专利名称：一种动物细胞高密度连续灌注培养方法
技术领域：
本发明涉及动物细胞大规模、高密度、无血清连续灌注培养方法。
背景技术：
生物反应器中动物细胞的培养过程可以有不同的操作方式，如分批培养(Batch)、连续培养(Continuous)、灌注培养(Perfusion)以及流加培养(Fed-batch)等，不同的操作方式有其不同的特点。
连续灌注培养，就是在培养过程中以一定速率加入新鲜营养液，并以相同速率排出上清液，同时通过反应器上附加的细胞截留系统将大多数活细胞与上清液及死细胞、细胞碎片等分离，活细胞返回至反应器内继续培养。连续灌注培养不仅保持了较恒定的培养状态，避免了有害代谢副产物的积累，而且使反应器内的细胞达到比较高的密度。
近年来动物细胞培养在细胞生理学研究，特别是在认识影响细胞生长与活力的不利因素方面已经取得了很大的进步。通过分子遗传控制，细胞更易于在不含动物蛋白的培养基中培养。在工程研究中，得到高细胞密度和高细胞活性逐渐成为普遍的话题。关于补料培养和灌注培养中补料的控制方案，越来越多的努力投向过程控制和监测，这对于保证产品质量和过程的连贯性是有益的。大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，培养过程中细胞培养环境迅速改变，在线过程监控十分重要。在线测定反应器中培养条件、代谢产物和目的产物等大量数据，并对测定结果进行分析处理，及时对培养系统进行反馈控制，才能成功地进行大规模动物细胞培养。
对于任何给定的动物细胞，目标产物浓度与细胞密度和培养时间的积分成正比，即P＝q∫Xvdt，因此要提高产物浓度及其产率有两个途径，首先是提高活细胞的密度，其次是维持尽可能长的培养时间，而这与培养基组成和细胞培养环境密切相关。众所周知，动物细胞维持生长、成活并进行产物合成需要三十多种营养成分，包括葡萄糖、必需氨基酸、维生素、某些血清成分和无机盐等，其中葡萄糖和谷氨酰胺是细胞生长、代谢和产物合成中最主要的碳源和能源物质，同时动物细胞还需要适宜的培养环境，包括pH、渗透压、溶解氧和温度等。在细胞培养过程中只要有一种营养物被耗竭，就会限制细胞生长、代谢和产物合成，因此细胞培养过程中各种营养物的供给往往决定了生物反应器的产率。然而，动物细胞生长除了要消耗营养物之外，还会生成许多代谢副产物，如氨、乳酸、非必需氨基酸和CO2等。这些副产物积累到一定程度往往会对细胞产生毒性作用或改变培养环境的pH和渗透压，从而抑制细胞生长和产物合成。现有大量研究证明动物细胞培养过程中营养物耗竭和代谢副产物积累的矛盾是限制细胞密度、产物浓度和培养过程产率的主要因素。为了消除营养限制，有人曾试图在渗透压许可范围内对培养基进行浓缩或添加营养成分，然而最终的结果是虽然营养物仍大量富余，但收效却甚微，究其原因是培养基中的高浓度葡萄糖和谷氨酰胺等营养物质促使了乳酸、氨和丙氨酸等代谢副产物的大量积累所致。为了减少乳酸和氨的生成与积累，近几年有研究者也作了多种尝试。例如有学者用果糖、麦芽糖和半乳糖作为碳源代替葡萄糖，虽然乳酸生成显著减少，但细胞的能量代谢更多的转向谷氨酰胺，从而生成更多的氨。另一方面，有研究者使用通过水解能生成谷氨酰胺的二肽(丙氨酰—谷氨酰胺和甘氨酰—谷氨酰胺)来代替培养基中游离的谷氨酰胺，虽然在培养基高温消毒和长期保存方面有一定优势，但未能达到预期的降氨效果，相反导致了大量的丙氨酸和甘氨酸积累，使培养基渗透压显著升高至对细胞生长有害的水平。其它在降氨方面的尝试还包括通过诱导使细胞完全不需要谷氨酰胺，克隆谷氨酰胺合成酶至细胞中，以及使用渗透膜和电解等手段选择性去除氨或铵离子等，但所有这些努力至今仍未获任何理想结果。
事实上，动物细胞在培养过程中对营养物质的代谢途径受到培养环境和营养物浓度的严格调控，营养物代谢途径不同，能量利用率和副产物生成具有显著差异，最典型的是细胞对葡萄糖和谷氨酰胺的代谢。在一般批式培养过程中，由于葡萄糖浓度比较高，促使大部分(大于70％)葡萄糖通过糖酵解途径代谢，导致乳酸的大量积累，且只能生成2mmolATP/mmol葡萄糖；谷氨酰胺代谢也是如此，高浓度的谷氨酰胺将加速脱氨降解使谷氨酸和氨大量积累，同时高浓度的谷氨酸又通过谷氨酸—丙酮酸转氨酶途径生成α-酮戊二酸进入三羧酸循环，导致丙氨酸大量积累，使培养基渗透压升高，且只生成9mmolATP/mmol谷氨酰胺。细胞代谢过程生化反应动力学研究表明，细胞对葡萄糖的消耗主要受易化扩散控制，细胞膜上的葡萄糖浓度梯度是其唯一的推动力。