一种高效的河蟹组织保存与rna提取的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及河蟹组织野外采集组织样本的保存W及高效提取RNA的方法，属于技 术应用领域。
【背景技术】
[0002] 河蟹，学名中华绒馨蟹化riocheir sinensis)，隶属于节肢动物口（Arthropoda)、 甲壳纲（Crus1:acca)、十足目（Decapoda)、方蟹科(Grapsidae )，绒馨蟹属巧riocheir)，在我 国广泛分布于南北沿海各地湖泊，主要分布于长江、迂河W及臨江流域，是我国最为重要的 水产养殖对象和经济蟹类之一。近年来，随着水产养殖的发展和养殖集约化程度的不断加 大，中华绒馨蟹种质的退化、爆发性疾病的发生、性早熟出现频率的加快等在带来巨大经济 损失的同时，也严重制约着其产业的可持续发展。运用新一代的高通量测序技术，W转录组 为平台，在全基因组范围内更深、更透彻地研究中华绒馨蟹的各项分子机制，对健康养殖、 病害防治和遗传育种具有很重要的实践意义。然而，在对中华绒馨蟹进行运些研究时，经常 需在野外进行采样。由于受时间、运输条件、样本重要性因素影响，不能对全部活体带回实 验室进行采样，而只能采取部分组织保存后带回实验室进行RNA等分析。若保存不当，会造 成后续RNA提取不成功或提取的得率很低，无法满足实验要求。因而，开发有效的组织保存 方法，对于后续RNA的提取十分重要。
[0003] 此外，发明人在较长时期的河蟹RNA提取试验中，发现无论是新鲜组织还是经过一 段时间保存的组织，其难度均高于其它水产动物。具体表现在RNA提取得率低、降解速度快、 易受DNA污染，难W满足后续实验的需要。由此可见，开发河蟹高质量的RNA提取方法是十分 重要的。另一方面，中华绒馨蟹常年栖息于淡水湖泊河流，但繁殖期间必须回到河口半咸水 域，而繁殖期间在河口半咸水域采集的组织样本无法快速提取RNA，运就需要有效的河蟹 RNA保存和提取方法。
[0004]
【发明内容】
[0005] 本发明人在近年来对中国各水系河蟹RNA提取的不断摸索过程中发现，通过完善 组织样本的保存方式及其提取后的纯化过程，可极大的提高提取RNA纯度，使其不受DNA、蛋 白质和无机试剂的污染，且可使提取的RNA完整性高，可适应于转录组测序实验等要求。
[0006] 本发明的目的在于提供一种河蟹组织保存和RNA高效提取的方法，是申请者在研 究实践中发展起来的稳定技术。使用该方法可保障组织样本保存的良好性和RNA提取的高 效性，提取的RNA纯度高、完整性佳、质量好，能满足转录组测序等高要求RNA。本发明不仅在 科学技术上，且在河蟹分子生物学的研究上具有十分重要的意义和价值。
[0007] 本发明提供的技术方案是:一种高效的河蟹组织保存与RNA提取的方法，包括下列 步骤： (1)组织样本保存：用无菌剪刀将短期新鲜组织样本剪成组织块，迅速浸于装在1.5ml 离屯、管中的化izol试剂中保存;或者将野外河蟹活体组织样本剪成组织块，按照1:10(质量 :体积）的比例，加入RNAs tore，于4 °C浸泡过夜后，转入-20°C或-80°C中长期保存； (2)总RNA的提取，步骤如下： a. 将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中，用组织研磨器研磨，縱满振荡； b. 离屯、，取上清液，加入氯仿;离屯、，取上清液再加入氯仿； C.离屯、，取上清液加入异丙醇； d.离屯、，弃上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精;离屯、，弃上清液，沉淀RNA后加入100%的 酒精。
[000引 e.离屯、后弃掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase-打ee水溶解。
[0009] 其进一步包括总RNA的纯化，步骤如下： a.向上步提取的RNA溶液中加入适量DNA酶，室溫解育。
[0010] b.向所得溶液中加入0-琉基乙醇和无水乙醇，放入吸附柱中，离屯、，弃废液。
[0011] C.向吸附柱中加入无水乙醇，离屯、;弃废液，空离屯、5min。
[001^ d.向吸附柱中加入适量RNase-free水，离屯、即得。
[0013] 优选地，在第(1)步中组织材料需要剪成2mm的组织块。
[0014] 优选地，所述的縱满振荡是将保存的样本于离屯、管中縱满振荡45s，室溫静置2分 钟。
[0015] 优选地，在第（1)步中，将河蟹活体长期野外组织样本剪成2mm的组织块，按照1:10 (质量:体积）的比例，加入RNAs tore，于4 °C浸泡过夜后，转入-20°C或-80°C中长期保存。
