用于截留和返回细胞的一次性分离器的制造方法

用于截留和返回细胞的一次性分离器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于在连续地或者间歇性地被流过的优选可以在生物反应器外部工作的塑料袋子或塑料瓶中截留和返回细胞的分离器。本发明还涉及一种用于在生物反应器内部或外部截留和返回细胞的方法。本发明还涉及一种用于制造本发明的分离器的方法。
【专利说明】用于截留和返回细胞的一次性分离器
[0001] 本发明涉及一种用于在连续地或者间歇性地被流过的塑料袋子中截留和返回细 胞的一次性分离器，该塑料袋子优选可以在生物反应器外部工作。本发明还涉及一种用于 在本发明的生物反应器内部或外部截留和返回细胞的方法。本发明还涉及一种用于制造本 发明的分离器的方法。
[0002] 在制造生物活性物质和药物活性产物时，培养动物细胞和植物细胞具有重大意 义。培养经常在营养介质自由悬浮液中经过的细胞要求特别高，因为与微生物相反，这种细 胞对机械的剪应力和营养物质供应不足很敏感。
[0003] 通常间歇性地培养动植物细胞系，其缺点是，由于培养基浓度、产物浓度和生物质 浓度不断变化，很难实现最佳地供养细胞。此外在发酵结束时积聚了副产物，例如坏死细胞 的组分，这些组分在以后处理时通常必须付出巨额成本予以去除。出于所述原因，但特别 是在制造例如会因分解蛋白侵蚀而受损的不稳定产物时，所以要使用连续工作的生物反应 器。
[0004] 采用连续的生物反应器可以达到高的细胞密度，并实现与此相关联的高产率，如 果满足如下要求的话：
[0005] ?低剪切力地充足地给细胞供应培养基、特别是溶解氧；
[0006] ?彻底消除在呼吸时产生的二氧化碳；
[0007] ?用于建立高的细胞浓度的有效的低剪切力的防堵塞的细胞截留系统；
[0008] ?生物反应器和截留系统的长期稳定性（无菌、流体动力特性）。
[0009] 除了连续的工作方式外，具有有效细胞截留系统的生物反应器例如还可以用于培 养具有特别高的细胞密度的预培养物。于是按照重复-分批-模式采用非连续方式使用细 胞截留系统，以便提取几乎无生物质的细胞培养物上层清液。然后可以再给预培养物反应 器装填新鲜的营养介质，以便采用这种方式使得培养物相比于简单的间歇性工作具备较高 的细胞密度。
[0010] 为了能够在连续工作的生物反应器中达到高的细胞密度（每毫升有两千万个以 上的存活细胞），必须有效地截留细胞。所需的截留度在此取决于细胞的生长率和灌注率 q/V(生物反应器单位体积V的介质流量q)。
[0011] 在过去，提出了各种不同的用于连续工作的生物反应器的细胞截留系统，这些细 胞截留系统多数都设置在生物反应器外部。其原因是，为了维护和清洁目的易于够到细胞 截留系统。
[0012] 为了使得特别是因氧气供应不足和在生物反应器外部的二氧化碳去除不彻底导 致的细胞受损以及因酶（enzymatisch)侵蚀所致的有效物质失效保持得尽可能小，希望细 胞截留系统的工作容积小，相关联地使得细胞滞留时间短暂。
[0013] 有些膜片式过滤器、设备采用横流过滤原理利用固定的和可移动的膜片进行工 作，除此之外，在现有技术中还可以采用特殊的离心器和重力分离器。
[0014] 在借助膜片式过滤器进行细胞截留的情况下，会观察到沉积物或污垢，它们会阻 碍可靠的无维护的长期工作。若膜片表面被足够快速地流过，就可以减少沉积物。这可以 在静止式或振动式工作中实现。被振动式流过的膜片系统例如是Refine科技公司的交替 式切向流（ATF)系统。但快速地流过膜片表面却与低剪切力的细胞培养的基本前提背道而 驰。
[0015] 用于在离心场中分离细胞的低剪切力的离心器在无维护工作的情况下只能工作 数周，因而需要更换离心部件。由此增大了污染的风险。
