专利名称：倾斜式重力沉降活细胞截留装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种倾斜式重力沉降活细胞截流装置，具体地说涉及一种用于在细胞连续灌注培养过程中选择性截留活细胞的倾斜式重力沉降装置。
背景技术：
灌注培养方式是提高细胞密度的有效方法。这种培养方式的优越性在于能够在培养液体积不变的前提下不断补入新鲜培养基，排出代谢物，使细胞快速生长并保持高活性，从而实现产物的高表达和高产率。开发细胞截流装置、高效截留细胞是实施连续灌注培养的一个关键的技术问题。
在众多的细胞截留装置中，倾斜式重力沉降装置因其结构简单，成本低，无堵塞，对细胞剪切小，易放大等优点被认为是一种较好的细胞截留方法。目前，已有许多专利报道了用于细胞连续灌注培养过程中的重力沉降细胞截留分离方法和装置，如王兆伟，谭文松(ZL00116518.6)提出的一种下流倾斜式细胞重力沉降器，该沉降器为一含有多个入口的长方体槽，含有细胞的培养液由沉降器的上端的某一入口进入沉降器，其中大部分细胞首先沉降在沉降器的下表面上，通过回流口流出沉降器，返回反应器，含有少量细胞碎片及死细胞的上清液由收液口流出。该专利主要存在的问题如下(1)沉降器的截留处理量小。使用该装置时，因为回流口开在沉降器的下表面中间，为了使尽可能多的活细胞流回反应器，大部分活细胞必须在回流口之前沉降到沉降器的下表面，否则将会由下端收液口流入上清液收集容器，而细胞沉降到下表面的时间，即细胞在沉降器内的垂直运动时间很长，根据细胞在沉降器内水平运动时间和垂直运动时间相等，必然导致沉降器的进口流量较慢，而收液口的流量小于进口流量，即沉降器的截留处理量就会受到限制。该专利中提到沉降器上设有多个培养液进口，通过调整进口的位置即加长进口到回流口的距离达到增大截留处理量的目的，这也从另一个角度反映出它的局限性，截留处理量和沉降器的长度成正比，这显然是个治标不治本的方法。
(2)细胞在沉降器内的停留时间长，导致反应器环境恶化。为了使大部分活细胞能从回流口返回反应器中，只能通过减慢沉降器的进口流量，让细胞沉降至下底面，再随主体液滑向回流口。这就带来了两个问题一是减慢了沉降器的进口流量后，细胞从反应器流出通过沉降器被截留住再经回流口返回反应器的时间就延长，而沉降器中保持常温，过高或过低的环境温度容易造成细胞损伤；二是细胞先沉降至下表面，然后随主体液滑向回流口，为了保证大部分活细胞都能沉降到底面，必须减慢主体流速，那么沉降到下表面的细胞只能缓慢地随主体液下滑至回流口，甚至部分细胞会沉积在沉降器底面，难于回流至反应器，最终沉降器内积累了大量细胞。这两个问题使得细胞在沉降器内停留时间过长，导致细胞活性和产物表达能力下降，代谢废物积累增多，恶化反应器中的培养环境。
(3)沉降器的横截面形状不合理。该专利中提出的沉降器为一倾斜长方体槽，发明人通过大量实验和计算机模拟，发现采用矩形横截面的沉降器内的流场不合理，由于主体流速不快，沉降器的四周壁面附近存在流场死区，大量细胞悬滞在死区内，导致细胞在反应器外平均停留时间过长，引起细胞损伤。
谭文松，姜华，蔡海波，迟占有(ZL200310109264.2)报道了一种用于造血细胞连续灌注培养生物反应器系统的细胞重力沉降截留装置，斜置的横截面为矩形的管状沉降器，其一端的上部设有进料口，沉降器对应于进料口位置的底部设有出料口，其另一端设有排气口和排液口，进料口与排液口之间为倾斜沉降区，进料口与出料口之间为垂直沉降区。该沉降器除了具有上述专利中所具有的一些问题和缺点外，还存在的一些缺陷是(1)操作连续性不好。使用该装置时，沉降器底部会沉积部分细胞，需要用培养液冲洗回收，这种方法是以破坏细胞在沉降器中的连续性为代价的，打破了系统进程的平衡。
(2)装置复杂，成本高。该装置同样存在细胞在沉降器内停留时间长的问题，提出采用水浴夹套使沉降器内沉积细胞处于相对稳定的环境，从而缓解沉积引起的细胞损伤，但这种方法提高了沉降装置的成本，增加了操作的复杂性。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种用于动物细胞连续长期灌注培养过程中下流倾斜式重力沉降活细胞截留装置，解决活细胞在沉降器内平均停留时间长，造成细胞损伤、反应器环境恶化的问题。
