专利名称：检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒及制备方法和应用。
技术背景在最近十几年内科学家发现一些进入水生生态系统中的污染物，能够扰乱野生 生物和人类内分泌系统的正常功能。这一类化合物可能是自然存在的，如大豆木黄 酮、金雀异黄素等；也可能是人工合成的化合物，如垸基酚类化合物、多氯联苯类 化合物和杀虫剂等；还有的是工业生产的副产品，如二噁英等，这一类化合物统称 为内分泌扰乱化学物质。内分泌扰乱化学物质能够干扰人和动物体内激素的合成、 释放、运输、代谢，以及激素与受体的结合、功能的表达等一系列生物过程，从而 扰乱人和动物内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能，甚至对生物后代生殖功能 也能产生危害。这一类化合物都具有相似的性质如脂溶性、难于自然降解、生物放 大和生物累积，因而可以随着食物链逐级传递，对处于海洋食物链顶端的鱼类影响 尤其严重。最近研究表明鱼类出现的雄鱼雌性化、雌性贝类的雄性化、鱼类精子数 量的降低、种群的衰退等都与内分泌扰乱化学物质的污染密切相关；更为严重的是 人类食用了受内分泌扰乱化学物质污染的鱼类后，这些化合物能够转移到人体内， 对人类的健康产生严重的危害，能够造成人类癌症的增加、精子数量和质量的降低、 新生儿畸形及神经系统的疾病等。因而需要开发筛选和检测海洋内分泌扰乱化学物 质的试剂盒，并开展海洋环境的生态安全评价、养殖鱼类的食品安全评价。鱼类是海洋生态系统的重要组成部分，处于食物链的顶端，是开展海洋内分泌 扰乱化学物质评价的重要对象，由于鱼类与哺乳动物具有相似的内分泌系统，因而 还可以外推内分泌扰乱化学物质对人类产生的影响。雄性鱼类卵黄原蛋白的产生是 指示内分泌扰乱化学物质污染的重要生物标志物。卵黄原蛋白是卵黄蛋白的前体， 是一种大分子量的脂磷聚糖蛋白。卵黄形成期，在雌激素的刺激下卵黄原蛋白由肝 脏合成，并通过血液运输到发育的卵巢中，被卵巢吸收；在卵巢内，卵黄原蛋白裂 解成为两种卵黄蛋白卵黄脂磷蛋白和卵黄高磷蛋白，这两种蛋白贮存在卵中，作 为胚胎发育的营养源。卵黄原蛋白是雌鱼的特异性蛋白，只能在雌鱼卵黄形成期检 测到。但是由于雄鱼的肝脏中也有卵黄原蛋白基因，因而雌激素也能诱导雄鱼肝脏
合成和分泌卵黄原蛋白。除内源雌激素外，某些具有环境雌激素活性的内分泌扰乱 化学物质，即使低浓度的内分泌扰乱化学物质也能诱导雄鱼卵黄原蛋白的产生，起 到类似于内源雌激素的作用。与其他生物标志物相比，卵黄原蛋白检测方法简便， 能够直接指示内分泌扰乱化学物质的污染，而且还可以应用到鱼类食品安全的检测 与评价；此外在养殖领域还能指示雌鱼的生殖周期和性腺发育程度。真鲷在我国海 域广泛分布，同时也是主要的养殖鱼类，而且真鲷为肉食性，处于海洋食物链的顶 端，能够富集持久性有机污染物，因而可以用于监测近海内分泌扰乱化学物质污染 和实验室内分泌扰乱化学物质筛选等研究中。虽然国外也建立了针对海洋鱼类卵黄原蛋白的酶联免疫吸附检测试剂盒，但是 这些试剂盒检测的鱼类在我国没有分布，不能用于检测我国海洋内分泌扰乱化学物 质的污染程度。 发明内容本发明的目的在于提供一种检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒及制备方法 和应用，它能克服现有技术的上述缺点。一种检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒，包括1个盒体，盒体内有空白96 孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显 色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它还装有鼠 抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、真鲷卵黄原蛋白纯品1支。上述检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒的制备方法，其特征在于由下述步 骤组成l)制备真鲷卵黄原蛋白纯品；2)制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体；3) 将步骤l)中得到的真鲷卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的鼠抗真鲷卵黄原蛋白多 克隆抗体1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、封闭液、包被液、样 品稀释液、洗漆液、显色液、终止剂及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支放 在盒体内，得到检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒。上述检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒在海洋内分泌扰乱化学物质调査中 的应用。本发明利用酶联免疫吸附原理，提供了一种简便、高效、灵敏地检测海洋内分 泌扰乱化学物质的试剂盒。该试剂盒操作简便、快速，为检测我国海洋环境中的内 分泌扰乱化学物质提供了一种新的分析手段，还可以分析判断海洋环境中的鱼类受 到内分泌扰乱化学物质的影响以及内分泌扰乱化学物质的生态风险评价，此外还可 以用于养殖鱼类食品安全检测和卵巢性成熟程度测定。
具体实施方式
制备检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒时分为以下步骤(1) 制备真鲷卵黄原蛋白纯品将10mgl7"-雌二醇(17^estradiol,E2)溶于0.5mL无水乙醇，再加入0.5mL花生 油，充分混匀，配制17^-雌二醇乳状液。用17P-雌二醇乳状液进行真鲷腹腔注射， 注射剂用量为0.5mL/条，10天后再进行尾静脉取血，4°C8000g离心5min，获得含 卵黄原蛋白的血浆。取血浆lmL加入分子筛层析柱，填料为Sephacryl S-300,用含 0.07 MNaCl的25 mM Tris-HCl (pH7.5)洗脱，收集含真鲷卵黄原蛋白的样品用于离 子交换层析，填料为DEAE Sepharose Fast Flow,用含0.1M和0.2M NaCl的25 mM Tris-HCl进行不连续洗脱，采用部份收集器收集洗脱液，电泳鉴定后把含有真鲷卵 黄原蛋白纯品的等分试样-8(TC保存。(2) 制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体取纯化的真鲷卵黄原蛋白50mg与0.1 mL弗氏完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹 腔注射进行第1次免疫。两周后进行第2次免疫，取纯化的真鲷卵黄原蛋白10 mg 与0.1mL弗氏不完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹腔注射。以后每周注射l次，注射 液的剂量与第2次相同。于第5次注射后，在l周内连续注射两次，以加强免疫效 果，注射液的剂量均与第2次相同。小鼠尾静脉取血，采用双向扩散法测定抗血清 效价。