[0016] 本发明具有如下优点：上述方法中，所保存的河蟹各组织可用于RNA提取，且用此 方法提取的RNA纯度好、质量高、完整性好。本发明可有效保存河蟹各组织样本，解决了野外 采集组织样本RNA提取困难的问题;通过此方法提取的组织RNA质量好，可适用于RNA需求量 大的多种分子生物学实验，尤其是转录组的测序，解决了保存样本RNA提取得率低、质量差 的难题。该方法为河蟹多种分子机制的研究提供一项技术手段，具有重大的科学意义和实 用价值。
[0017]
【附图说明】
[0018] 图1为本发明提取的河蟹各组织RNA的电泳检测结果。
[0019] 图2为RNAstore保存样本提取的RNA电泳图。 图3为本发明提取的河蟹肝膜腺RNA的Agilent 2100检测结果。 图4为本发明提取的河蟹眼柄RNA的Agilent 2100检测结果。 图5为本发明提取的河蟹觸RNA的Agilent 2100检测结果。 图6为本发明提取的河蟹肌肉RNA的Agilent 2100检测结果。 图7为本发明提取的河蟹卵巢RNA的Agilent 2100检测结果。 图8为本发明提取的河蟹精巢RNA的Agilent 2100检测结果。
[0020]
【具体实施方式】
[0021 ]本发明的【具体实施方式】如下。
[0022] 一、 实验材料准备 1.5mL离屯、管若干、70%乙醇溶液、碎冰、Tr i ZO1试剂、RNAstore试剂、氯仿、异丙醇、0- 琉基乙醇、RNase-Free Spin Columns CR2(TIANGEN)、4°C离屯、机、活体中华绒馨蟹 二、 河蟹各组织的采集 1.短期新鲜样本的保存:在1.5mL离屯、管中加入ImL化izol试剂，将活体中华绒馨蟹 的各组织采集后立即放入Trizol中，转入-80°C冰箱储存。
[002：3] 2.野外样本的长期保存:取无菌RNase-free离屯、管，用无菌的剪刀、綴子将要保 存的组织剪成2mm左右的组织块，然后按照1:10(质量:体积）的比例，加入RNAstore,于4°C 浸泡过夜后，转入-20°C或-80°C可W长期保存，不影响RNA的提取。
[0024] S、总RNA的提取 1.在离屯、管中加入0.SmlTrizol溶液，将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中， 用组织研磨器研磨，在加入0.5ml化izol溶液，将离屯、管在縱满振荡器上震荡45s，使溶液 中各成分充分混合均匀，室溫下放置2分钟。
[00剧 2.放入提前遇冷的4°C离屯、机，13500转/分钟，离屯、5分钟。
[00%] 3.小屯、取上清液到另一离屯、管中，加入300UL的氯仿，用手剧烈摇晃15秒，使其充 分乳化，室溫静置5分钟待其分层。
[0027] 4.放入4°C的离屯、机中，12000转/分钟，离屯、15分钟。
[0028] 5.吸取上清500uL到另一离屯、管中，加入300uL的氯仿，上下颠倒混匀，室溫静置2 分钟，放入4°C的离屯、机中，12000转/分钟，离屯、5分钟。
[0029] 6.小屯、吸取200UL的上清液到另一离屯、管中，加入等体积异丙醇上下颠倒混匀30 秒，室溫静置10分钟。
[0030] 7.放入4。(：的离屯、机中，12000转/分钟，离屯、10分钟。
[0031] 8.弃掉上清液，向离屯、管中加入ImL的75%乙醇洗涂沉淀RNA，并用枪头轻柔吹打， 使RNA沉淀悬浮在乙醇溶液中。
[00创 9.放入4。(：的离屯、机中，12000转/分钟，离屯、2分钟。
[0033] 10.弃掉上清液，向离屯、管中加入ImL的100%乙醇洗涂沉淀RNA，并用枪头轻柔吹 打，使RNA沉淀悬浮在乙醇溶液中。
[0034] 11.放入4。(：的离屯、机中，12000转/分钟，离屯、5分钟。
[0035] 12.小屯、弃掉上清液，于室溫静置2分钟干燥RNA沉淀。
[0036] 13.加入50化的RNase-free d地20溶解，立即进行RNA纯化。
[0037] 四、RNA纯化 1.向提取的RNA溶液中加入2.5ul的DNaseI储存液，室溫下解育10分钟。
[0038] 2.将所得溶液中加入3.加 L的0-琉基乙醇和250uL的无水乙醇，充分混匀。
[0039] 3.将溶液放入RNase-Free Spin Colu皿S CR2离屯、柱的吸附住中，12000转/分钟 离屯、，弃掉收集管中的废液。
[0040] 4.向吸附柱中加入500uL无水乙醇，12000转/分钟离屯、，弃掉收集管中的废液 5.重复上步。
[0041 ] 6.13500转/分钟，空离屯、5分钟，去除残余的液体。
[0042] 7.向吸附柱中加入适量RNase-打ee水，离屯、，所得溶液为纯化后的RNA溶液。
