专利名称：一种筛选多环芳烃降解菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选多环芳烃降解菌的方法。
技术背景 多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)是指两个或两个以上苯 环以链状、角状或串状排列组成的化合物，主要来自于木材、化石燃料、煤焦油产品或食物 等有机质的不完全燃烧，多环芳烃在环境中分布广泛，在大气、水体、土壤、沉积物和食品中 都有检出。多环芳烃大多数为有毒物质，许多有三致效应，即致癌、致畸变和致突变，迄今 为止已发现的多环芳烃类致癌物及其衍生物已经超过400种，不乏苯并(a)芘这样的强致 癌物质。多环芳烃具有的半挥发性、亲脂性、高生物蓄积性和难降解等特性，使其能够在环 境中长时间存在、长距离迁移并富集于生物体，给人类健康和生态系统安全造成长期而严 重的危害。因此，1998年，美国、加拿大和欧洲共32个国家订立的《关于长距离越境空气 污染物公约》中将多环芳烃明确定为必须控制的持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants, POPs)。环境中的多环芳烃除少部分可以发生光化学分解外，大部分主要依赖生物降解途 径慢慢消失，因此微生物降解是控制多环芳烃污染较为经济有效的方法。而多环芳烃降解 菌的获取正是研究和利用微生物降解多环芳烃能力的基础，同时环境样品中多环芳烃降解 菌的计数也可以辅助了解环境受污染的程度。平板培养能够较为便捷地筛选降解菌，但是对多环芳烃降解菌的筛选却比较困 难。因为多环芳烃在水中的溶解性极差，又易挥发，不能均勻地分散在固体培养基中，如果 在培养基中加入其它的有机助溶剂，则无法获得以多环芳烃为唯一碳源和能源的降解菌； 而且这些有机溶剂对细菌也有毒害作用，不利于降解菌的生长。目前，一般采用喷雾法、升 华法或包埋法制作的平板培养基来筛选多环芳烃降解菌。但是这些传统的筛选方法存在以 下缺点(1)操作过程比较繁琐、不容易控制(如制作平板时的温度和多环芳烃在培养基中 的均勻化)，而且需要的仪器较多(如喷雾器、耐热培养皿和加热器等)；(2)喷雾法和升华 法的操作过程可能污染周围的环境，而且容易被其它微生物污染；(3)喷雾法中的醚或丙 酮等有机溶剂对部分微生物有毒害作用，会杀灭一些多环芳烃降解菌；(4)不利于转座突 变等较大通量的分子生物学操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选多环芳烃降解菌的方法。本发明所提供的筛选多环芳烃降解菌的方法，是将待测样品接种在以多环芳烃为 唯一碳源的培养基中，培养得到多环芳烃降解菌。上述方法中，所述培养基为固体培养基，所述固体培养基表面覆有纤维素膜，所述 纤维素膜上加有多环芳烃。具体应用时，可以先将所述多环芳烃溶解于易挥发的有机溶剂中，再加到纤维素膜上。所述有机溶剂具体可为乙醚。上述方法中，所述多环芳烃为菲、蒽、芘或荧蒽等各种多环芳烃。所述纤维素膜为醋酸-硝酸混合纤维素膜，具体可为0. 45 μ m孔径的醋酸-硝酸 混合纤维素膜。上述方法中，所述以多环芳烃为菲，所述以菲为唯一碳源的培养基的组成为=NaCl 79. 45g/L、MgCl2 · 6H20 6. 9g/L、MgSO4 · 7H20 10. 45g/L、CaCl2 · 7H20 0. 75g/L、KCl 2. lg/ L、NaHC03 0. lg/L,NaBr 0. 25g/L、(NH4)2SO4 4. Og/L、微量元素溶液 lmL/L、菲 lmg/L，其余为 水；所述微量元素溶液的组成为Ca(NO3) 2 · 4H20 800mg/L、FeSO4. 7H20 400mg/L、 CuSO4 · 5H20 80mg/L、ZnSO4 · 7H20 40mg/L、MnSO4 · 4H20 40mg/L、NaMO4 · 2H208mg/L、H3BO3 6mg/L、K2HPO4 500mg/L，其余为水；所述培养基的pH值为7. 5。本发明方法克服了传统筛选方法(如喷雾法和升华法)中繁琐的操作步骤和对特 定仪器的需要，具有节省人工、操作简便、容易控制(如可以较好的控制培养基平板上多环 芳烃的沉积量和均勻化)、不易污染周围环境等优点，还避免了传统筛选方法中醚类或丙酮 等有机溶剂对一些多环芳烃降解菌的杀灭作用，从而能够更准确地估计待测样品中多环芳 烃降解菌的数量，而且能够进行转座突变等采用传统筛选方法无法开展的大通量的遗传操 作。
图1为采用本发明方法从油田土壤样本中筛选出的菲降解菌。
