.001所需的酶量。
2. 根据权利1中所述的苹果洗净后在低温下保温，再去皮去核后取其果肉，立即加入冷丙酮，其特征在于苹果的保温温度为4t:，保温时间为4h ;加入冷丙酮的量为7ml/g苹果。
3. 根据权利1中所述的称取丙酮粉，溶于的预冷磷酸盐缓冲溶液中，其特征在于磷酸缓冲液(m):丙酮粉(v) = 100 : 1，浓度为0.05mol/L，pH 6. 8，温度4°C ，且包含有含2% 的PVPP(聚己烯吡咯烷酮)和0. 25% Triton X100。
4. 根据权利1中所述的用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过滤，其特征在于搅拌时间 20min，速率5000r/min，离心10min。
5. 根据权利1中所述的在分光光度仪扫描并观察吸收峰情况，其特征在于分光光度 计的扫描波长为300-450nm。
全文摘要
本发明公开了一种苹果多酚氧化酶的提取及测定方法。苹果冷冻后取其果肉，加入冷丙酮，用高速组织捣碎机捣成匀浆，抽滤，滤饼用冷冻丙酮再次提取抽滤，得到的白色物质真空干燥，即得PPO丙酮粉。将丙酮粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，用磁力搅拌器搅拌离心，上清液过滤，即得粗酶液。然后用分光光度仪扫描观察吸收峰情况确定物质的结构。最后采用比色法测定PPO的活性。
文档编号G01N21/25GK101760453SQ200810162969
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者吴菁, 陈群 申请人:湖州来色生物基因工程有限公司;吴菁