小鼠眼眶动脉取血，获得抗血清用于制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体。 采用亲和层析法制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体，所用的亲和层析填料为 CNBr-activated Sepharose 4B，取上述纯化的真鲷卵黄原蛋白与之结合；将鼠抗血清 用PBS(由0.14M NaCl、 0.015M KH2P04、 0.075M Na2HP04、 0.027M KC1所组成， pH7.3)稀释后，加入层析柱中循环过夜；用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱抗体，收集抗 体加入保存剂，-S(TC保存。(3) 将制备的真鲷卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、 空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、封闭液、包被液、样品稀释液、洗涤 液、显色液、终止剂及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支装入盒体，构成本 发明的试剂盒。其具体组成如下1) 空白96孔酶标板1块；2) 真鲷卵黄原蛋白纯品l支，使用前用包被液稀释到所需浓度； 3) 阴性对照组血清1支，使用前用样品稀释液按1:200的体积比稀释；4) 鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支，使用前用样品稀释液按1:500的体积比 稀释；5) 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支，使用前用样品稀释液按1:1000的体 积比稀释；6) 包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂各1支，所述的包 被液为50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6;封闭液为含1% BSA和0.1% Tween-20的 150mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4;样品稀释液为含0.1% Tween-20的150mM磷酸盐 缓冲液，pH7.4;洗涤液为含0.05%Tween-20的150mM磷酸盐缓冲液，pH7.4;显 色液为用碳酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配置的0.4mg mL—1的邻苯二胺(OPD)溶液，使 用前加入H202 0.015mL;终止剂为0.5M H2S04。本发明的检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒在使用时分为以下步骤1) 在空白96孔酶标板中加入用包被液稀释了的真鲷卵黄原蛋白纯品、阴性对照 血清和待测血浆，100nL/孔，室温孵育2小时。弃去孔内溶液，用洗涤液洗涤96孔 酶标板4次02) 在96孔酶标板中加入封闭液，30(HiL/孔，室温下孵育0.5小时。弃去孔内溶 液，用洗涤液洗涤96孔酶标板4次。3) 在96孔酶标板中加入用样品稀释液稀释了的鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗 体，100nL/ L， 4t:静置过夜。次日弃去孔内溶液，用洗涤液洗漆96孔酶标板4次。4) 在96孔酶标板中加入用样品稀释液稀释了的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二 抗，10(HiL/孔，室温孵育2小时。弃去孔内溶液，用洗涤液和三蒸水各洗涤96孔酶 标板2次。5) 在96孔酶标板中加入新配制的显色液，10(HiL/孔，于室温暗处反应5 30min。6) 待标准品呈现明显的黄色后加入终止剂，5(HiL/孔。7) 用酶标仪测定492nm波长下各孔的吸光值。8) 根据样品的光吸收强度在标准曲线上计算出其相应的浓度。9) 根据测定的雄性真鲷血浆中卵黄原蛋白浓度的高低，可以判定该鱼生活海域内 分泌扰乱化学物质污染的程度。
权利要求
1、一种检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒，包括1个盒体，盒体内有空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它还装有真鲷卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的真鲷卵黄原蛋白纯品为标 准浓度的真鲷卵黄原蛋白纯品。
3、 权利要求1所述的检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒的制备方法，其特 征在于由下述步骤组成l)制备真鲷卵黄原蛋白纯品；2)制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多 克隆抗体；3)将步骤l)中得到的真鲷卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的鼠抗真鲷 卵黄原蛋白多克隆抗体1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、 封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二 抗各1支共同放在盒体内，得到检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒。
4、 权利要求1所述的试剂盒在海洋内分泌扰乱化学物质的检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒及制备方法和应用。制备时，首先制备真鲷卵黄原蛋白纯品，其次制备鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体；然后将真鲷卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗真鲷卵黄原蛋白多克隆抗体1支、空白96孔酶标板1块，以及阴性对照组血清、包被液、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止剂及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同放在盒体内，得到检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒。本发明的检测海洋内分泌扰乱化学物质的试剂盒可以应用到海洋内分泌扰乱化学物质的检测中，能够灵敏、准确、方便的定量检测真鲷血液中、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白。
文档编号G01N33/543GK101398425SQ200810158209
公开日2009年4月1日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者汝少国, 潘宗保, 欣 邴 申请人:中国海洋大学