具体实施例方式下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1、多环芳烃降解菌的获得实验中所涉及的培养基和试剂的组成如下海盐合成培养基(SSDM)的组成为=NaCl79. 45g/L、MgCl2 · 6H20 6. 9g/L、 MgSO4 ·7Η20 10. 45g/L、CaCl2 · 7Η20 0. 75g/L、KCl 2. lg/L,NaHCO3 0. lg/L,NaBrO. 25g/L、微 量元素溶液lmL/L ；以上各成分的含量对应盐度为10%的培养基(培养基的盐度等于培养 基中各无机盐组分质量之和除以培养基的体积)，其它盐度的培养基可按此比例进行配制； 另含有(NH4)2SO4 4.0g/L，其余为水；采用5M KOH浓缩液调节培养基的pH至7. 5。其中，微 量元素溶液的组成为=Ca(NO3)2 · 4H20800mg/L、FeSO4. 7H20 400mg/L、CuSO4 · 5H20 80mg/L、 ZnSO4 · 7H20 40mg/L、MnSO4 · 4H20 40mg/L、NaMO4 · 2H20 8mg/L、H3BO3 6mg/L、K2HPO4 500mg/ L，其余为水。菲的乙醚溶液将菲溶解于乙醚中，配制为浓度为lmg/mL的菲的乙醚溶液。具体的筛选过程如下在盐度为5%的海盐合成培养基中加入琼脂糖，使其在培养基中的终浓度为 1. 5% 1. 8%，将培养基于0. 06MPa条件下灭菌20min，灭菌后的培养基趁热均勻倾倒于玻璃培养皿中，待培养基凝固后，放置于37°C使固体培养基表面的水分完全蒸发。在无菌条件下，用镊子夹住经灭菌的醋酸_硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径 0.45 μ m、直径90mm，购自北京经科宏达生化试剂生物技术公司)的边缘，轻轻放在上述配 制好的固体培养基表面，然后用涂布玻璃棒轻轻挤压并推平，使纤维素膜与培养基紧密贴 合，制成纤维素膜平板。取ImL浓度为lmg/mL的菲的乙醚溶液加入到上述纤维素膜平板上，迅速用涂布棒 进行涂布，使菲在纤维素膜平板上分布均勻；将培养皿盖上时留出5%的空隙，使乙醚溶液 能够蒸发逸出，大约5mim后把培养皿盖子完全盖好，此时菲已被均勻固定于纤维素膜上。 同时将不含菲的乙醚涂布在上述纤维素膜平板上作为空白对照。将采自山东省东营市仙河镇胜利油田的土壤样品加入到IOOmL盐度为5%的海盐 合成培养基中，常温条件下200r/min振荡30min ；吸取ImL悬浮液于离心管中，5000r/min 离心IOmin ；弃去上清液，再加入ImL加有盐度为5%的上述海盐合成培养基进行洗涤。以 上洗涤过程重复3次，最后一次离心后将菌体沉淀重悬于适量的盐度为5%的海盐合成培 养中并进行一系列梯度稀释，将稀释后的菌液涂布在上述含有菲的纤维素膜平板上和空白 对照平板上，将涂布后的平板置于30°C条件下静置培养15天。实验设三次重复。结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加菲作为碳源的平 板上，土壤样本中的微生物无法生长；相应的，在加有菲的平板上有菌株能够生长，说明 该菌株能够降解菲并以菲为唯一碳源生长；单位质量土壤样本中菲降解菌的平均数量为 5.6X106CFU/g，其中CFU为菌落形成数(colony-forming units)，土壤质量以干重计算。菌 株在含有菲的纤维素膜平板上的生长状况如图1所示，挑取其中的单菌落，分别命名为P-4 和A-1，对P-4和A-I分别进行富集培养。实施例2、菌株的鉴定一、菌株的形态特征上述实施例1筛选到的菌株P-4的菌落直径为2 4mm，呈圆形、光滑、隆起、奶 油色或微黄色、有光泽、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈弯杆状或螺旋状、无鞭 毛，没有运动性，大小为(1. 03 1. 65) μ mX (0. 33 0. 56) μ m。上述实施例1筛选到的菌株 A-I的菌落直径为2 4mm，呈圆形、光滑、隆起、黄 色、有光泽、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈杆状、无鞭毛，没有运动性，大小为 (1. 15 1. 40) μ mX (0· 50 0. 63) μ m。二、菌株的生长特性上述实施例1筛选到的菌株P-4和A-I均属于革兰氏阴性、好氧细菌。最适生长 PH值是7. 2，可生长pH范围是5. 5 9. 0 ；最适生长温度为30°C，可生长的温度范围为10 420C。菌株P-4的生长离不开无机盐，属于嗜盐微生物，能在0. 1 17%的盐度范围内进行 生长繁殖，适宜生长盐范围度为3 6%。菌株A-I属于中度嗜盐细菌，能在0. 05 27. 5% 的盐度范围内进行生长繁殖，适宜生长盐范围度为4 10%。三、菌株的生化特征对上述实施例1筛选到的菌株P-4和A-I分别进行碳源利用、糖类产酸、淀粉、明 胶和吐温80水解实验，测定其氧化酶、过氧化氢酶、DNA酶和脲酶活性，测定其硝酸盐还原 能力，结果如下