[0016] 在培养细胞时主要使用的重力分离器是沉降容器和倾斜通道分离器。相比于简 单的沉降容器，大型倾斜通道分离器的优点是，容积大小相对于分离面明显较小。出版物 (Henzler，H.-J.，Chemie_Technik，l，1992,3)记载了在倾斜通道分离器中截留细胞，这些 倾斜通道分离器可以在逆流、交流和直流中工作。被流过的通道横截面可以设有板或管。专 利文献US 5, 817, 505和EP 0 699 101 Bl要求保护倾斜通道分离器在逆流式分离器中用 于截留细胞的应用。在WO 2003020919 A2中尤其记载了逆流式和交流式分离器以及与各 种不同的用于截留细胞的预分离器（例如旋液分离器）的组合。
[0017] 倾斜通道分离器通过外部回路与生物反应器连接。为此需要软管管路和泵。
[0018] 为了减少细胞在重力分离器中的新陈代谢活动和结垢，提出使得细胞培养液在其 通至重力分离器的路径上冷却。低温情况下新陈代谢活动减少肯定有益于在生物反应器外 部长久地保存细胞。
[0019] WO 2009152990 (A2)记载了一种用于在被流过的器皿中截留和返回细胞的细胞截 留系统，它包括多个并排布置的通道，这些通道形成固定的空心柱，且相对于空心柱的纵轴 线倾斜介于10°和60°之间的角度β。被流过的器皿可以是生物反应器或者是与生物反 应器连接的用于截留和返回的器皿。这些通道在下端开口。它们在上端通至共同的环形腔 中，该环形腔具有至少一个管路，经由该管路可以把收获流从器皿中输出。在这些通道中对 细胞和细胞培养溶液进行分离。从生物反应器中连续地提取收获流，这样就把细胞培养溶 液和细胞吸入到通道中。细胞在倾斜地布置的通道内部沉淀，且如同在传统的倾斜通道分 离器中一样在流入的收获流的逆流中又从通道滑出，进而保留在器皿中。与细胞分离的细 胞培养溶液经由通道输入到通道上方的环形腔中，最后从器皿中输出。
[0020] 在大规模调节的药物生产中，在提供清洁、消毒的生物反应器和生物反应器部件 比如细胞截留系统方面付出高昂的时间、技术和人力代价。为了可靠地避免在多用途设备 中或者在两个产物批次之间更替产物时出现交叉感染，除了清洁之外，还需要很繁琐的清 洁核实（validierung)，这在调整工艺时必要时必须重复进行。为了清洁和消毒传统的分批 件、补料-分批件或特种钢灌注发酵桶，往往在所谓的永久管路（fest verrohrten)设备中 与在线蒸汽（SIP)技术相结合地采用在线清洗（CIP)技术。为了保证在连续的过程进行中 充分地长期无菌，还采用高压灭菌技术，但这种技术要求把反应器或反应器部件费事地输 送至高压灭菌器，且只能在比较小的小型反应器中使用。在使用老化的磨损件例如密封的 搅拌器轴时，在未正确地杀菌或输送设备时，在投入工作时，或者在连接管路连接时，在高 压灭菌和定期提取试样之后，沾染的风险尤为严重。
[0021] 对于在分批或补料-分批-模式下使用的CIP/SIP设备来说，特别是在经常更换 产物时由准备过程引起的反应器使用失灵由于使用周期短而达到了影响反应器可用性的 程度。
[0022] 为了在保持最大程度的清洁和无菌情况下考虑到对快速且灵活地重新供应生产 设备的要求，在市场上日益强烈地希望有些用于一次性反应器的设计方案。
[0023] 基于现有技术，目的因而在于，提出一种用于在连续地或间歇性地工作的过程中 截留和返回动物特别是人类细胞和植物细胞的有效的方法，该方法考虑到了细胞对机械的 剪切负荷的敏感性和给细胞充足地供应营养物质，该方法可扩展至很大的规模，该方法满 足了制药工业的维护、清洁和杀菌技术要求，采用该方法降低了复杂性和故障风险，该方法 能在资源耗用最少的情况下实现在经济上和生态上作为一次性系统的最佳利用（制造和 消纳）。