本发明的技术构思发明人通过大量实验和CFD计算机模拟，发现沉降器内部存在一定厚度的边界层，边界层滞留细胞和壁面粘附细胞是导致细胞在沉降器中停留时间过长的主要原因。
解决边界层滞留细胞的问题，就是要减小边界层的作用范围，主要从以下几个方面进行(1)改进回流口和收液口的位置，减小沉降器上半部分边界层的厚度，同时也提高了沉降装置的处理量。在ZL00116518.6的专利中，回流口和收液口都开在沉降器的下方，细胞悬液只在沉降器的下半部分流动，上半部分基本全是死区，大量细胞悬滞在这一区域。并且为了将大部分进入沉降器的活细胞截留返回反应器，采取的解决方案是在细胞流经回流口前让细胞沉积至沉降器的下表面，否则会由下端收液口流入上清液收集容器，而细胞在重力场中的沉降速度是一定的，这就带来了一个矛盾要提高活细胞回流率，就需要降低主体流速，沉降器的处理量就会受到限制；同时在低主体流速下细胞会在沉降器的下底面大量沉积，细胞平均停留时间延长造成细胞损伤。
可以通过改变回流口和收液口的位置来解决这一矛盾，收液口位置由装置末端底部变换到装置中段背部，回流口位置由装置中段底部变换到末端底部，这样含有细胞的培养液进入沉降器后，细胞经过一段时间的沉降，沉降速度低的死细胞和碎片从沉降器背部的收液口流入上清收集容器，沉降速度高的活细胞从底部的回流口返回反应器，采用这种设计，不仅解决了沉降器上半部分边界层过厚的问题，而且提高主体流速后，即使活细胞没有全部沉降至下表面也可以从回流口返回，提高了沉降装置的处理量的同时，活细胞的高回流率也能得到保证。
(2)改善沉降器的横截面形状。在上述专利中，沉降器的横截面都采用矩形结构，发明人通过大量实验以及计算流体力学CFD技术进行计算机模拟，发现采用矩形横截面的沉降器流场中低速区域范围大，而界面结构换成半圆弧形后，主体流动的影响区域增大，低速区范围大大减小。
(3)装置下底面细胞粘附量较多的地方加上肋条。肋条的作用是在壁面附近形成拟序涡，可将壁面附近的细胞卷离壁面，降低细胞与底部壁面的接触几率。同时该拟序涡作用范围有限，不会影响整个装置的效率。
解决壁面粘附细胞的问题，是通过对壁面改性使细胞不易粘附，主要有以下两个方法一、壁面疏水化。由于沉降器的底面是由亲水性玻璃制成，若对表面涂疏水膜修饰，能够减少底面的细胞黏附量。二、壁面纳米化。作为有生命的微粒物，细胞表面也带有电荷。将壁面纳米化处理后，壁面释放静电，以降低细胞与壁面的直接接触。
根据上述的技术构思，本发明提出的技术方案如下一种用于连续灌注培养生物反应器系统的倾斜式重力沉降细胞截留装置，包括沉降器主体、进料口、收液口和回流口，其特征在于，还包括肋条；所说的沉降器主体的横截面为椭圆形；进料口设置在主体的上端；收液口设置在主体中段的背部；回流口设置在主体的下端；所说的肋条设置在主体内表面底部；本发明的倾斜式重力沉降活细胞截留装置是这样使用的
生物反应器来的细胞悬液从进料口进入沉降器，由于活细胞的沉降速度比死细胞和细胞碎片的沉降速度大，绝大部分活细胞会渐渐富集于沉降器的下半部分，沉降器的上半部分中主要是死细胞和细胞碎片，可由收液口流出；其余活细胞从回流口返回生物反应器，达到截留活细胞的目的。
本发明的优点在于(1)沉降器的适用范围广。由于不存在大部分活细胞必须沉降至下表面才能回流回反应器的问题，所以沉降器的进口流量可调节的范围很广，收液口流量(即生物反应器的新鲜培养基灌注量)相应可调节的范围也很广。
(2)沉降器内的细胞沉积量少。一、将沉降器的横截面改成椭圆形后，改善了沉降器内的流场情况，死区大大减少；二、改变了回流口和收液口的位置后，可以加大主体流速减少细胞的停滞，保证沉降器的高活细胞回流率；三、沉降器下底面施加肋条，致使流体形成拟序涡，该拟序涡可以将壁面附近的细胞卷离壁面；四、对壁面进行疏水处理和纳米化处理以减少细胞与壁面的接触几率。这些方法减少了细胞在沉降器底面的沉积与粘附，有效缩短了细胞在反应器外的平均停留时间，缓解了因沉积细胞引起的整体活性下降，反应器环境恶化的问题。
(3)使用周期长。通过结构参数优化、操作参数优化、壁面疏水化和纳米化改型、施加底面肋条等，避免细胞在沉降装置中的滞留，可以保证整个连续灌注系统的长期稳定运行。
图1为本发明的结构示意图。
图2为椭圆形沉降器横截面图。
具体实施例方式