上述实施例1筛选到的菌株P-4除无法利用D-阿拉伯糖和α -乳糖产酸外，可利 用其它糖类，如蔗糖、麦芽糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖和D-葡萄 糖产酸；该菌株能水解吐温80和明胶，但不能水解可溶性淀粉；该菌株的氧化酶、过氧化氢 酶和尿素酶为阳性，DNA酶为阴性；该菌株能使硝酸盐还原为氮气；该菌株能利用戊五醇、 核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯醇、D-纤维二糖、D-果糖、龙胆二糖、α -D-葡萄糖、D-甘露 糖、D-山梨醇、松二糖、D-半乳糖酸内脂、葡萄糖酸、D-葡萄糖胺酸、α -酮戊二酸、D，L-乳 酸、奎宁酸/金鸡纳酸、D-葡萄糖二酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-谷氨酸、 甘氨酰-L-天门冬氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-焦谷氨酸作为唯一碳源和能源。上述实施例1筛选到的菌株A-I不能利用蔗糖、麦芽糖、α -乳糖和D-木糖产酸， 可利用D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖产酸；该菌株不 能水解吐温80、明胶和可溶性淀粉；该菌株有氧化酶、过氧化氢酶、脲酶和硝酸盐还原的活 性，但是没有DNA酶、亚硝酸还原的活性；该菌株能利用D-阿拉伯糖、纤维二糖、乳糖、酪氨 酸、L-天冬酰胺作为唯一碳源和能源。四、抗生素抗性 对上述实施例1筛选到的菌株Ρ-4和A-I分别进行抗生素抗性实验。结果表明，上述实施例1筛选到的菌株Ρ-4对抗生素中的氨苄青霉素、头孢噻酚 钠、克拉霉素、氯林霉素、红霉素、盘尼西林和万古霉素敏感；而对头孢曲松、头孢噻肟钠、环 丙沙星、庆大霉素、链霉素和四环素具有抗性。上述实施例1筛选到的菌株A-I对抗生素中的磺胺甲恶唑、氯林霉素和万古霉素 敏感；而对头孢曲松、头孢噻肟钠、头孢噻酚钠、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、氨苄青霉素、 克拉霉素、红霉素、盘尼西林和四环素具有抗性。五、细胞化学成分分析对上述实施例1筛选到的菌株Ρ-4和A-I分别进行呼吸醌和脂肪酸的检测。结果 表明，菌株Ρ-4和A-I均主要以辅酶Q9 (泛醌9)作为主要呼吸醌；菌株Ρ-4的细胞壁脂肪 酸中主要是十八碳ω 7c单不饱和脂肪酸(35. 00%)、十六碳饱和脂肪酸(25. 01%)、十六 碳ω 7c单不饱和脂肪酸(17. 89% )、十四碳饱和脂肪酸(6. 16% )和环式十七碳饱和脂肪 酸(5. 22% )，还含有少量的3-羟基十六碳饱和脂肪酸(3. 43% )、十八碳饱和脂肪酸(1. 66% )和3_羟基十四碳饱和脂肪酸，而菌株A_1 的细胞壁脂肪酸中主要包括十六碳饱和脂肪酸(27. )、十六碳《7c单不饱和脂肪酸 (24. 0% )、十八碳ω 7c单不饱和脂肪酸(21. 27% )、ω 8c_环式十九碳饱和脂肪酸(8. 0% ) 和3-羟基十二碳饱和脂肪酸，还含有少量的十二碳饱和脂肪酸(3. 84% )和十碳饱和脂肪 酸(2. 79% )0六、菌株的16S rRNA基因序列测定和系统发育分析对上述实施例1筛选到的菌株P-4和A-I分别进行16S rRNA基因序列测定和系 统发育分析。结果表明，上述实施例1筛选到的菌株P-4的16S rRNA基因序列如序列表中 序列1所示，与已发表的模式菌株厦门海旋菌(Thalassospira xiamenensis)、深海海旋 菌(Thalassospira profundimaris)禾口 卢森坦海方宠菌(Thalassospira lucentensis) 的16SrRNA基因序列的同源性分别为99. 