专利名称：一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法
技术领域：
本发明属于天然食品和药物提取技术领域，特别涉及一种多酚氧化酶的提取方法。
背景技术：
多酹氧化酶(polyphenoloxidase, PP0)是一种广泛分布于真菌、植物、昆虫以及哺乳动物的金属蛋白酶。多酚氧化酶可分为三大类单酚单氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase)、双酹氧化酶(儿茶酹氧化酶catechol oxidse)和漆酶(laccase)。在这三大类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪 氨酸酶。在食品加工和果蔬生产中，多酚氧化酶是植物体氧化褐变的主要原因之一，对食品的变质有很大的损害作用。然而，从植物生理学角度考虑，多酚氧化酶在植物自防御系统里发挥重要作用，是其防御虫害、菌害的关键因素。多酚氧化酶是酚类代谢系统的关键性酶，能催化酚类转化成醌类，醌类与木质素构成保护性屏蔽而使细胞免受病菌的侵害，另外也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。目前，多酚氧化酶在黄瓜对黑星病的抗性，苹果对轮纹病的抗性，香蕉对束顶病的抗性，柠檬对流胶病的抗性，甘薯对蔓割病的抗性，水稻对白叶枯病的抗性的研究中取得了较大的进展。这方面的发展无疑促进了多酚氧化酶取代部分农药的发展，对环境保护和资源利用具有深远意义。另外，在茶叶的加工过程中，多酚氧化酶发挥的作用尤为突出，除了少量的绿茶、黄茶以外，大部分的茶叶发酵加工都是基于多酚氧化酶的催化氧化作用。研究发现利用外源的多酚氧化酶对发酵过程中的茶叶进行处理，可以改善茶叶的风味和口感，明显提高成茶的TF含量，减少TB含量。除此之外，多酚氧化酶在含酚废水的处理、环境中酚类毒物的降解、饮料加工、食用和药用菌生产、饲料工业及医药卫生等各个领域有着广泛应用。而利用微生物发酵合成酪氨酸酶也已成为研制治疗白瘫风、帕金森病和老年痴呆症等疾患药物的努力方向。随着科学技术的进步，多酚氧化酶的应用技术会越来越广泛，这就对多酚氧化酶的提取纯化技术提出了要求。签{Nelumbo nucifera, feerto.),是多年生草本植物,分布于世界各地,尤其以中国、印度和日本的栽种面积最广。我国是莲生产面积最广的国家，栽种区域主要分布于福建、江西、湖北和安徽等省份。莲蓬，是莲子生产过程中产生的副产物，一般被农户或生产商丢弃，造成很大的资源损失和环境污染。莲蓬富含多酚氧化酶，是多酚氧化酶的良好生物来源。莲蓬的蛋白含量比较低，从莲蓬中提取多酚氧化酶，减少了杂蛋白分离的难度。另外，提取过程中主要的干扰成分是一些水溶性的多酚或者生物碱成分，分子量较小，易于分离，这就保证了多酚氧化酶较高的提取率。这些优点是目前一些从果蔬或者发酵产物提取多酚氧化酶无法比拟的。该发明采用的方法提取所得的多酚氧化酶具有非常高的纯度(97%以上)，为其在生物医药等领域的利用提供了工业生产的可能。总之，这种多酚氧化酶的提取利用的方法具有较高的社会价值和经济价值
发明内容
本发明的目的是提供一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法。本发明是通过以下技术方案实现的。本发明所述的一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，按如下步骤。(I)提取缓冲溶液的制备在0. r1. OmoI/L pH 5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液中加入Triton X-100、聚乙二醇和NaCl等破壁剂制得提取缓冲溶液，使该提取缓冲溶液含TritonX-100 0 5 g/100mL、聚乙二醇 0 5 g/100mL、NaCl 0.1 2. 0 g/100mL，2°C 5°C冷却处理。(2)取新鲜的或冷冻保藏去籽莲蓬，撕碎或切片，按照1:广1:5的料液比(g/ml)加入步骤(I)中的提取缓冲溶液，冰浴或冷冻等低温环境下匀浆后，超声波处理l(T20min，浆体在4°C 常温下静置2(T60min，静置过程中搅拌3飞次，过滤浆体，取清液；所得的清液在4°C 20°C条件下低温离心l(T20min，离心速率为4000^，弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末使其达到3(T40%的饱和度，4°C 20°C低温条件下离心 2(T40min，离心速率为8000 1300(^，弃去沉淀物，保留上清液；继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70 80%的饱和度，4°C 20°C条件下离心3(T60min，离心速率为1000(Tl500(k，弃去上清液，保留沉淀物；沉淀物用少量的0. r1. OmoI/L pH 5. 0 8. 0的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物。