枯草芽孢杆菌的高丝氨酸脱氢酶基因灭活方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种枯草芽抱杆菌的高丝氨酸脱氨酶基因灭 活方法。
【背景技术】
[0002] 赖氨酸是人和动物的必需氨基酸之一，赖氨酸不足时会限制其它氨基酸的利用， 发展赖氨酸生产对提高动物饲料利用效率具有重要的意义。工业上生产赖氨酸主要W发酵 法为主，但由于生产菌株产酸水平较低，生产规模较小，生产成本较高，难W和进口产品竞 争等问题，因此，选育高产赖氨酸菌种成为当务之急。
[0003] 目前，基因工程上通常采用基因敲除技术而获得比原始菌株高产赖氨酸的菌株， 该敲除菌主要是通过同源重组的方式获得，通过将带有高丝氨酸脱氨酶基因的质粒转化至 感受态细胞，筛选而来，但该方法步骤较多。常规方法是先扩增高丝氨酸脱氨酶基因L臂， 再扩增高丝氨酸脱氨酶R臂，然后将L臂和R臂连接，在L臂和R臂中间插入抗性基因，用 获得的DNA片段或质粒转化至细菌，通过同源重组获得基因敲除菌株。如何开发一种简单、 快速的高丝氨酸脱氨酶基因灭活方法将有利于枯草芽抱杆菌高丝氨酸脱氨酶基因的灭活， 并能获得赖氨酸产量高于原始菌株的突变株。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种简单、快速的枯草芽抱杆 菌的高丝氨酸脱氨酶基因灭活方法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种枯草芽抱杆菌的高丝氨酸 脱氨酶基因灭活方法，该方法包括W下步骤：
[0006] a、构建用于同源重组的PCR产物的质粒，该重组质粒由pMD 18-T载体、卡纳霉素抗 性基因和高丝氨酸脱氨酶基因组成，其中，该同源重组的DNA片段含有用于替代待灭活基 因的高丝氨酸脱氨酶基因W及在高丝氨酸脱氨酶基因中间部位炬sePl酶切位点）插入的 卡纳霉素抗性基因；
[0007] b、从重组质粒上PCR扩增高丝氨酸脱氨酶基因W及在高丝氨酸脱氨酶基因中间 部位插入的卡纳霉素抗性基因，使PCR产物单链化，将所述单链PCR产物转化至枯草芽抱杆 菌感受态细胞，得到转化子，并筛选出阳性转化子，即高丝氨酸脱氨酶基因灭活的突变株。 在本发明中，将所述单链PCR产物转化至枯草芽抱杆菌感受态细胞的方法为电转化法，当 然，也可采用本领域内的其它现有常规方法。
[000引其中，位于该卡纳霉素抗性基因两侧的满足同源重组要求的侧翼序列与待灭活基 因两侧的侧翼序列相同，其基因序列为在高丝氨酸脱氨酶基因的BsePl酶位点插入了卡纳 霉素抗性基因的基因片段。
[0009] 本发明方法相对现有将高丝氨酸脱氨酶重组质粒转化枯草芽抱杆菌感受态细胞 的技术，更为简单、省时。本方法直接扩增高丝氨酸脱氨酶全长基因，直接通过BsePl酶切 后插入抗性基因，方法简单快速有效，且获得的突变株的赖氨酸含量要明显高于原始菌株。
【附图说明】
[0010] 图1是枯草芽抱杆菌PA105和高丝氨酸脱氨酶基因灭活菌株的PCR电泳结果图。
[001U 其中；1:2000bp MA服ER，2:5000bp MA服ER，3: W枯草芽抱杆菌PA105细菌培养物 为模板扩增高丝氨酸脱氨酶基因所得的PCR片段1300bp左右，4: W突变株（枯草芽抱杆菌 化13-hom: :Km)细菌培养物模板扩增高丝氨酸脱氨酶基因所得的PCR片段2300bp左右。
【具体实施方式】
[0012] W下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围，如未特别说明，本发 明所用方法为常规技术，所用试剂均购自生化商店。
[0013] 实施例1枯草芽抱杆菌PA105高丝氨酸脱氨酶基因灭活
[0014] 枯草芽抱杆菌PA105由本申请人所在实验中屯、提供，保藏编号为CCTCC; M2011328。
[0015] 1、枯草芽抱杆菌感受态制备用培养基：
[0016] GMI 培养基：1血lOXSpizizen salts、0. 1血 10 % 酵母粉、0. 25血20 % 葡萄糖、 0. 2血1 %水解酪蛋白、0. 2血0. 25%所需氨基酸，补充灭菌蒸馈水至总体积10血。
