补体4检测试剂的制作方法

专利名称：：补体4检测试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于测定人体体液成份的试剂组合，特别是测定人体血清中的补体4(C4)的检测试剂，可广泛应用在医学及生物化学
技术领域：
。技术背景补体是存在于血清及组织液中的一组具有酶样活性的球蛋白。补体系统由20多种血浆蛋白和血细胞受体组成，约占血清总蛋白的10%,补体4(C4)属于01球蛋白，分子量为20万，由肝细胞合成。C4是补体经典激活途径的一个重要组分，被Cls激活后被裂解为"和U两个片段，C4b激活期短，一部分与抗原抗体复合物及细胞表面结合，并与活化的Ga结合成G转化酶，参与补体经典激活途径。人血清中C4浓度的增高见于风湿热急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、心肌梗死、肝癌及各种类型的多关节炎等，人血清中C4浓度的降低见于系统性红斑狼疮、慢性活动性肝炎、多发性硬化性全脑炎、IgA肾病、胰腺癌晚期。已知测定补体4(C4)的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、这些方法都存在着操作繁琐，需要特殊的设备，样品需要预处理，不能进行批量样本分析和不能直接上全自动生化分析仪检测等缺点。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服上述
背景技术：
的不足，提供一种G检测试剂，其试剂应有操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强的特点，并且适用于各种类型的全自动生化分析仪。本发明提供的技术方案是补体4检测试剂，包括-a、一种使样品中C4抗原位点充分暴露、从而有利于与抗C4抗体试剂充分结合的C4反应剂，包括的成分及占反应剂的重量百分比为防腐剂0.01-1、稳定剂0.05-1、电解质0.1-10、高分子加速剂2-8、表面活性剂0.1-10和反应促进剂0.1-0.5，其余是5-200励1/L缓冲剂；b、一种与人血清中的C4抗原有高度特异反应性的抗C,抗体试剂，包括的成分及占抗C4抗体试剂的重量百分比为抗G抗体5-50、抗氧化剂0.001-0.5和稳定剂0.05-20，还包括防腐剂0.01-1、电解质0.1-10、高分子加速剂2-8、表面活性剂0.1-10，其余是5-200画1/L缓冲剂;c、一种用来与样品比较、进行结果计算的液体血清型恒定值校准剂，包括的成分及占校准剂的重量百分比为防腐剂0.01-1、稳定剂0.1-1、防霉剂0.05-0.1和适量C4抗原，其余是20—10O醒ol/L缓冲剂；所述的液体血清型恒定值校准剂分为五份，其中四份校准剂中加入的C4抗原含量分别是0.10-0.20g/L、0.25-0.35g/L、0.40-0.50g/L、0.52-0.70g/L，另l份a抗原不加。所述的四份校准剂中加入的C4抗原含量分别是0.15g/L、0.28g/L、0.40g/L和0.52g/L。所述的抗C4抗体来自羊、马、鼠或兔等哺乳动物。所述的校准剂中的缓冲液选自PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、双甘氨肽、二甘氨酸、硼酸盐中的一种或多种，PH值为5-10。所述的C4反应剂及抗C4抗体试剂中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲垸缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或多种，PH值为5-10。所述的C4反应剂及抗C4抗体试剂中的缓冲液优选磷酸盐，PH值为7.4-8.1。所述的稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛或人血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一种或多种。所述的表面活性剂选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂中的一种或多种。所述的表面活性剂优选非离子表面活性剂。所述的电解质可以是阴离子电解质或阳离子电解质。所述的电解质优选阳离子电解质中的氯化钠。所述的防腐剂选自叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂中的一种或多种。本发明的原理是利用抗原抗体反应，加入反应剂(即样品稀释液)，解除样本中抗原周围的电子层和水化层，使抗原位点充分暴露，然后加入抗C4抗体试剂；高特异反应性的抗C4抗体试剂与样本中相应的C4抗原反应，形成不溶性的抗原-抗体复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的C4含量成正比，在规定波长下测定该不溶性抗原-抗体复合物的吸光度值，与己知恒定的校准剂比较，通过公式△Au<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>△As式中AAu为以空白管吸光度为对照的样品管吸光度AAs为以空白管吸光度为对照的校准管吸光度Cs为校准剂中C4的浓度可计算出样本中G的含量。