当葡萄糖浓度较低时，细胞也可通过由Na+离子梯度推动的高亲和性(米氏常数Km低于0.2mM)同向转运过程摄取葡萄糖。另外，转化细胞的线粒体己糖激酶活性高，且不受葡萄糖-6-P的反馈调节，因此高浓度的葡萄糖-6-P往往会强化糖酵解途径。同样，培养基中高浓度谷氨酰胺也导致细胞对谷氨酰胺的高速摄取，谷氨酰胺脱氨降解的第一步与谷氨酰胺酶同功酶的米氏常数Km相对较高(2.2至4.5mM)有关，且这一步在热力学上是相当有利的(平衡常数K＝320)，但它同时对降低胞内谷氨酰胺浓度非常敏感。糖酵解和谷氨酰胺脱氨降解途径的终点都在丙酮酸，致使它在线粒体两侧积聚。当过量的丙酮酸积累超过了线粒体的氧化能力时，将迫使细胞以乳酸和丙氨酸形式分泌过剩的碳源。动物细胞的上述代谢特点就是导致为什么在批式培养中不可能解决营养物耗竭和副产物积累这一矛盾的根本原因。
采用葡萄糖和谷氨酰胺限制的流加培养或灌注培养，可望消除批式培养中一开始浓度过高而后耗竭的缺陷，通过加料使培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺浓度控制在比较低的水平并得到不断补充，代谢副产物不断被稀释或排除，近几年国外许多研究者的实验结果预示这种培养方式可为调控细胞进入高能代谢途径并减少副产物积累提供帮助。例如，Glacken等人(1998，Biotechnol. Bioeng.32491-506)通过流加谷氨酰胺使其浓度在MDCK细胞的微载体培养中维持低水平，结果氨的生成减少了60％，同样，Ljunggren和Haggestrom(1992，Cytotechnology 845-56)在骨髓瘤细胞培养中采用谷氨酰胺限制的流加培养，使氨生成降低了50％。进而，他们研究了在杂交瘤细胞培养中同时限制葡萄糖和谷氨酰胺的流加培养，结果发现乳酸、氨和丙氨酸生成显著减少，而能量利用率、细胞密度和产物浓度得到显著提高(1994，Biotechnol. Bioeng.44808-818)。然而，这些学者的研究工作尚存在一些不足，主要是他们往往只考虑了葡萄糖和/或谷氨酰胺，流加的培养基是非平衡培养基，限制补料一段时间后其它营养物质成为细胞生长的限制性因素，最后往往是造成细胞大量死亡，死细胞数大于活细胞数，而活细胞密度和产物浓度的提高仍然有限。虽然培养基连续灌注培养比流加培养更有优势，除了能不断补充营养物之外还能及时排去代谢副产物，因此所获得的细胞密度可比批式培养提高一至二个数量级，但是目前所研究和应用的灌注培养，由于其培养基是非平衡的，因此往往以高速率培养基灌注为代价，且使产物浓度大量稀释，在经济上得不偿失。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种动物细胞高密度连续灌注培养方法，以克服现有技术存在的缺陷，满足有关方面的需要。
本发明的方法包括如下步骤(1)目标细胞株在初始培养基中进行批培养；(2)计算培养过程中的细胞生长、培养基中各种营养物消耗和代谢副产物生成以及目标产物生成等动力学参数；(3)根据计算结果重新设计灌注培养过程中的初始培养基和灌注培养基的营养物组成，并进行灌注培养；重复(3)～(4)步骤对计算结果进行迭代优化，并根据培养过程所需达到的细胞密度和生产能力设定培养基连续灌注的速率，以获得高的细胞密度和目标产物浓度。动力学方程及计算批培养参数计算动力学方程细胞dXVdt=μXV]]>或μ=1t2-t1lnXV2XV1]]>(计算细胞的比生长速率)营养物dSdt=-qSXV]]>或qS=-1XVdSdt=-dSdXV]]>(计算营养物的比消耗速率)产物dPdt=qP·XV]]>或qP=1XVdPdt=μdPdXV]]>(计算细胞产生代谢副产物的比生成速率)产物浓度P＝qP∫Xvdt灌注培养参数计算动力学方程物料进出速率相等，大部分细胞截留在反应器中，总稀释率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，细胞流出率Db＝Fb/V。
细胞dXvdt=(μ-kd-Db)Xv;dXddtkdXv-DbXd]]>营养物dSdt=D(Sf-S)-qsXv]]>产物dPdt=qPXv-DP]]>在稳定状态下，μ＝kd+Db，qs=D(Sf-S)Xv,qP=DPXv.]]>其中目标产物浓度可表示为P=qPXvD.]]>符号说明Xv 活细胞密度(106cells/mL)Xt 总细胞密度(106cells/mL)Viability 细胞活性(％)