[0043] 五、RNA检测 1. Nano化OP 2000分光光度计检测 取RNA溶液化L，混合均匀，用Nano化OP 2000分光光度计检测样品。若提取的RNA溶液其 0026日/0028日比值在1.8~2.2之间，01)26日/00 23日比值在1.40~1.80之间（如表一），表明提取的 RNA受蛋白质、DNA及其他有机试剂的污染少，可满足转录组测序等多种分子生物学实验。
[0044] 2.电泳检测 取RNA溶液2.化L，用1.5 %琼脂糖凝胶进行电泳（电压150V，时间ISmin )检测，在凝胶成 像分析系统中观察RNA条带的清晰度。
[0045] 经电泳检测，该方法提取的RAN可清晰辨别28S、18S(两条）W及5S四条RNA条带，并 且没有扩散的其他杂带。说明RNA提取的完整性较好，具体如图1所示，且用RNAstore溶液长 期保存的野外样本所提取的RNA完整性也较好，具体如图2所示。
[0046] 3.Agilent 2100 检测 将肝膜腺、眼柄、肌肉、觸、卵巢、精巢等河蟹各组织的RNA溶液用Agilent Bioanalyzer 进行毛细管电泳山日9111日巧electro地oresis)，并W软件的RIN(RNA Integrity Number) 分数进行评估，10为RNA完整性最好，0为最差。
[0047] 经检测，提取的肝膜腺、眼柄、肌肉、觸、卵巢、精巢等组织的RNA的RIN在8.0~9.5之 间（见表一、图3至图8 )，进一步说明RNA完整性很高。
[004引 棄一.义巧姐RNA、沈睛.nn。。。/ nn。。。前fiDncn/nri。。。估
【主权项】
1. 一种河蟹组织样本的保存和高效提取RNA的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 组织样本保存：用无菌剪刀将短期新鲜组织样本剪成组织块，迅速浸于盛有Trizol 试剂中保存；或者将河蟹活体长期野外组织样本剪成组织块，按照1:10(质量:体积）的比 例，加入RNAs tore，于4 °C浸泡过夜后，转入_20°C或_80°C中长期保存； (2) 总RNA的提取，步骤如下： a. 将保存的样本拿出，取适量组织放入Trizol中，研磨； b. 游祸振荡； c. 离心，取上清液，加入氯仿;离心，取上清液再加入氯仿； d. 离心，取上清液加入异丙醇； e离心，弃上清液，沉淀RNA后加入75%的酒精； f.离心，弃上清液，沉淀RNA后加入100%的酒精； 离心后弃掉上清液，干燥沉淀RNA，沉淀中加入RNase-free水溶解。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，其进一步包括总RNA的纯化，步骤如下： a. 向上步提取的RNA溶液中加入适量DNA酶，室温孵育； b. 向所得溶液中加入β-巯基乙醇和无水乙醇，放入吸附柱中，离心，弃废液； c. 向吸附柱中加入无水乙醇，离心;弃废液，空离心5min; d ·向吸附柱中加入适量RNase-free水，离心即得。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在第（1)步中组织材料需要剪成2mm的组织 块。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的漩涡振荡是将保存的样本于离心管 中漩涡振荡45s，室温静置2分钟。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在第（1)步中，将河蟹活体长期野外组织样 本剪成2mm的组织块，按照1:10 (质量:体积）的比例，加入RNAstore，于4 °C浸泡过夜后，转 入-20 °C或-80 °C中长期保存。
【专利摘要】本发明公开了一种野外保存河蟹各组织及其RNA的高效提取方法，其步骤包括：（1）组织采集和保存：用无菌剪刀将组织剪成2mm左右组织块，加入适量RNAstore溶液，4℃浸泡过夜后，转入-80℃冰箱保存。（2）总RNA提取：将储存的组织从-80℃冰箱拿出，放入Trizol中，在冰上用组织研磨器将其研磨碎，离心取上清，加氯仿，再离心取上清，加异丙醇，再离心，弃上清液后加75%乙醇洗涤RNA，离心，干燥沉淀后用RNase-free水稀释。（3）RNA纯化：利用DNA酶去除RNA中的DNA。本发明方法可对野外采集的河蟹各组织进行有效保存并对其RNA进行高效提取。提取的RNA质量好、完整性强、纯度高，可用于各种分子生物学分析，尤其在转录组测序方面，有很强的实用价值。
【IPC分类】C12N15/10, A01N1/02
【公开号】CN105713897
【申请号】CN201510579433
【发明人】陈晓雯, 王军, 王成辉
【申请人】上海海洋大学