本发明提供的试剂使用时测得的数据准确度高、重复性好、抗干扰能力强；并且样本不用预稀释，采用血清型液体恒定值校准液后不需每批更改参数，因而操作简单，还适用于各种类型的全自动生化分析仪。具体实施方式本发明所提供的补体4检测试剂包括以下成份a、一种使样品中G抗原位点充分暴露，有利于与抗C4抗体试剂充分结合的G反应剂，即样品稀释液，包括防腐剂0.0卜1、稳定剂0.05-1、电解质O.1-10、高分子加速剂2-8，还可包括表面活性剂O.1-10和反应促进剂0.1-0.5，其余是5-200mmol/L缓冲剂；上述防腐剂、稳定剂、电解质、高分子加速剂、表面活性剂及反应促进剂的含量均为在C4反应剂中所占的重量百分比。b、一种与人血清中的C4抗原有高度特异反应性的抗C4抗体试剂，包括抗G抗体5-50、抗氧化剂0.001-0.5、稳定剂0.05-20，和防腐剂0.01-1、电解质0.1—10、高分子加速剂2-8、表面活性剂。1-10，其余是5—200腦1/L缓冲剂；上述抗C4抗体、抗氧化剂、稳定剂、防腐剂、电解质、高分子加速剂及表面活性剂的含量均为在抗C4抗体试剂中所占的重量百分比。作为双试剂使用时，C4反应剂和抗C4抗体试剂可以按3:1的体积比例进行组合搭配，也可以是4:1、5:1、或7:1。缓冲剂可以是磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液或硼酸缓冲液等，本发明优选磷酸盐缓冲液；缓冲液的ra值为5-10，本发明优选ra值为7.4-8.1，在此范围内反应效果最好。防腐剂可以是叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚或广谱杀菌剂，本发明从环保角度考虑，优选广谱杀菌剂。稳定剂的可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇或海藻糖。电解质的可以是阴离子或阳离子，本发明优选阳离子中的氯化钠(NaCl)。加速剂可以是聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000，本发明优选聚乙二醇6000。表面活性剂可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，本发明优选非离子表面活性剂，包括Theist、Tween系列、聚氧乙烯月桂醚系列、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯辛基苯醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚等，这些表面活性剂可以单独使用，也可以两种或两种以上混合使用。反应促进剂可以是溴化己二甲胺或聚凝胺。抗C4抗体可以是羊抗人C4抗血清、马抗人C,抗血清、鼠抗人C4抗血清、兔抗人C4抗血清等，这些血清均可外购获得，也可自制。抗氧化剂可以是丁基羟基茴香醚、硫代二丙酸二月桂酯、二丁基羟基甲苯、苯多酚、甘草抗氧化物、磷脂等。抗氧化剂可以先溶解在10-100ml丙二醇或乙醇中，然后加入到抗C4抗体试剂中。c、一种用来与样品比较、进行结果计算的液体血清型恒定值校准剂，包括、防腐剂0.01-1、稳定剂0.1-1、防霉剂0.05-0.1和适量"抗原，其余是2O-100mmol/L缓冲剂；上述防腐剂、稳定剂、防霉剂的含量均为在校准剂中所占的重量百分比。校准剂中C4浓度值有以下几个选择第l点为Og/L，可用生理盐代替；第2点为0.10-0.20g/L，优选0.15g/L;第3点0.25-0.35g/L，优选0.28g/L;第4点0.40-0.50g/L，优选O.40g/L;第5点0.52-0.70g/L;优选0.52g/L。液体血清型CV恒定值校准剂共分为四份，按照上述不同的C4浓度值加入相应的C,抗原。C4抗原可直接外购，或者自制。本发明的标准配置为每个上述双试剂和/或单试剂配置有4瓶不同C4浓度的校准剂，另外1瓶校准剂的G浓度为零。校准剂中的缓冲剂可以是PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、P0PS0、Tricie、甘氨酸、双甘氨肽、二甘氨酸、硼酸盐等；防腐剂可以是叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂等，可以单独使用或几种混合使用；防霉剂可以是丙酸钠、脱氧乙酸等，也可单独使用或几种混合使用；稳定剂可以是乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛(人)血清白蛋白、丙三醇、单糖、多糖等，可以单独使用或几种混合使用。