[0024] 上述目的通过一种用于截留和返回来自生物反应器混合物的细胞的一次性细胞 分离器得以实现，其包括可流过的、可杀菌的、按照现有技术例如优选可用伽马射线照射 的、可高压灭菌的或者可化学灭菌的塑料袋子或可相应处理的塑料瓶，带有如下构件：
[0025] -在塑料袋子或塑料瓶的上部区域中的一个或多个通路/构件（80)，用于把与细 胞分离的收获流（70)(收获物）从收获流汇集区域56引出；
[0026] -在塑料袋子的中间区域的上部区段中的分离区域，包括分离面（500)或含有该 分离面的叠片组（1)，该叠片组在工作期间以0° -80°的角度（10 = β)相对于水平线倾 斜；
[0027] -在塑料袋子或塑料瓶的中间区域的下部区段中的一个或多个通路/构件（84)， 其可选地带有水平的分配器（85)，用于使得细胞培养溶液（=Feed (供养物））（74)沿着引 入面（510)均匀地水平地流动分布；
[0028] -在塑料袋子或塑料瓶的下部区域中的在下面圆锥形地变窄的固体汇集区域 (57)，用来借助重力汇集细胞。通常，固体汇集区域（57)具有一个或多个用于引出细胞的 通路（89) /构件（88)。
[0029] 因此，本发明的主题是固体分离器，用于从反应器混合物中截留固体，包括被流过 的可杀菌的塑料袋子或塑料瓶，且在塑料袋子或塑料瓶内部具有：
[0030] -在上部区域的一个或多个通路/构件（80)，用于把与固体分离的收获流（70)从 收获流汇集区域（56)引出；
[0031] -在中间区域的上部区段中的带有分离面的分离区域（1、501)，该分离面在工作 期间以0° -80°的角度（10 = β)相对于水平线倾斜；
[0032] -在中间区域的下部区段中的一个或多个通路/构件（84)，其可选地带有水平的 分配器（85)，用于使得反应器混合物（74)均匀地水平地流动分布；
[0033] -在下部区域中的向下通常圆锥形地或角锥形地变窄的固体汇集区域（57)，用来 借助重力汇集固体。
[0034] 固体汇集区域（57)通常具有一个或多个用于引出固体的通路（89)或构件（88)。 由此可以在需要时将固体返回到反应器中。
[0035] 优选地，向下变窄的固体汇集区域相对于垂线具有10° -60°的角度58、59,其 中，角度58和59可分别单独地选择。
[0036] 收获流汇集区域56的形状可以是任意的，特别是扁平的或向上变窄的。
[0037] 通常，塑料袋子或塑料瓶由一种单层或多层的透明的聚合材料构成，从而可以实 现在工作期间看到装置内部。
[0038] 塑料袋子的聚合材料允许在膜厚度通常较小即s < Imm的情况下使得设备具有比 较小的质量份额。这种材料可以廉价地购得和加工，这很好地适用于构造一次性系统。因 此，消纳用过的分离器和使用新的一次性分离器要比清洁用过的分离装置更经济，特别是 因为在使用一次性分离器时省去利用注射水（用于注射的水，WFI)进行昂贵的清洁和耗时 的清洁核实。本发明的分离器被组装且无菌地包装，并优选适合于通过软管管路利用相应 无菌的可耦接的连接部件和过滤部件与生物反应器系统连接。
[0039] 尤其是在专利文献US 6, 186, 932 Bl第2和3栏针对那里所述的输送袋子（包 袋）所用的材料和材料组合适合作为用于塑料袋子的材料。那里所述的壁厚也可以转用至 本发明的分离装置。
[0040] 根据一种优选的实施方式，塑料袋子的壁由对于本领域技术人员已知的两层或多 层的膜复合材料（层叠物或共挤压物）构成，以便在展开性、延展性、气体扩散性、稳定性、 工艺兼容性（最少地吸收产物和细胞）和可焊接性方面改善塑料袋子的特性。
[0041] 本发明的固体分离器带有由聚合物膜构成的塑料袋子，其例如可以采用在US 6, 186, 932 Bl中所述的方法制得，其中，必须调整焊接缝。下面介绍用于制造本发明的分离 装置的优选实施方式的实施例。
