专利名称：定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
随着我国工业化程度和人民群众生活水平的不断提高，大量的工业废水和生活 污水排入到江河湖海中，造成了严重的水环境污染，不仅危害了野生生物的生存， 也严重威胁我国人民的健康。虽然这些污染物在环境中的浓度很低，但是能够干扰 人和动物体内激素的合成、释放、运输、代谢，以及激素与受体的结合、功能的表 达等一系列生物过程，从而扰乱人和动物内分泌系统、神经系统和免疫系统的机能， 甚至造成对生物后代生殖功能的潜在影响，这一类化学物质统称为内分泌扰乱化学 物质。为了减少内分泌扰乱化学物质的危害，亟需制备能够快速检测水环境中的内 分泌扰乱化学物质的试剂盒。
雄鱼卵黄原蛋白(vitellogenin, VTG)的产生是指示水环境中内分泌扰乱化学物质 污染的主要生物标志物。鱼类卵黄原蛋白是卵黄蛋白的前体，是一种大分子量的脂 磷聚糖蛋白。卵黄形成期，在雌激素的刺激下卵黄原蛋白由肝脏合成，并通过血液 运输到发育的卵巢中，被卵巢吸收；在卵巢内，卵黄原蛋白裂解成为两种卵黄蛋白 卵黄脂磷蛋白和卵黄高磷蛋白，这两种蛋白贮存在卵中，作为胚胎发育的营养源。 卵黄原蛋白是雌鱼的特异性蛋白，只能在雌鱼卵黄形成期检测到。但是由于雄鱼的 肝脏中也有卵黄原蛋白基因，因而雌激素也能诱导雄鱼肝脏合成和分泌卵黄原蛋白。 除内源雌激素外，某些内分泌扰乱化学物质也能够诱导雄鱼卵黄原蛋白的产生，起 到类似于内源雌激素的作用，如垸基酚类化合物、邻苯二甲酸酯类化合物、有机氯 杀虫剂以及人工合成的雌激素乙炔雌二醇等；即使低浓度的内分泌扰乱化学物质也 能诱导雄鱼卵黄原蛋白的产生。因而，雄鱼卵黄原蛋白具有指示作用强、检测快速、 方便的特点。
目前国内外已建立了几种硬骨鱼类卵黄原蛋白的酶联免疫吸附试剂盒和放射性 免疫试剂盒，但这些试剂盒对仪器设备的要求较高；而且由于鱼类卵黄原蛋白具有 较强的种间特异性和鱼类地理分布的差异，需要制备使用方便、对仪器要求不高， 而且针对在我国广泛分布的本土鱼类卵黄原蛋白的检测试剂盒。而金鱼在我国分布
广泛，基础生理学研究充分，鱼体大小适中，既可以作为实验室内分泌扰乱化学物 质筛选的模式生物，也可以应用到水域内分泌扰乱化学物质的调查和风险评价工作 中，因而开发金鱼卵黄原蛋白的检测试剂盒具有广泛的应用前景和科学价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和 应用，它能满足现有技术的上述需求。
一种定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒，包括一个盒体，盒体内有PVDF膜1 张，显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二 抗各1支，其特征在于它还装有鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、金鱼卵黄原 蛋白纯品1支。
上述定性检测金鱼卵黄原蛋白试剂盒的制备方法，其特征在于由下述步骤组成 l)制备金鱼卵黄原蛋白纯品；2)制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；3)将步骤1) 中得到的金鱼卵黄原蛋白纯品l支、步骤2)得到的鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体 l支、PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化 物酶标记的羊抗鼠二抗各1支放在盒体内，得到定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒。 上述定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒在内分泌扰乱化学物质调査中的应用。 本发明的试剂盒利用抗原抗体之间的特异性结合能力，可灵敏、准确、方便地 检测金鱼血浆中、肝脏组织和肝细胞培养液中的卵黄原蛋白，其最低检测限为lOOng m1/1，为内分泌扰乱化学物质筛选、检测和生态环境风险评价提供了一个有效的手 段。
具体实施例方式
制备定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒时分为以下步骤 (l)制备金鱼卵黄原蛋白纯品
将10mgl7yS-雌二醇(17尽estradiol，E2)溶于0.5mL无水乙醇，再加入0.5mL花生 油，充分混匀，配制17/ -雌二醇乳状液。用17々-雌二醇乳状液进行金鱼腹腔注射， 诱导金鱼分泌卵黄原蛋白，注射剂的用量为O.lmL/条，IO天后再进行尾静脉取血， 4'C8000g离心5min，获得含卵黄原蛋白的血浆。取血浆lmL加入分子筛层析柱， 填料为Sephacryl S陽300，用含0.07 M NaCl的25 mM Tris-HCl (pH7.5)洗脱，收集含 金鱼卵黄原蛋白的样品用于离子交换层析，填料为DEAESepharose Fast Flow,用含 O.IM和0.2M NaCl的25 mM Tris-HCl进行不连续洗脱，采用部份收集器收集洗脱液，
电泳鉴定后把含有金鱼卵黄原蛋白纯品的等分试样-8(TC保存。
(2) 制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体
取纯化的金鱼卵黄原蛋白50mg与0.1 mL弗氏完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹 腔注射进行第1次免疫。两周后进行第2次免疫，取纯化的金鱼卵黄原蛋白10 mg 与0.1 mL弗氏不完全佐剂充分混匀，进行小鼠腹腔注射。以后每周注射l次，注射 液的剂量与第2次相同。于第5次注射后，在l周内连续注射两次，以加强免疫效 果，注射液的剂量均与第2次相同。小鼠尾静脉取血，采用双向扩散法测定抗血清 效价。小鼠眼眶动脉取血，获得抗血清用于制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体。