μ细胞比生长速率(day-1)D 灌注速率或称稀释率(day-1)F 流加速率(mL/day)Gluc，Gln 底物浓度(mM)Lac，Amm 副产物浓度(mM)MAb单抗浓度(mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副产物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb单抗比生产速率(mg/109cells/day)Yx/GlueYx/Gln单位底物消耗的细胞产率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln单位营养物消耗的副产物产率(mmol/mmol)V 培养体积(mL)更具体的包括如下步骤(1)将需要培养的细胞在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，接种于生物反应器中，接种密度为1.5～3.0×105细胞/ml；(2)反应器设置为温度37℃，pH为7.2，溶氧50％，搅拌转速40～80转/分钟。在无血清初始培养基中，培养50～60小时后，将无血清灌注培养基以灌注速率D＝1.0v/vday-1的速度进入生物反应器进行灌注培养，培养周期为30～60天，从第10天起开始收液，细胞密度可达1.0～2.40×107cells/ml，产物浓度可达批培养的10倍以上；所说的细胞包括杂交瘤细胞、重组CHO细胞、293细胞、昆虫细胞、NSO等工程细胞无血清初始培养基的组分和含量如下
无血清灌注培养基的组分和含量如下
本发明的方法具有以下特点1.本发明中所用的培养基是无血清培养基；2.在无血清培养基中添加了葡萄糖、谷氨酰胺、必需氨基酸以及细胞生长所需的其它营养物质；3.无血清培养基中所添加的物质是根据培养过程中细胞生长和代谢的特性，对动力学参数进行分析、计算和优化后，形成营养平衡的无血清培养基，既避免了营养物不足造成限制，也避免了营养物过剩造成代谢副产物的大量积累；4.利用本发明优化的培养基和优化的灌注策略，可以在较低的灌注速率下获得较高的细胞密度，从而使产物浓度得到显著提高，避免了高灌注速率下目标产物的稀释。
动物细胞培养的无血清培养基除无机盐外还有葡萄糖、谷氨酰胺、各种氨基酸、各种生长因子、调节和运输蛋白等30多种营养成分组成，任何一种营养物的缺乏都会造成细胞生长受到限制甚至导致细胞死亡；而营养物过度丰富则会使代谢副产物如氨和乳酸的大量积累，同样可导致细胞停止生长或死亡。研究表明，要有效地降低氨和乳酸的产量，必需降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度。本发明通过研究细胞生长、营养物消耗和代谢副产物积累的动力学特性，来研究细胞生长和营养物消耗和代谢副产物积累之间的代谢规律，确定和控制细胞生长的最佳营养环境，通过化学计量关系和灌注培养策略满足细胞生长所需的营养物质量，从而解决了营养物耗竭和副产物积累之间的矛盾。采用本发明所形成的工艺可将各种营养物控制在一个较低的合适浓度，既可保证细胞的营养供应，不会限制细胞的生长，又可降低有毒废物的产生，从而可获得高的细胞密度和产物浓度。
图1为杂交瘤细胞连续灌注培养细胞生长与产物表达；图2为CHO细胞连续灌注培养细胞生长与产物表达；具体实施方式
实施例1将HB58杂交瘤细胞(从ATCC获得)在无血清培养基中采用？？？文献公开的方法进行传代适应后，在50升生物反应器中接种，接种密度2.0×105cells/ml。
(2)在37℃、pH为7.2的条件下在无血清初始培养基中，培养60小时后，将无血清灌注培养基以1.0v/v day-1的灌注速率灌注进入生物反应器进行灌注培养，培养时间为60天，从第10天起开始收液，细胞密度可达2.40×107cells/ml，产物浓度可达624mg/ml；培养过程的细胞变化见图1，图中，曲线1为活细胞密度，曲线2为单抗浓度。
通过本发明对培养过程的优化，细胞对于葡萄糖、谷氨酰胺以及其它各种氨基酸等营养物的利用率得到了极大的提高，乳酸、氨、丙氨酸等代谢副产物的生成速率大幅下降，细胞密度和产物浓度都获得了显著提高。与批培养的结果相比，反应器中细胞密度是批培养的11.32倍，产物浓度为9.18倍，过程产率为38.24倍(见表1)。
实施例2将重组CHO细胞(rCHO SS3 A2，表达人抗凝血因子III)在B.BRAUN 2升生物反应器中接种，接种密度2.75×105cells/ml。