[0042] 通路通常由同一种材料制得，这种材料也构成了接触产物的膜，以便利用该膜能 实现在无菌和坚固技术方面顺畅的焊接。优选的接触产物的膜材料是本领域技术人员已知 的不同交联程度的聚乙烯。作为外壳材料，可以根据应用和工艺要求使用本领域技术人员 已知的不同的材料，这些材料的熔点大于内膜，用于采用热焊接方法和/或改善的坚固特 性和/或扩散特性。
[0043] 构件80、88和84通常是焊入的通路，在这些通路上可以连接管路优选软管，用于 与生物反应器或其它外部设备连接。替代地，通路可以为了穿过连接管路而在一个或多个 连接板、盖件或堵头上开设。
[0044] 在本发明的分离器的一种特殊的实施方式中，在塑料袋子上部区域的壁（四面 体）上或者顶角（立方体）处有一个或多个连接板90,优选有一个连接板，其也可以是盖 件，且含有用于穿过连接管路的通路，并在接头区域中能实现保持住分离器。该连接板通常 在安装时与分离器的壳体连接。
[0045] 替代地，在变窄的固体汇集区域57的端部，在颈部可以安装一个盖件或堵头220。 在该实施方式中，盖件或堵头包含用于穿过连接管路的通路。
[0046] 把固体从固体汇集区域57引出往往通过一个或多个通路或构件88在分离器下面 的尖端附近进行。构件88通常与生物反应器连接，汇集的细胞利用压差或泵返回到所述生 物反应器中。构件88优选用于在中间竖直地吸出固体。这简化了对分离器的制造，且便于 将分离器放置在其容器中以便工作。所述引出也可以通过焊入到分离器尖端中的通路进 行，或者通过在盖件或堵头中开设的通路进行。
[0047] 在本发明的第一实施方式中，分离器区域由叠片组1中的多个并排布置的通道构 成，且优选由多个上下堆叠的接板（Stegplatte)制成，这些接板形成了叠片组1的通道。优 选使用塑料板。这些通道的下端和上端都开口。通道的下端伸展至在共同地向下特别是圆 锥形或角锥形地变窄的固体汇集区域57上方的引导面。通道的上端则伸展至共同的具有 至少一个通路80的收获流汇集区域56,来自器皿的收获流可以经由所述通路输送。
[0048] 细胞和细胞培养溶液在这些通道中进行分离。从生物反应器连续地提取收获流， 这样就能把细胞培养溶液和细胞吸入到通道中。在塑料袋子或塑料瓶的中间区域的下部区 段，开设有一个或多个通路或构件84,用于使得反应器混合物74均匀地水平地流动分布。 力求使得细胞培养溶液（供养物）74沿着引入面510均匀地水平地流动分布。通常，根据 叠片组的宽度在塑料袋子或塑料瓶的壁的相同的高度上开设有一个至四个带有笔直端口 的通路。根据这些通路的高度和间距可以将水平的分配器85有利地用作构件。
[0049] 细胞在倾斜地布置的通道中沉积，就像在传统的倾斜通道分离器中一样与流入的 收获流相反流动地又从通道中滑出，并汇集在圆锥形地变窄的固体汇集区域57中。通常， 固体汇集区域57具有一个或多个通路/构件88/89,其与生物反应器连接，用于将所汇集的 细胞吸入并返回到生物反应器中。
[0050] 叠片组1的通道可以具有多边形、椭圆形、圆形或半圆形的横截面（图4)。
[0051] 通道的设计（数量、直径、长度）分别与要截留的细胞品种、生物反应器大小和流 量有关。
[0052] 通道宽度d优选为d彡1mm，以便防止通道堵塞。在一种优选的实施方式中，使用 通道宽度为3mm-100mm、优选4mm-20mm、特别优选的通道，以便一方面可靠地避免 堵塞状态，但另一方面使得分离器-生物反应器空间的体积比保持得尽可能小，该体积比 能减小空时产率。
[0053] 根据方程1，由沉积速度ws、灌注率q/V(生物反应器单位体积V的介质流量q)和 生物反应器体积，可得到所需要的分离面积A wf。效率Tl考虑到了倾斜通道分离器相对于 竖直分离器的功率减小或功率偏差（方程2)。