[0017] GMII 培养基：1 血 10XSpizizensalts、0. 05血 10 % 酵母粉、0. 25血20 % 葡萄 糖、0.041111^%水解酪蛋白、0.2血0.25%所需氨基酸、0.05血0.1111〇1/1〔3(：12、1血25111111〇1/ LMgC12,补充灭菌蒸馈水至总体积10血。
[001 引 lOXSpizizen salts 母液；15 % 馬册04 ?抓20、6 % 皿2口04、2 % (NH4)2S04、0. 2 % M拆04及1 %巧樣酸钢溶于75. 8 %蒸馈水中，6. 6 X 10中a高压灭菌，室温贬存。
[0019] LB液体培养基；膜蛋白腺lOg、酵母浸出物5g、氯化钢lOg、蒸馈水1000ml，PH值 6. 8-7. 2〇
[0020] LB固体培养基；膜蛋白腺lOg、酵母浸出物5g、氯化钢lOg、琼脂粉15g、蒸馈水 1000ml，PH 值 6. 8-7. 2。
[0021] 2、枯草芽抱杆菌PA105感受态细胞制备方法；
[0022] 从本实验室保存的枯草芽抱杆菌PA105菌株薩取一满环，在新鲜LB固体平板上划 线培养，挑取单菌落接种于2. 5mL LB液体培养基中，30°CW 130-18化/min振荡培养过夜， 将过夜培养物按10 %接种量接种于2. 5血新鲜的GMI中，37°C W 200-22化/min振荡培养 3. 5h，再将培养物进行第二次传代，接种于5mLGMII培养基中，枯草芽抱杆菌PA105按5%接 种量进行第二次传代，37°C W 200-22化/min振荡培养90min，取1血培养物，500化/min室 温离屯、5min，用1/10体积上清液重新悬浮细菌沉淀，即为枯草芽抱杆菌PA105感受态细胞。
[0023] 3、pMD18-T-hom: :Km 质粒构建；
[0024] 3. lpMD18-T-hom 质粒构建；
[0025] 设计上游引物序列为；TTGAAAGCGATTCGTGTAGG(SEQ ID No. 1)，下游引物序列为； TTAGCTCCAACCGTTCCCTTCT(SEQ ID No. 2)，上下游引物由上海生物工程有限公司合成，W 该枯草芽抱杆菌PA105为模板，对高丝氨酸脱氨酶基因hom进行PCR扩增，PCR反应体系： 10X扩增缓冲液10ul、4种dNTP混合物各200umol/L、引物各10~lOOpmol、模板DNA 0. 1~化肖、化9 DM聚合酶2.加、1. 5mmol/L Mg"、加双或S蒸水至lOOul ;PCR反应条件为； 95°C 5min ;95°C lmin，56°C lmin，72°C Imin ;72°C lOmin，循环数 30。
[0026] 获得的PCR产物（即高丝氨酸脱氨酶基因hom)连接至pMDlS-T载体上（pMDlS-T 购买自上海生物工程有限公司），连接体系为；高丝氨酸脱氨酶基因PCR产物6ul、pMD18-T 载体化l、TJigase 2ul、T4buffer 2. 5ul及水12. 5ul，总共25ul，16°C过夜连接，即为连接 产物。
[0027] 取lOul上述连接产物转化至lOOul商业化的大肠杆菌感受态细胞（购买自上海 生物工程有限公司），37°C过夜培养后，在含lOug/血氨节青霉素的LB平板上生长的大肠杆 菌克隆即为阳性转化子，经PCR鉴定后获得pMD18-T-hom质粒。
[002引 3. 2卡纳霉素抗性基因表达盒构建；
[0029] 设计上游引物；TTG-GCGCGC-TGTTTGCAAGCAGCAGATT (SEQ ID No. 3)，和下游引物； TTG-GCGCGC-GTATCCGCTCATGAATTAAT(SEQ ID No. 4)，上下游引物由上海生物工程有限公司 合成。其中-GCGCGC-为BsePUBss肥）酶切位点。W祀T-28a(+)载体（购买自上海生物工 程有限公司）为模板，扩增卡纳抗性基因，PCR反应体系为；10X扩增缓冲液10ul、4种dNTP 混合物各20