以上所述的所有生化原料和试剂均可外购获得。根据本发明制备的产品在28'C避光条件下有效期为一年。以下实施例中的各成分含量，除标有明确的单位之夕卜，均为所占重量百分比。实施例一1、C,反应剂(R1)磷酸盐(缓冲剂)100咖ol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)5NaCL(电解质)10PEG-6000(高分子加速剂)6叠氮钠防腐剂)0.1溴化己二甲胺(反应促进剂)0.3乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.052、抗C4抗体试剂(R2)磷酸盐(缓冲剂)100mmol/L聚氧乙烯月桂醚(表面活性剂)5NaCL(电解质)10PEG-6000(髙分子加速剂)4叠氮钠(防腐剂)0.4乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.05兔抗人G抗血清15丁基羟基茴香醚(抗氧化剂)0.01甘露糖醇(稳定剂)53、液体血清型CV直定值校准剂CAPSO(缓冲剂)100,ol/L广谱杀菌剂(防腐剂)0.01乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.1牛血清白蛋白(稳定剂)0.5.丙酸钠(防霉剂)0.05液体血清型恒定值校准剂分为五份，将G抗原按照第1点为Og/L，第2点为0.15g/L;第3点为0.28g/L;第4点为0.40g/L;第5点为0.52g/L分别加入上述五份溶液中，然后用0.22um的滤膜抽滤除菌，放2-8匸保存。也可将试剂(Rl)与(R2)按3:l的体积比例混合，以作为单一试剂使用。实施例二1、d反应剂(Rl)TAPS(缓冲剂)150mmol/L聚氧乙烯苯基醚(表面活性剂)0.1NaCL(电解质)0.1PEG-8000(高分子加速剂)4.5广谱杀菌剂(防腐剂)0.01聚凝胺(反应促进剂)0.1氯化镁(稳定剂)1.02、抗(；抗体试剂(R2)TAPS(缓冲剂)5mmol/L聚氧乙烯苯基醚(表面活性剂)0.1NaCL(电解质)0.1PEG-6000(高分子加速剂)7广谱杀菌剂(防腐剂)0.01乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)2羊抗人C4抗血清50苯多酚(抗氧化剂)0.5氯化镁(稳定剂)13、液体血清型恒定值C4校准剂CAPS0(缓冲剂)20mraol/L苯酚(防腐剂)0.05丙三醇(稳定剂)1牛血清白蛋白(稳定剂)1脱氧乙酸(防霉剂)0.1液体血清型恒定值校准剂分为五份，将C4抗原按照第1点为0g/L，第2点为0.15g/L;第3点为0.28g/L;第4点为0.40g/L;第5点为0.52g/L分别加入上述五份溶液中，然后用0.22iim的滤膜抽滤除菌，放2-8。C保存。也可将试剂(Rl)与(R2)按7:l的体积比例混合，以作为单一试剂使用。实施例三1、"反应剂(R1)HEPES(缓冲剂)200mmol/L聚氧乙烯垸基苯基醚(表面活性剂)6.0NaCL(电解质)0.5PEG-8000(高分子加速剂)4.0对羟基苯甲酸乙酯(防腐剂)1.0聚凝胺(反应促进剂)0.5海藻糖(稳定剂)1.02、抗C4抗体试剂(R2)PIPES(缓冲剂)150mmol/LTheist(表面活性剂)10.0NaCL(电解质)0.5PEG-6000(高分子加速剂)2.0对羟基苯甲酸乙酯(防腐剂)1.0乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.05马抗人C4抗血清35二丁基羟基甲苯(抗氧化剂)0.3丙三醇(稳定剂)103、液体血清型恒定值C4校准剂甘氨酸(缓冲剂)100mmol/L广谱杀菌剂(防腐剂)0.07乙二胺四乙酸二钠(稳定剂)0.5牛血清白蛋白(稳定剂)1.0丙酸钠(防霉剂)0.8液体血清型恒定值校准剂分为五份，将C4抗原按照第1点为Og/L，第2点为0.15g/L;第3点为0.28g/L;第4点为0.40g/L;第5点为0.52g/L分别加入上述五份溶液中，然后用0.22um的滤膜抽滤除菌，放2-8"C保存。也可将试剂(Rl)与(R2)按4:l的体积比例混合，以作为单一试剂使用。以下为测定样品中C4含量的具体操作步骤，检测仪器为具有340nm波长，37x:恒温装置的生化分析仪、双试剂基本操作:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>将测量出的结果通过下列公式进行计算:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>AAu为以空白管吸光度为对照的样品管吸光度AAs为以空白管吸光度为对照的校准管吸光度Cs为校准剂中G的浓度便可计算出该样本中的G含量。