2%，98.9%和98.0% ；上述实施例1筛选到的菌株A-I的16S rRNA基因序列如GenBank AccessionNo. EF421176所示，与盐单胞菌属 的模式菌株期望盐单胞菌DSM 9502T (Halomonas desiderata DSM 9502τ)、壁生盐单胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789T)、潘泰莱里亚盐单胞菌 DSM14789T (Halomonas pantelleriensis DSM 9661T)和坎帕尼亚盐单胞菌 DSM 14789T(Halomonas campaniensis DSM 15293τ)的16S rRNA基因序列的同源性分别为96. 0%、95. 6%、95. 5%和95. 3%，与盐 单胞菌属其它菌株的16S rRNA基因序列的相似性低于95%。七、DNA-DNA杂交分析将上述实施例1筛选到的菌株P-4与海旋菌属的模式菌株进行DNA-DNA杂交分 析，将上述实施例1筛选到的菌株A-I与盐单胞菌属的模式菌株进行DNA-DNA杂交分析。结果表明，上述实施例1筛选到的菌株P-4的DNA与已发表的模式菌株厦门海旋 菌(T. xiamenensis)、深海海旋菌(T. profundimaris)和卢森坦海旋菌(T. Iucentensis)的 DNA同源性都比较低，分别为39 %、12 %和3 %。且该菌株的G+C摩尔百分含量为61. 6 %， 而厦门海旋菌、深海海旋菌和卢森坦海旋菌的G+C摩尔百分含量分别为52. 6%、47. 0%和 54. 7%。基于以上测定结果，将上述实施例1筛选到的菌株P-4鉴定为仙河海旋菌 (Thalassospira xianhensis) P-4，并于2009年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研 究所)，保藏登记号为CGMCC Na 2942。上述实施例1筛选到的菌株A-I的与已发表的盐单胞菌属的模式菌株潘泰莱 里亚盐单胞菌 DSM 9661T(Halomonaspantelleriensis DSM 9661τ)和壁生盐单胞菌 DSM 14789T (Halomonas mural is DSM 14789τ)的 DNA 同源性都比较低，分别为 11 % 和 18%。且 该菌株的G+C摩尔百分含量为67. 1 %，而潘泰莱里亚盐单胞菌DSM9661T和壁生盐单胞菌 DSM 14789τ的G+C摩尔百分含量分别为65. 0%禾口 62. 4% 基于以上测定结果，将上述实施例1筛选到的菌株A-I鉴定为仙河盐单胞菌 (Halomonas xianhensisM-l，并于2009年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)， 保藏登记号为CGMCC Na 2941。实施例3、降解多环芳烃能力的测定1、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Na 2942 降解菲能力的测定将菲溶于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；在盐度为5%的上述实施例1的海盐合成培 养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为0. 1%，同时在培养基中加入上述过滤除菌 的菲溶液，使菲在培养基中的终浓度为100mg/L。将仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Na 2942 按照 5 % 的接种 量接入上述培养基中，在30°C、转速为200r/min的好氧避光条件下培养10d。同时，以 不加菲但是加入二甲基甲酰胺的培养基作为对照，用于检查仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Na 2942是否能利用二甲基甲酰胺；以不接种细菌的作为空白对照， 用于扣除菲挥发的影响；以接种仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ns 2942 死菌体的作为死菌对照，用于扣除菌体吸附的影响。