【权利要求】
1. 一种固体分离器，用于从反应器混合物中截留和返回固体，包括被流过的可杀菌的 塑料袋子或塑料瓶巧0)，且在塑料袋子或塑料瓶巧0)内部具有： -在上部区域的一个或多个通路/构件巧0)，用于把与固体分离的收获流（70)从收获 流汇集区域巧6)引出； -在中间区域的上部区段中的带有分离面的分离区域（1、501)，该分离面在工作期间 W〇° -80°的角度（10)相对于水平线倾斜； -在中间区域的下部区段中的一个或多个通路/构件巧4)，用于使得反应器混合物 (74)流动分布； -在下部区域中的向下变窄的固体汇集区域巧7)，用来借助重力汇集固体。
2. 如权利要求1所述的固体分离器，其中，固体汇集区域巧7)具有一个或多个用于引 出固体的通路巧9)或构件巧8)。
3. 如权利要求1或2中任一项所述的固体分离器，其中，固体汇集区域巧7)圆锥形地 或角锥形地向下变窄。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的固体分离器，它在内腔中包括至少一个一次性传感 器。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的固体分离器，其中，分离器区域由叠片组（1)中的多 个并排布置的通道构成，分离面在工作期间W 30° -80°的角度（10)相对于水平线倾斜。
6. 如权利要求5所述的固体分离器，其中，叠片组（1)由多个上下堆叠的接板构成，所 述接板形成了叠片组（1)的通道。
7. 如权利要求5或6中任一项所述的固体分离器，其中，通道的通道长度L为塑料袋子 或塑料瓶的长度LK的30 % -95 %。
8. 如权利要求5-7中任一项所述的固体分离器，其中，在受限的情况下，接片高度与通 道宽度的比例hs/d为0. 01《hs/d《5。
9. 如权利要求1-4中任一项所述的固体分离器，其中，塑料袋子巧0)为多面体形或锥 形，其中，塑料袋子巧0)在工作期间适当地安置，从而在下面变窄的固体汇集区域57由塑 料袋子的壁和多面体的或锥体的尖端或顶角形成。
10. 如权利要求9所述的固体分离器，其中，塑料袋子巧0)是双模、直角锥、八面体或立 方体。
11. 如权利要求1-4中任一项所述的固体分离器，其中，塑料袋子或塑料瓶巧0)具有四 边形横截面，其中，向下变窄的固体汇集区域57在利用盖件或堵头封闭的颈部终止，其中， 盖件或堵头具有全部的通路80、88、84。
12. 如权利要求1-11中任一项所述的固体分离器，包括用于容纳塑料袋子50的容器， 其中，该容器至少包括： -用于容纳塑料袋子50的内腔，其中，借助于与塑料袋子50的形状适配的壁使得该内 腔适配于塑料袋子50的形状，所述壁包围内腔且与外界隔开；用于把塑料袋子50从上面装 入到容器中的开口。
13. -种包括生物反应器的生物反应器设备，该生物反应器与根据权利要求1-12中任 一项的固体分离器连接。
14. 一种用于在被流过的器皿中截留和返回固体特别是细胞的方法，其中，把含有固体 的介质连续地或者间歇性地输送给该器皿，而无固体的介质则被排出，其特征在于，该器皿 是被流过的可杀菌的塑料袋子或塑料瓶，该塑料袋子在下部区域具有斜置面，有利地具有 向下圆锥形地变窄的固体汇集区域巧7)，用于借助重力来汇集固体。
【文档编号】C12M1/08GK104471051SQ201380020998
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年2月20日 优先权日:2012年2月20日
【发明者】J·考林, J·泽莱齐基, J·马格努斯, A·帕斯托尔, H·布罗德 申请人:拜尔技术服务有限责任公司, 拜耳知识产权有限责任公司