二、单试剂基本操作<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>混匀，37X:孵育5分钟，在波长340nm处以空白管调零，读取各管的吸光度值。将测量出的结果通过下列公式进行计算:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>式中AAu为以空白管吸光度为对照的样品管吸光度AAS为以空白管吸光度为对照的校准管吸光度Cs为校准剂中C4的浓度便可计算出该样本中的G含量。权利要求1、补体4检测试剂，其特征在于该试剂包括a、一种使样品中C4抗原位点充分暴露、从而有利于与抗C4抗体试剂充分结合的C4反应剂，包括的成分及占反应剂的重量百分比为防腐剂0.01-1、稳定剂0.05-1、电解质0.1-10、高分子加速剂2-8、表面活性剂0.1-10和反应促进剂0.1-0.5，其余是5-200mmol/L缓冲剂；b、一种与人血清中的C4抗原有高度特异反应性的抗C4抗体试剂，包括的成分及占抗C4抗体试剂的重量百分比为抗C4抗体5-50、抗氧化剂0.001-0.5和稳定剂0.05-20，还包括防腐剂0.01-1、电解质0.1-10、高分子加速剂2-8、表面活性剂0.1-10，其余是5-200mmol/L缓冲剂；c、一种用来与样品比较、进行结果计算的液体血清型恒定值校准剂，包括的成分及占校准剂的重量百分比为防腐剂0.01-1、稳定剂0.1-1、防霉剂0.05-0.1和适量C4抗原，其余是20-100mmol/L缓冲剂；所述的液体血清型恒定值校准剂分为五份，其中四份校准剂中加入的C4抗原含量分别是0.10-0.20g/L、0.25-0.35g/L、0.40-0.50g/L、0.52-0.70g/L，另1份C4抗原不加。2、根据权利要求1所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的四份校准剂中加入的C4抗原含量分别是0.15g/L、0.28g/L、0.40g/L和0.52g/L。3、根据权利要求1或2所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的抗C4抗体来自羊、马、鼠或兔等哺乳动物。4、根据权利要求3所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的校准剂中的缓冲液选自PBS、Tris、TAPS、、HEPPS、CHES、CAPS、CAPSO、POPSO、Tricie、甘氨酸、双甘氨肽、二甘氨酸、硼酸盐中的一种或多种，PH值为5-10。5、根据权利要求3所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的C4反应剂及抗C4抗体试剂中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、PIPES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或多种，PH值为5-10。所述的C4反应剂及抗C4抗体试剂中的缓冲液优选磷酸盐，PH值为7.4-8.1。6、根据权利要求3所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、氯化镁、牛或人血清白蛋白乙二醇、甘露糖醇、海藻糖中的一种或多种。7、根据权利要求3所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的表面活性剂选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性离子表面活性剂中的一种或多种。8、根据权利要求3所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的电解质可以是阴离子电解质或阳离子电解质。9、根据权利要求3或4或5或6或7或8所述的补体4检测试剂，其特征在于所述的防腐剂选自叠氮钠、乙基汞硫代硫酸钠、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、苯酚、广谱杀菌剂中的一种或多种。全文摘要本发明涉及一种用于测定人体体液成份的试剂组合。目的是提供一种C₄检测试剂，该试剂应有操作简单、准确度高、重复性好、抗干扰能力强的特点，并且适用于各种类型的全自动生化分析仪。技术方案是补体4检测试剂，包括a.一种使样品中C₄抗原位点充分暴露、从而有利于与抗C₄抗体试剂充分结合的C₄反应剂，b.一种与人血清中的C₄抗原有高度特异反应性的抗C₄抗体试剂c、一种用来与样品比较、进行结果计算的液体血清型恒定值校准剂。文档编号G01N33/53GK101403748SQ20081016208公开日2009年4月8日申请日期2008年11月7日优先权日2008年11月7日发明者王贤理,凯蒙,蔡伟伟,蔡其浩申请人:王贤理