临床体外酶法钾测定试剂的制作方法

专利名称：：临床体外酶法钾测定试剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医用体外生化诊断试剂领域，特别是涉及一种应用酶动力学原理的临床体外酶法钾测定试剂。
背景技术：
：人体血清中钾的含量的测定是临床体外诊断测定项目之一，也是临床常规和急诊诊断中不可缺少的项目。血清钾高于参考值上限，多见于肾上腺皮质功能减退。特别危重患者，血清钾上升至8mmol/L,患者将出现心律失常等症状，严重时甚至可能超过10mmol/L,患者可能发生心室纤颤。血清钾低于参考值下限，多见于肾小管疾病，出现严重腹泻、呕吐、肾上腺皮质功能亢进等症状。目前医院测定血清钾多使用离子选择电极法(ISE)。其电极是对钾专一性强的缬霉素膜，是比较理想的测定血清或尿中钾离子浓度的方法。缬霉素膜专一性强，但使用寿命短，一般三个月左右就要更换一次。酶法测定钾是上世纪80年代末由Beny、MN等人提出的。它是利用K+是丙酮酸激酶的激活剂的原理，建立起酶法测定血清钾的基本反应。随后德国B.M.公司正式推出酶法的钾测定试剂盒，并在全世界和中国市场上销售，受到医院的欢迎。酶法钾测定试剂盒的优点是可利用分光光度计原理，在全自动生化分析仪上进行测定，不需再购置和维护离子选择设备，操作方便，节省开支。酶法的测定结果与离子选择电极法等效，是医院值得选择的测定钾的理想方法。
发明内容临床体外酶法测定钾的方法，包括如下步骤(1)尿素氨基水解酶(Ureaamidolyase简称UAL;EC3.5.1.45)在三磷酸腺苷(ATP)、HCCV、Mg+参与下，水解尿素(Urea)生成NH/、HC(V、二磷酸腺苷(ADP)和磷(Pi)，其反应式如下UALUrea+ATP+HC03>H20^ADP+Pi+HC03>NH4++OH(I)Mg2+K+(2)生成的NHZ加上a-酮戊二酸、还原型辅酶I(NADH)在谷氨酸脱氢酶(GLDH)的作用下生成谷氨酸盐(Glutamate)和辅酶l(NAD+)，反应式如下GLDHNH4十+NADH+a-酮戊二酸^Glutamate+NAD十(II)(3)根据K+的浓度与K+的激活速率成正比，而K+的激活浓度与反应式(II)的NADH下降速率成正比，在340nm波长下测定NADH的下降速率，由NADH下降速率推出激活剂K+的浓度。本发明的主要贡献是依据以上反应原理和方法，经过大量的实验研究，将其开发为真正可操作的、测定精度高、可大规模生产的适用于临床诊断和常规检查的临床体外酶法钾测定试剂。本发明的临床体外酶法钾测定试剂，尿素氨基水解酶(UAL)谷氨酸脱氢酶(GLDH)尿素(Urea)三磷酸腺苦(ATP)碳酸氩钠(NaHC03)其主要试剂成分包括0.100.40u/ml，20.0~80.0u/ml，20.040.0mmol/L,1.0~3.0mmol/L,10.0~15.0mmol/L，5硫酸镁(MgS04)还原辅酶I(NADH)a-酮戊二酸乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)叠氮化钠(NaN》0.300.50mmol/L10.020.0mmol/L0.30~0.45mmol/L0.10.2g/L。.010.0mmol/L在实际生产过程中，本发明的临床体外酶法钾测定试剂，其特征在于所述试剂是双试剂，包括第一试剂部分(Rl)和第二试剂部分(R2),尿素氨基水解酶、谷氨酸脱氢酶、尿素、三磷酸腺苷、碳酸氢钠、硫酸镁、a-酮戊二酸、还原型辅酶I、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸和叠氮化钠分别存在于第一试剂部分(Rl)或第二试剂部分(R2)中，其中，所述尿素氨基水解酶、谷氨酸脱氢酶以及三磷酸腺香、硫酸镁和尿素三种组分中的任意一种或两种同时存在于第一试剂部分(Rl)或第二试剂部分(R2)中，对乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、碳酸氢钠、还原型辅酶I、a-酮戊二酸和叠氮化钠没有限定，既可存在于第一试剂部分(Rl)中，也可存在于第二试剂部分(R2)中。所述第一试剂部分(Rl)的緩冲液为咪唑、三羟曱基氨基甲烷(Tris)和吗啉代丙烷磺酸(Mops)中的任意一种，所述緩沖液的浓度为0.050.2mol/L，pH6.0~8.0,精度±0.1(25°C)。所述第一试剂部分的緩沖液优选Mops。所述第二试剂部分(R2)的緩冲液为咪唑、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和吗啉代丙烷磺酸(Nfops)和纯水中的任意一种，所述緩沖液的浓度为0.005~0.02mol/L,pH7.0-8.5,4青度±0.1(25°C)。所述第二试剂部分的緩冲液优选Mops。所述双试剂为干粉剂型或冻干剂型试剂。所述第一试剂部分(Rl)和第二试剂部分(R2)中还分别包括填充剂，所述填充剂为甘露醇、牛血清白蛋白和Dextran-5000的任意一种或三种的混合，其含量范围为110g/100ml。6本发明的临床体外酶法钾测定试剂可上全自动生化分析仪测定，选择二点动力学方法，延长时间选择1-5分钟，以便充分去除内源性NH4+。