采用亲和层析法制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体，所用的亲和层析填料为 CNBr-activated Sepharose 4B,取上述纯化的金鱼卵黄原蛋白与之结合；将鼠抗血清 用PBS(由0.14M NaCl、 0.015M KH2P04、 0.075M Na2HP04、 0.027M KC1所组成， pH7.3)稀释后，加入层析柱中循环过夜；用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脱抗体，收集鼠 抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体加入保存剂，-S(TC保存。
(3) 将制备的金鱼卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、 PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标 记的羊抗鼠二抗各1支装入盒体，构成本发明的试剂盒。其具体组成如下
1) PVDF膜1张；
2) 金鱼卵黄原蛋白纯品l支，使用前用双蒸水稀释到lmgml/1;
3) 阴性对照组血清1支，使用前用双蒸水按1:100的体积比稀释；
4) 鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支，使用前用封闭液按1:200的体积比稀
释；
5) 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗1支，使用前用封闭液按1:500的体积比
稀释；
6) 显色液、封闭液、洗涤液各1支，所述的显色液为0.06%的3'-二氨基联苯胺 (DAB)的Tris-HCl， pH 7.6，用前每10 mL显色液加入10 30%的双氧水；封闭液 为含5%脱脂奶的TBST(由100 mM Tris-HCl、 150 mM NaCl、 0.05% Tween陽20所组 成，pH7.5);洗涤液为TBST。
本发明的定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒可用于内分泌扰乱化学物质的调 査。使用时分为以下步骤
l)将试剂盒中的金鱼卵黄原蛋白纯品、阴性对照组血清和待测的雄性金鱼血浆
样品稀释后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
2) 把电泳凝胶转印到PVDF膜上；
3) 用封闭液封闭PVDF膜上的非特异性结合位点，室温下振摇孵育，弃去溶液， 用洗涤液洗涤PVDF膜3次；
4) 加入用封闭液稀释的鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体，室温下振摇孵育，弃 去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；
5) 加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，室温下振摇孵育， 弃去溶液，用洗涤液洗涤PVDF膜3次；
6) 加入显色液显色，待蛋白质条带清晰后，弃去显色液，用蒸馏水终止显色反
应；
7) 在雄性金鱼血浆样品中发现有显色条带，表明该鱼生活的水域受到了内分泌 扰乱化学物质的污染。
权利要求
1、一种定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒，包括一个盒体，盒体内有PVDF膜1张，显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它还装有鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、金鱼卵黄原蛋白纯品1支。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金鱼卵黄原蛋白纯品为标准 浓度的金鱼卵黄原蛋白纯品。
3、 权利要求1所述的定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒的制备方法，其特征在 于由下述步骤组成l)制备金鱼卵黄原蛋白纯品；2)制备鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆 抗体；3)将步骤l)中得到的金鱼卵黄原蛋白纯品1支、步骤2)得到的鼠抗金鱼卵黄 原蛋白多克隆抗体1支、PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组 血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同装入盒体，得到定性检测金鱼 卵黄原蛋白的试剂盒。
4、 权利要求1所述的定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒在内分泌扰乱化学物质 调査中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒及其制备方法和应用。制备时，首先制备金鱼卵黄原蛋白纯品和鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体；然后将金鱼卵黄原蛋白纯品1支、鼠抗金鱼卵黄原蛋白多克隆抗体1支、PVDF膜1张，以及显色液、封闭液、洗涤液、阴性对照组血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗各1支共同装入盒体，得到定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒。所述的定性检测金鱼卵黄原蛋白的试剂盒可以应用到内分泌扰乱化学物质的调查中。本发明可灵敏、准确、方便地定性检测金鱼血液、肝脏组织及肝细胞培养液中的卵黄原蛋白，最低检测限为100ng mL<sup>-1</sup>。
文档编号G01N33/68GK101393220SQ200810158208
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者汝少国, 潘宗保, 欣 邴 申请人:中国海洋大学