(3)将步骤(2)的粗提物分装于经过常规预处理的截留分子量l(T25kDa的透析袋，以水或者0. f0.3mol/L pH 5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液作为透析液，4°C条件下透析5^20h除盐。通过截留分子量l(T25kDa的超滤至合适的体积，即得到多酚氧化酶的粗提物。(4)将步骤(3)的多酚氧化酶粗提物按照上样体积柱床体积=l:l(Tl:50的比例，经过离子交换树脂柱，分别用水和0. 2^1. 0mol/L的梯度NaCl溶液洗脱；以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，收集酶活最高的占体积总量20-30%的洗脱液。再经凝胶柱用相同方法的洗脱和收集，得到酶活最高的占体积总量20-30%的洗脱液。用步骤(3)中方法透析处理，经过超滤或冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶。本发明步骤(I)所述的缓冲溶液中加入了破壁剂。本发明步骤(4)所述的离子交换树脂柱为DEAE-Sephadex A-25或DEAE-纤维素。本发明步骤(4)所述的凝胶柱为Sephacryl S-200或Sephadex-GlOO。经电泳检测，其纯度高达95%以上。取1. 95 ml PBS (pH 6.8，0. 2mol/L)，0. 5 ml浓度为20mmol/L儿茶素为底物，加入酶35iig，于35°C反应10 min，420nm处测定OD值，所测酶活符合米氏方程的酶反应动力学(Km=O. 0105mol/L)。定义I个酶活单位(U)为在以上测定条件下Imin引起的吸光度值改变0. 001所需的酶量。测得该酶的最大反应速度为Vmax=2. 58 X IO5 3. 96 X IO5 (U/min.g 酶)。经上述步骤提取的多酚氧化酶，提取率可达到约10mg/100g (纯酶/原料)，纯度可达95%以上，提取所得的酶的最大反应速度约为3. 5X105(U/min*g酶)。本发明解决了莲蓬副产物的利用问题，能提高莲产物的经济附加值，另外经过该发明获得的多酚氧化酶具有较高的纯度(95%以上)，得到的多酚氧化酶可广泛应用于食品和药品的生产与加工。
图1为本发明提取所得的莲多酚氧化酶的SDS-PAGE电泳图谱。A :经过硫酸铵沉淀后得到的莲多酚氧化酶；B :经过DEAE-Sephadex A-25柱层析后得到的莲多酚氧化酶；C 经过Sephacryl S-200凝胶柱层析后得到的莲多酹氧化酶；D :蛋白质Marker。图2为本发明提取所得的未失活的莲多酚氧化酶的圆二色谱图及二级结构组成结果。图3为本发明提取所得的失活后的莲多酚氧化酶的圆二色谱图及二级结构组成·结果。图4为本发明提取所得的莲多酚氧化酶对温度的耐受度。图5为本发明提取所得的莲多酚氧化酶对pH的耐受度。图6为本发明提取所得的莲多酚氧化酶对乙醇的耐受度。
具体实施例方式本发明将通过以下实施例作进一步说明。实施例1。取新鲜或者冷冻保藏去籽莲蓬100g，撕成碎片，加入300ml缓冲溶液，其中缓冲溶液由 0. 2 mmol/L pH 7. 0 的磷酸盐缓冲液,1. 5% (g/ml) Triton X-100,1% (g/ml)聚乙二醇和0.1% (g/ml) NaCl组成。冰浴条件下匀浆，超声波处理lOmin。将所得到的浆体置于4°C下静置30min，这个过程中搅拌浆体4次。过滤浆体，取清液。所得的清液在4°C条件下离心lOmin，离心速率为400(k。弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末以达到30%的饱和度。4°C条件下离心30min，离心速率为10000^，弃去沉淀物，保留上清液。在30%的饱和度基础上，继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到80%的饱和度。4°C条件下离心50min，离心速率为13000^，弃去上清液，保留沉淀物。沉淀物用20ml的0. 2mol/L pH 7. 0的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物。将此粗提物分装于经过预处理的截留分子量为20kDa的透析袋，以0. ro. 3mol/L pH 5. (T8. 0的磷酸盐缓冲液作为透析液，4°C条件下透析12h，过程中轻轻搅拌3次并更换3次透析液，此时大部分的盐已被除去。用截留分子量为20kDa的超滤膜超滤得30ml，即得到多酚氧化酶的粗提物。将多酚氧化酶粗提物按照1:5 (上样体积柱床体积)经过DEAE-Sephadex A-25离子交换树脂柱，分别用水和0. 2^1. 0mol/L的梯度NaCl溶液洗脱，用50个试管收集，每管收集20mL。以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，并收集酶活最高的10管。将10管收集液经过S印hacrylS-200凝胶柱，用上述相同的洗脱和收集方法，得到酶活最高的10管。合并这10管洗脱液，用上述方法透析处理。