测定时间选择1-4分钟，所用标准采用双标准法(3mmol/L;6mmol/L)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本发明的临床体外酶法钾测定试剂，包括如下浓度的组分0.10-0.40u/ml的尿素氨基水解酶UAL，20.0-80.0u/ml的谷氨酸脱氢酶GLDH，20.0-40.0mmol/L的尿素Urea，1.0—3.0mmol/L的三磷酸腺苷ATP，10.0—15.0mmol/L的碳酸氢钠NaHC03,5.0—10.0mmol/L的硫酸镁MgS04,10.0—20.0mmol/L的a-酮戊二酸，0.30—0.45mmol/L的还原辅酶I,0.30—0.50mmol/L的乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸EGTA,0.1~0.2g/L的叠氮化钠NaN3。在实际生产过程中，本发明的临床体外诊断钾测定试剂是双试剂，包括第一试剂部分(Rl)和第二试剂部分(R2),尿素氨基水解酶水解酶、谷氨酸脱氢酶、尿素、三磷酸腺苷、碳酸氢钠、硫酸镁、a-酮戊二酸、还原型辅酶I、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸和叠氮化钠分别存在于第一试剂部分Rl或第二试剂部分R2中，其中，尿素氨基水解酶、谷氨酸脱氢酶以及三磷酸腺苷、硫酸4美和尿素三种组分中的任意一种或两种同时存在,既可存在于第一试剂部分Rl，也可以存在于第二试剂部分R2中。对乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、碳酸氢钠、还原型辅酶I、a-酮戊二酸和叠氮化钠没有限定，既可存在于第一试剂部分(Rl)中，也可存在于第二试剂部分(R2)中。1.本发明的临床体外酶法钾测定试剂的配制分为以下步骤(l)第一试剂部分Rl的配制在配置过程中，第一试剂部分Rl;故分解成浓缩液Rla和緩沖液Rlb分别配制。①浓缩液Rla的配制:主要成分UAL130UGLDH30000U牛血清白蛋白50mgDextran-500050mg以上成分溶于50ml的M叩s(0.1mol/L，pH7.3±0.1,25。C)中，待完全溶解后，分装在50个容积为10ml的试剂瓶中，每瓶lml，上冻干机冷冻干燥24小时，得到的Rla是冻干粉型试剂。②緩沖液Rlb的配制主要成分a-酉同戊二^3700mgATP1700mg尿素1150mgNaHC031300mgEGTA270mgNaN350mg以上成分溶于500ml的Mops(0.1mol/L，pH7.3±0.1,25°C)中，待完全溶解后，分装在50个容积为10ml的试剂瓶中，每瓶10ml，2-S。C保存，得到的Rlb是液态试剂。(2)第二试剂部分R2的配制在配置过程中，第二试剂部分R2#1分解成浓缩液R2a和緩冲液R2b分别配制。①浓缩液R2a的配制主要成分NADH300mg牛血清白蛋白50mgDextran-500050mg以上成分溶于50ml的M叩s(0.01mol/L,pH8.0±0.1，25。C)中，待完全;;容解后，分装在50个容积为10ml的试剂瓶中，每瓶1ml,上冻干机冷冻干燥24小时，得到的R2a是冻干粉型试剂。②緩冲液R2b的配制主要成分MgS042000mgNaN350mg以上成分溶于500ml的Mops(0.01mol/L，pH8.0±0.1，25。C)中，待完全溶解后，分装在50个容积为10ml的试剂瓶中，每瓶10ml，2-8'C保存，得到的R2b是液态试剂。在临床检测时，将Rla与Rib混合至完全溶解，即可得到第一试剂部分Rl;将R2a与R2b混合至完全溶解，得到第二试剂部分R2。2.上机测定参数本发明的临床体外酶法钾测定试剂可上全自动生化分析仪测定，选择二点动力学方法，延长时间选择l-5分钟，测定时间选择l-4分钟，所用标准采用双标准法(3mmol/L;6mmol/L)。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>试剂1无缓冲普通测定用量160试剂2普通测定用量160试剂3普通测定用量0点1.2211-317秒3.利用本发明的临床体外酶法钾测定试剂的血清钟的测定结果(1)批内精密度用本发明的临床体外酶法钾测定试剂，重复测定定值质控血清21次，测定结果如下表1所示。表l同批次试剂的血清钾的测定结果序号测定值14.42024.3824.41344.2424.25464.42474.46284.41094.313104.401114.389124.294134.317144.323154—329164.162174.230184.368194.421204.278<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(3)线性特性用接近线性范围上限的高浓度标准和接近线性范围下限的低浓度标准，混合成5个稀释浓度，用本发明的临床体外酶法钾测定试剂分别测定稀释浓度样品，求出回归方程和相关系#t。