培养过程中，定时取样，利用高效液相色谱法(HPLC)测定菲的降解率；Waters600E液相色谱仪，色谱柱为Supelcosil LC18-DB,流动相(甲醇和水，体积比为 80 20)，流速 lmL/min，检测波长 254nm。实验设三次重复。结果表明，仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Na 2942在9天内对菲的平均降解速率可达10. 8mg/(L · d)。2、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ns 2942 降解萘的性能将萘溶于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；在盐度为5%的上述实施例1的海盐合成培 养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为0. 1%，同时在培养基中加入上述过滤除菌 的萘溶液，使萘在培养基中的终浓度为100mg/L。将仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Na 2942 按照 5% 的接种量 接入上述培养基中，在30°C、转速为200r/min的好氧避光密封(为保证氧气供给，300mL培 养瓶中加30mL培养基)条件下培养10d。同时，以不加萘但是加入二甲基甲酰胺的培养基 作为对照，用于检查仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis)P-4CGMCC Ns 2942是否能利用 二甲基甲酰胺；以不接种细菌的作为空白对照，用于扣除萘挥发的影响；以接种仙河海旋 菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Na 2942死菌体的作为死菌对照，用于扣除菌体 吸附的影响。培养IOd后取样，利用高效液相色谱法(HPLC)测定萘的降解率；Waters 600E液 相色谱仪，色谱柱为Supelcosil LC18-DB,流动相(甲醇和水，体积比为80 20)，流速ImL/ min，检测波长276nm。实验设三次重复。结果表明，培养IOd后，加有萘的含活菌样本中未检出萘，而加 有萘的空白对照和含死菌对照中均检出明显的萘；加有二甲基甲酰胺的含活菌对照、加有 萘的空白对照和含死菌对照中始终没有颜色变化，而加有萘的含活菌样本中逐渐由无色变 为黄色，说明仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Na 2942能够降解萘。3、仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Ns 2942 降解芘的性能将芘溶解于乙醚中，配制成为浓度为lmg/mL的溶液。在盐度为5%的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1. 5 1. 8%的琼脂 糖后，0. 06MPa条件下灭菌20min，随后趁热将培养基均勻倾倒于玻璃培养皿中，等培养基 凝固后，放置于37°C环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面 覆上已灭菌的醋酸_硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0. 45 μ m、直径90mm，购自北京经 科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加ImL上述配制的浓度为lmg/mL的芘的乙醚溶液 并涂布均勻，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含芘的乙醚涂布在上述纤维素膜 平板上作为空白对照。将仙河海旋菌(Thalassospiraxianhensis) P-4CGMCC Na 2942 接种于 SSDMY 液体 培养基中，常温条件下140r/min振荡培养4天；吸取ImL菌悬液于离心管中，5000r/min离 心IOmin ；弃去上清液，将菌体沉淀涂布在上述含有芘的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上， 将涂布后的平板置于30°C条件下静置培养15天。结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加芘作为碳源的平板 上,仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis)P-4CGMCC Na 2942无法生长；相应的，在加有 芘的平板上仙河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Na 2942能够生长，说明仙 河海旋菌(Thalassospira xianhensis) P-4CGMCC Na 2942能够降解芘并以芘为唯一碳源生长。