参见图1和图2，本发明的倾斜式重力沉降细胞截留装置，包括包括沉降器主体1、进料口2、收液口3和回流口4，其特征在于，还包括肋条6；所说的沉降器主体1的横截面为椭圆形；进料口2设置在主体1的上端，数量为一个；收液口3设置在主体1中段的背部；回流口4设置在主体1的下端；所说的肋条6设置在主体1内表面5的底部；收液口3与主体1底面的夹角α为40～50°，优选45°；使用时，主体1斜置，与水平方向的夹角β为45-60°。
所说的主体的材质最好为低毒生物玻璃，如上海嘉定泰和玻璃厂生产的牌号为95料(B-40)的产品，玻璃表面经过疏水处理和纳米化处理。
玻璃表面疏水处理的方法，可采用张庆勇，王浩在(溶胶—凝胶法制备有机/无机复合疏水薄膜的研究)文献公开的方法，包括如下步骤将聚四氟乙烯乳液、蒸馏水和分散剂、表面活性剂混合磁力搅拌成白色乳液，加入硅溶胶磁力搅拌3小时，呈白色乳液后加入氨水磁力搅拌半小时后密封陈化24小时后得到溶胶。对玻璃表面镀膜采用提拉法，速度为24cm/min。然后将玻璃放入烘箱中热处理，直到表面溶胶固化为止。
玻璃表面的纳米化处理的方法，可采用李玲在(纳米SiO2/聚丙烯酸酯复合膜抗静电性能研究)文献公开的方法，包括如下步骤称取纳米SiO2粉末，按25％的质量分数与聚丙烯酸酯乳液混合，加入少许消泡剂，放入球磨机中球磨5分钟后，倒在玻璃板上(玻璃板经过洗洁精清洗后烘干处理)，涂敷或流涎成膜，烘干或自然晾干后即可。
实施例1本沉降器与1L搅拌式细胞培养反应器组合用于杂交瘤细胞的灌注培养。
细胞细胞株为杂交瘤细胞HB-58，该细胞株保藏在ATCC(美国组织细胞库)，保藏号为Hybridoma CELL Line 187.1(ATCC HB58)。细胞在300ml转瓶中维持培养，转瓶置于37℃含5％CO2培养箱中，在对数培养期接种到反应器中。
培养基为GIBCO公司的Hybridoma-SFM(1X)(杂交瘤细胞培养用无血清培养基)，商品序号为12045-035。
收液口3与主体1底面的夹角α为45°；使用时，主体1斜置，与水平方向的夹角β为50°连续灌注培养60天。使用葡萄糖限制的培养基(葡萄糖浓度7mM，谷胺酰氨8.5mM)，在灌注速率为1/天时，最大细胞浓度达到1.3×107cells/ml，活细胞截留率为99％，死细胞截留率为50％，反应器内细胞活性为95％。
细胞密度检测方法通过血球计数器和台盘蓝染色法计算活细胞密度和细胞活性。实验中每隔12小时检测一次细胞培养反应器中和由收液口流出的细胞密度和活性。
权利要求
1.一种倾斜式重力沉降活细胞截留装置，包括斜置的沉降器主体(1)、进料口(2)、收液口(3)和回流口(4)，其特征在于，还包括肋条(6)；所说的沉降器主体(1)的横截面为椭圆形；进料口(2)设置在主体(1)的上端，数量为一个；收液口(3)设置在主体(1)中段的背部；回流口(4)设置在主体(1)的下端；所说的肋条(6)设置在主体(1)内表面(5)的底部。
2.根据权利要求1所述的倾斜式重力沉降活细胞截留装置，其特征在于，收液口(3)与主体(1)底面的夹角α为40～50°。
3.根据权利要求2所述的倾斜式重力沉降活细胞截留装置，其特征在于，收液口(3)与主体(1)底面的夹角α为45°。
4.根据权利要求1所述的倾斜式重力沉降活细胞截留装置，其特征在于，使用时，主体(1)斜置，与水平方向的夹角β为45-60°。
5.根据权利要求1～4任一项所述的倾斜式重力沉降活细胞截留装置，其特征在于，所说的主体(1)的材质为低毒生物玻璃，玻璃表面经过疏水处理和纳米化处理。
全文摘要
本发明公开了一种倾斜式重力沉降活细胞截留装置，包括斜置的沉降器主体(1)、进料口(2)、收液口(3)和回流口(4)，其特征在于，还包括肋条(6)；所说的沉降器主体(1)的横截面为椭圆形；进料口(2)设置在主体(1)的上端，收液口(3)设置在主体(1)中段的背部；回流口(4)设置在主体(1)的下端；所说的肋条(6)设置在主体(1)内表面(5)的底部。本发明的截留装置适用于不同反应器，灌注速率为范围很广。本发明减少了细胞在沉降器底面的沉积，有效缩短了细胞在反应器外的平均停留时间，缓解了因沉积细胞引起的整体活性下降，反应器环境恶化的问题。
文档编号C12N5/06GK1966659SQ20061011840
公开日2007年5月23日 申请日期2006年11月16日 优先权日2006年11月16日
发明者谭文松, 张璐, 张旭 申请人:华东理工大学