表3本发明的临床体外酶法钾测定试剂的测定结果与标准值的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>图1是根据表3的结果绘制的线性图。由图l得知线性方程为y=1.0275x+0.001,R2=0.9974(4>^目关小生表4是本发明的临床体外酶法钾测定试剂与上市公司Randox的钾测定试剂同时测定50例人血清，求出回归方程和相关系凄史。表4相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由图2得知线性方程为y=1.0561x-0.2006，R2=0.9876以上所得性能指标结果均达到中华人民共和国卫生行业标准WS/T124-1999规定要求。与RANDOX相关实验证明本发明的临床体外酶法钾测定试剂与RANDOX公司的产品等效。权利要求1.临床体外酶法测定钾的方法，包括如下步骤(1)尿素氨基水解酶(UAL)在三磷酸腺苷(ATP)、HCO3-、Mg+参与下水解尿素(Urea)生成NH4+、HCO3-、二磷酸腺苷(ADP)和磷酸(Pi)，其反应式如下(2)生成的NH4+加上α-酮戊二酸、还原型辅酶I(NADH)在谷氨酸脱氢酶(GLDH)的作用下生成谷氨酸盐(Glutamate)和辅酶I(NAD+)，反应式如下(3)根据K+的浓度与K+的激活速率成正比，而K+的激活浓度与反应式(II)的NADH下降速率成正比，在340nm波长下测定NADH的下降速率，由NADH下降速率推出激活剂K+的浓度。2.利用权利要求1的方法的临床体外酶法钾测定试剂，其主要试剂成分包括:尿素氨基水解酶(UAL)谷氨酸脱氢酶(GLDH)尿素(Urea)三磷酸腺苷(ATP)碳酸氢钠(NaHC03)硫酸镁(MgS04)还原型辅酶I(NADH)a-酉同戊二酉吏0.100.40u/ml,20.0~80.0u/ml，20,0~40.0mmol/L,1.03.0mmol/L,10.015.0mmol/L，5.010.0mmol/L，0.300.45mmol/L,10.020.0mmol/L，乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)0.30~0.50mmol/L，叠氮化钠(NaN3)0.1~0.2g/L。3.根据权利要求1或2所述的临床体外酶法钟测定试剂，其特征在于所述试剂是双试剂，包括第一试剂部分(Rl)和第二试剂部分(R2),尿素氨基水解酶、谷氨酸脱氢酶、尿素、三磷酸腺苷、碳酸氢钠、硫酸镁、a-酮戊二酸、还原型辅酶I、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸和叠氮化钠分别存在于第一试剂部分(Rl)或第二试剂部分(R2)中，其中，所述尿素氨基水解酶、谷氨酸脱氢酶以及三磷酸腺苷、硫酸镁和尿素三种组分中的任意一种或两种同时存在于第一试剂部分(Rl)或第二试剂部分(R2)中，乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、碳酸氢钠、还原型辅酶I、a-酮戊二酸和叠氮化钠分别存在于第一试剂部分(Rl)或第二试剂部分(R2)中。4.根据权利要求3所述的临床体外酶法钾测定试剂，其特征在于所述第一试剂部分(Rl)的緩冲液为咪唑、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和吗啉代丙烷石黄酸(Mops)中的任意一种，所述緩沖液的浓度为0.050.2mol/L，pH6.08.0,精度土O.l,25°C。5.根据权利要求3所述的临床体外酶法钾测定试剂，其特征在于所述第二试剂部分(R2)的緩冲液为咪唑、三羟曱基氨基曱烷(Tris)和吗啉代丙烷石黄酸(Mops)和纯水中的任意一种，所述緩冲液的浓度为0.0050.02mol/L,pH7.0~8.5,精度土O.l，25°C。6.根据权利要求3所述的临床体外酶法钾测定试剂，其特征在于所述双试剂为干粉剂型或冻干剂型试剂。7.根据权利要求6所述的临床体外酶法钾测定试剂，其特征在于所述第一试剂部分(Rl)和第二试剂部分(R2)中还分别包括填充剂，所述填充剂为甘露醇、牛血清白蛋白和Dextran-5000中的任意一种或三种的混合，其含量范围为l10g/100ml。全文摘要尿素氨基水解酶(UreaamidolyaseUAL；EC3.5.1.45)在ATP、HCO₃^-、Mg⁺参与下，水解尿素生成NH₄⁺、HCO₃^-、ADP和Pi。K⁺是UAL酶的激活剂，其激活速度与K⁺浓度成正比。偶联一个辅助反应，将UAL酶生成的NH₄⁺与α-酮戊二酸、NADH和谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase，GLDH)反应，生成谷氨酸盐和NAD⁺，在340nm波长下，NADH的下降速率与K⁺的浓度成正比。通过NADH下降速率求出K⁺的浓度。本发明将以上反应实际应用到临床体外测定钾试剂中，并提出最佳双试剂成份组成，使得试剂稳定性、准确度和精密度达到最理想状态。文档编号C12Q1/32GK101514357SQ20091013149公开日2009年8月26日申请日期2009年4月1日优先权日2009年4月1日发明者朱以桂,朱小晖申请人:北京瑞正善达生物工程技术有限公司