然后经过冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶10. 5mg,纯度达到96%。测得该酶的最大反应速度为Vmax=3. 96X 105(U/min*g酶)。实施例2。取新鲜或者冷冻保藏去籽莲蓬100g，撕成碎片，加入400ml缓冲溶液，其中缓冲溶液由 0.3 mmol/L pH 6. 8 的磷酸盐缓冲液,2. 0% (g/ml) Triton X-100, 2% (g/ml)聚乙二醇和0.2% (g/ml) NaCl组成。冰浴条件下匀浆，超声波处理20min。将所得到的浆体置于常温下静置30min，这个过程中搅拌浆体5次。过滤浆体，取清液。所得的清液在15°C下离心15min，离心速率为400(k。弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末以达到35%的饱和度。15°C下离心40min，离心速率为9000^，弃去沉淀物，保留上清液。在35%的饱和度基础上，继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到75%的饱和度。15°C下离心40min，离心速率为14000^，弃去上清液，保留沉淀物。沉淀物用IOml的0. 3mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物。将此粗提物分装于经过预处理的截留量为25kDa的透析袋，以水作为透析液，常温条件下透析10h，过程中轻轻搅拌4次并更换4次透析液，此时大部分的盐已被除去。用截留分子量为25kDa的超滤膜超滤得20mL，即得到多酚氧化酶的粗提物。将多酚氧化酶粗提物按照1:6 (上样体积柱床体积)经过DEAE-Sephadex A-25离子交换树脂柱，分别用水和0. 2^1. OmoI/L的梯度NaCl溶液洗脱，用50个试管收集，每管收集20mL。以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，并收集酶活最高的10管。将10管收集液经过S印hadex G-200凝胶柱，用相同的洗脱和收集方法，得到酶活最高的10管。合并这10管洗脱液，用上述方法透析处理。然后经过冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶10. lmg，纯度达到95%。测得该酶的最大反应速度为Vmax=3. 26 X IO5 (U/min.g 酶)。实施例3。取新鲜或者冷冻保藏去籽莲lOOKg，机械破碎成碎片，加入200L缓冲溶液，其中缓冲溶液由 0.8 mmol/L pH 7. 0 的磷酸盐缓冲液,1. 5% (g/ml) Triton X-100,1% (g/ml)聚 乙二醇和0.1% (g/ml) NaCl组成。冰浴条件下匀浆，分装，超声波处理20min。将所得到的浆体置于4°C下静置50min，这个过程中搅拌浆体5次。过滤浆体，取清液。所得的清液在常温条件下离心IOmin,离心速率为4000§"。弃去沉淀,保留上清液,往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末以达到40%的饱和度。常温条件下离心40min，离心速率为800(^，弃去沉淀物，保留上清液。在40%的饱和度基础上，继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70%的饱和度。4°C条件下离心60min，离心速率为10000^，弃去上清液，保留沉淀物。沉淀物用5L的0. 8 mo I/L pH 7. 0的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物。将此粗提物分装于经过预处理的截留量为20kDa的透析袋，以水作为透析液，4°C条件下透析15h，过程中轻轻搅拌4次并更换4次透析液，此时大部分的盐已被除去。用截留分子量为25kDa的超滤膜超滤得10L，即得到多酚氧化酶的粗提物。将多酚氧化酶粗提物按照1:5 (上样体积柱床体积)经过DEAE-纤维素离子交换树脂柱，分别用水和0. 2^1. 0mol/L的梯度NaCl溶液洗脱，以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，并收集酶活最高的占洗脱液总量的20-30%部分。经过Sephacryl S-200凝胶柱，用相同的洗脱和收集方法，得到酶活最高的占洗脱液总量的20-30%部分。经上述方法透析处理，超滤、冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶9. Sg,纯度达到95%。测得该酶的最大反应速度为Vmax=2. 58X 105(U/min*g酶)。实施例4。将按照实施例1提取所得的莲多酚氧化酶通过SDS-PAGE凝胶电泳方法鉴定分子量和纯度，通过圆二色谱鉴定失活前后的二级结构，结果图1、图2所示。由图1可知，莲多酚氧化酶的分子量大概在30 kDa。经过硫酸铵固体沉淀以后，酶的纯度比较低，含有超过20条蛋白条带。