4、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941 降解菲能力的测定 将菲溶于二甲基甲酰胺中，过滤除菌；在盐度为5%的上述实施例1的海盐合成培 养基中加入酵母粉，使其在培养基中的终浓度为0. 5%，同时在培养基中加入上述过滤除菌 的菲溶液，使菲在培养基中的终浓度为100mg/L。将仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Na 2941 按照 5% 的接种量接 入上述培养基中，在30°C、转速为200r/min的好氧避光条件下培养10d。同时，以不加菲但 是加入二甲基甲酰胺的培养基作为对照，用于检查仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCCN2 2941是否能利用二甲基甲酰胺；以不接种细菌的作为空白对照，用于扣除菲挥 发的影响；以接种仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis)A-ICGMCCNs 2941死菌体的作为死 菌对照，用于扣除菌体吸附的影响。培养过程中，定时取样，利用高效液相色谱法(HPLC)测定菲的降解率； Waters600E液相色谱仪，色谱柱为Supelcosil LC18-DB,流动相(甲醇和水，体积比为 80 20)，流速 lmL/min，检测波长 254nm。实验设三次重复。结果表明，仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941在10天内能将100mg/L的菲全部降解，对菲的平均降解速率可达IOmg/ (L · d)。5、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941 降解蒽的性能将蒽溶解于乙醚中，配制成为浓度为lmg/mL的溶液。在盐度为5%的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1. 5 1. 8%的琼脂 糖后，0. 06MPa条件下灭菌20min，随后趁热将培养基均勻倾倒于玻璃培养皿中，等培养基 凝固后，放置于37°C环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面 覆上已灭菌的醋酸_硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0. 45 μ m、直径90mm，购自北京经 科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加ImL上述配制的浓度为lmg/mL的蒽的乙醚溶液 并涂布均勻，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含蒽的乙醚涂布在上述纤维素膜 平板上作为空白对照。将仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis) A-ICGMCC Na 2941 接种于 SSDMY 液体培 养基中，常温条件下140r/min振荡培养4天；吸取ImL菌悬液于离心管中，5000r/min离心 IOmin ；弃去上清液，将菌体沉淀涂布在上述含有蒽的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上，将 涂布后的平板置于30°C条件下静置培养15天。结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加蒽作为碳源的平板 上，仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941无法生长；相应的，在加有蒽 的平板上仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941能够生长，说明仙河盐 单胞菌(Halomonas xianhensis) A-1CGMCC Ns 2941能够降解蒽并以蒽为唯一碳源生长。6、仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941 降解荧蒽的性能将荧蒽溶解于乙醚中，配制成为浓度为lmg/mL的溶液。