在莲多酚氧化酶的进一步纯化过程中，DEAE-Sephadex A_25柱层析纯化具有显著效果,经过这一步骤,蛋白的纯度大大增加，图谱显示条带数减少至9条。经过Sephacryl S-200凝胶柱层析后得到的莲多酚氧化酶纯度更高，条带数减少至7条，而且杂蛋白条带着色更浅，表明其含量更低，多酚氧化酶的纯度更闻。从图2显示的结果可知莲多酚氧化酶含有59. 0%a -螺旋，4. 3% P -折叠，14. 1%转角和22. 6%无规卷曲，这些数据显示该酶具有比较稳定的二级结构，可能具有耐极性的特性。失活后的莲多酚氧化酶其结构中的a-螺旋明显降低，表明此时的酶更加不稳定，更趋向于与其他化合物发生结合反应，而失去催化特性。对提取所得的莲多酚氧化酶进行温度，pH,和酒精耐受度检验，结果图3所示。从图3结果可以看出经过该发明提取所得的多酚氧化酶，其最适pH为8. 5、. 5之间，最适温度为80°C左右。另外该酶还具有较强的酒精耐受度，在酒精度为50%情况下依然能保持45%以上的酶活保存率，而在低于20%的酒精度情况下更能保持高于70%的酶活保存率。以上的实验结果表明，莲多酚氧化酶具有较强的抗逆抗极性的能力，能开发应用在各种极性环境中。 以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的等效变换，均应属于本发明保护的范围。
权利要求
1.一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，其特征是按如下步骤 (I)提取缓冲溶液的制备在O. f1. Omol/L pH 5. (Γ8. O的磷酸盐缓冲液中加入Triton X-100、聚乙二醇和NaCl等破壁剂制得提取缓冲溶液，使该提取缓冲溶液含TritonX-1OO 0 5 g/100mL、聚乙二醇 0 5 g/100mL、NaCl O. Γ2. O g/100mL，2°C 5°C冷却处理； (2)取新鲜的或冷冻保藏去籽莲蓬，撕碎或切片，按照1:5的料液比(g/ml)加入步骤(I)中的提取缓冲溶液，冰浴或冷冻等低温环境下匀浆后，超声波处理l(T20min，浆体在4°C 常温下静置2(T60min，静置过程中搅拌:Γ5次，过滤浆体，取清液；所得的清液在4°C 20°C条件下低温离心l(T20min，离心速率为4000^，弃去沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入(NH4)2SO4固体粉末使其达到3(Γ40%的饱和度，4°C 20°C低温条件下离心2(T40min，离心速率为800(Γ 3000^·，弃去沉淀物，保留上清液；继续往上清液中加入固体(NH4)2SO4固体粉末以达到70 80%的饱和度，4°C 20°C条件下离心3(T60min，离心速率为1000(Tl500(k，弃去上清液，保留沉淀物；沉淀物用少量的0. Γ1. OmoI/L pH 5. 0 8. O的磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提物； (3)将步骤(2)的粗提物分装于经过常规预处理的截留分子量l(T25kDa的透析袋，以水或者0. Γ0. 3mol/L pH 5. (Γ8. O的磷酸盐缓冲液作为透析液，4°C条件下透析5 20h除盐；通过截留分子量l(T25kDa的超滤至合适的体积，即得到多酚氧化酶的粗提物； (4)将步骤(3)的多酚氧化酶粗提物按照上样体积柱床体积=l:l(Tl:50的比例，经过离子交换树脂柱，分别用水和0. 2^1. Omol/L的梯度NaCl溶液洗脱；以儿茶素为底物测定多酚氧化酶的酶活力，收集酶活最高的占体积总量20-30%的洗脱液；再经凝胶柱用相同方法的洗脱和收集，得到酶活最高的占体积总量20-30%的洗脱液；用步骤(3)中方法透析处理，经过超滤或冷冻干燥得到纯化的多酚氧化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(I)所述的缓冲溶液中加入了破壁剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(4)所述的离子交换树脂柱为DEAE-Sephadex A-25 或 DEAE-纤维素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是步骤(4)所述的凝胶柱为SephacrylS-200或 Sephadex-GlOO。
全文摘要
一种从莲蓬中提取多酚氧化酶的方法，属于天然食品和药物提取技术领域。包括缓冲液萃取、硫酸铵盐析、柱层析等步骤，本发明提取率可达到约10mg/100g(纯酶/原料)，纯度可达95%以上，提取所得的酶的最大反应速度约为3.5×105(U/min g酶)，解决了莲蓬副产物的利用问题，能提高莲产物的经济附加值。
文档编号C12N9/02GK103013937SQ201210487120
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月27日 优先权日2012年11月27日
发明者邓泽元, 谢汝朋 申请人:南昌大学