在盐度为5%的上述海盐合成培养基中加入质量百分含量为1. 5 1. 8%的琼脂 糖后，0. 06MPa条件下灭菌20min，随后趁热将培养基均勻倾倒于玻璃培养皿中，等培养基 凝固后，放置于37°C环境中，使固体培养基表面的水分完全蒸发。随后在平板培养基的表面覆上已灭菌的醋酸-硝酸混合纤维素膜(微孔滤膜，孔径0. 45 μ m、直径90mm，购自北京经 科宏达生化试剂生物技术公司)，在膜上加ImL上述配制的浓度为lmg/mL的荧蒽的乙醚溶 液并涂布均勻，待乙醚完全挥发后，盖好平板待用。同时将不含荧蒽的乙醚涂布在上述纤维 素膜平板上作为空白对照。将仙河盐单胞菌(Halomonasxianhensis) A-1CGMCC Na 2941 接种于 SSDMY 液体培 养基中，常温条件下140r/min振荡培养4天；吸取ImL菌悬液于离心管中，5000r/min离心 IOmin ；弃去上清液，将菌体沉淀涂布在上述含有荧蒽的醋酸-硝酸混合纤维素膜平板上， 将涂布后的平板置于30°C条件下静置培养15天。结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加荧蒽作为碳源的平 板上，仙河盐单胞菌(Halomonas xianhensis)A-ICGMCC Na 2941无法生长；相应的，在加有 荧蒽的平板上仙河盐单胞 菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941能够生长，说明仙 河盐单胞菌(Halomonas xianhensis) A-ICGMCC Na 2941能够降解荧蒽并以荧蒽为唯一碳源 生长。
权利要求
一种筛选多环芳烃降解菌的方法，是将待测样品接种在以多环芳烃为唯一碳源的培养基中，培养得到多环芳烃降解菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养基为固体培养基，所述固体培养 基表面覆有纤维素膜，所述纤维素膜上加有多环芳烃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述多环芳烃先溶解于易挥发的有机溶 剂中，再加到纤维素膜上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述有机溶剂为乙醚。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述多环芳烃为菲、蒽、芘或荧蒽。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述纤维素膜为醋酸_硝酸混合纤维素膜。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述多环芳烃为菲，所述以菲为 唯一碳源的培养基的组成为:NaCl 79. 45g/L、MgCl2 6H20 6. 9g/L、MgS04 7H20 10. 45g/L、 CaCl2 '7H20 0. 75g/L、KCl 2. lg/L、NaHC03 0. lg/L、NaBrO. 25g/L、(NH4) 2S04 4. Og/L、微量元 素溶液lmL/L、菲lmg/L，其余为水；所述微量元素溶液的组成为:Ca(N03)2 4H20 800mg/L、FeS04. 7H20 400mg/L、 CuS04 5H20 80mg/L、ZnS04 7H20 40mg/L、MnS04 4H20 40mg/L、NaM04 2H208mg/L、H3B03 6mg/L、K2HP04 5 00mg/L，其余为水； 所述培养基的pH值为7.5。
全文摘要
本发明公开了一种筛选多环芳烃降解菌的方法。该方法是将待测样品接种在以多环芳烃为唯一碳源的培养基中，培养得到多环芳烃降解菌。本发明方法克服了传统筛选方法(如喷雾法和升华法)中繁琐的操作步骤和对特定仪器的需要，具有节省人工、操作简便、容易控制(如可以较好的控制培养基平板上多环芳烃的沉积量和均匀化)、不易污染周围环境等优点，还避免了传统筛选方法中醚类或丙酮等有机溶剂对一些多环芳烃降解菌的杀灭作用，从而能够更准确地估计待测样品中多环芳烃降解菌的数量，而且能够进行转座突变等采用传统筛选方法无法开展的大通量的遗传操作。
文档编号C12R1/01GK101838629SQ20091008001
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月17日 优先权日2009年3月17日
发明者宁大亮, 王慧, 赵百锁 申请人:清华大学