(2)在37℃、pH为7.2的条件下在无血清初始培养基中，培养40小时后，将无血清灌注培养基以0.58v/v day-1的灌注速率灌注进入生物反应器进行灌注培养，培养时间为28天，从第8天起开始收液，最高细胞密度可达1.1×107cells/ml，产物浓度可达390U/ml；培养过程的细胞变化见图2，图中，曲线3为活细胞密度，曲线4为总细胞密度，曲线5为产物(ATIII)表达量。
通过本发明对培养基和培养过程的优化，培养基中各种营养物被控制在较低的合适水平，使代谢副产物的生成速率大幅下降，因此细胞密度和产物浓度都获得了显著提高。与普通培养基批培养的结果相比，细胞密度和产物浓度分别提高6倍和5倍。
权利要求
1.一种动物细胞高密度连续灌注培养方法，其特征在于，包括如下步骤(1)目标细胞株在初始培养基中进行批培养；(2)计算培养过程中的细胞生长、培养基中各种营养物消耗和代谢副产物生成以及目标产物生成等动力学参数；(3)根据计算结果重新设计灌注培养过程中的初始培养基和灌注培养基的营养物组成，并进行灌注培养；重复(3)～(4)步骤对计算结果进行迭代优化，并根据培养过程所需达到的细胞密度和生产能力设定培养基连续灌注的速率，以获得高的细胞密度和目标产物浓度。动力学方程及计算批培养参数计算动力学方程细胞dXVdt=μXV]]>或μ=1t2-t1lnXV2XV1]]>(计算细胞的比生长速率)营养物dSdt=-qSXV]]>或qS=-1XVdSdt=-μdSdXV]]>(计算营养物的比消耗速率)产物dPdt=qPXV]]>或qP=1XVdPdt=μdPdXV]]>(计算细胞产生代谢副产物的比生成速率)产物浓度P＝qP∫Xvdt灌注培养参数计算动力学方程物料进出速率相等，大部分细胞截留在反应器中，总稀释率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，细胞流出率Db＝Fb/V。细胞dXvdt=(μ-kd-Db)Xv;dXddt=kdXv-DbXd]]>营养物dSdt=D(Sf-S)-qsXv]]>产物dPdt=qPXv-DP]]>在稳定状态下，μ=kd+Db,qs=D(Sf-S)Xv,qP=DPXv.]]>其中目标产物浓度可表示为P=qPXvD]]>符号说明Xv 活细胞密度(106cells/mL)Xt 总细胞密度(106cells/mL)Viability 细胞活性(％)μ 细胞比生长速率(day-1)D 灌注速率或称稀释率(day-1)F 流加速率(mL/day)Gluc，Gln 底物浓度(mM)Lac，Amm副产物浓度(mM)MAb 单抗浓度(mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副产物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb单抗比生产速率(mg/109cells/day)Yx/GlucYx/Gln单位底物消耗的细胞产率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln单位营养物消耗的副产物产率(mmol/mmol)V 培养体积(mL)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将需要培养的细胞在无血清培养基中采用常规的方法进行传代适应后，接种于生物反应器中，接种密度为1.0～3.0×105细胞/ml；(2)反应器设置为温度37℃，pH为7.0～7.2，溶氧40～60％，搅拌转速40～80转/分钟。在无血清初始培养基中，培养50～60小时后，将无血清灌注培养基以灌注速率D＝1.0v/v day-1的速度进入生物反应器进行灌注培养，培养时间为10～60天。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的细胞包括杂交瘤细胞、重组CHO细胞、293细胞、昆虫细胞或NSO细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，无血清初始培养基的组分和含量如下
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，无血清灌注培养基的组分和含量如下
全文摘要
本发明公开了一种动物细胞高密度连续灌注培养方法。其特点是通过研究细胞生长、营养物消耗和代谢副产物积累的动力学特性来研究细胞生长和营养物消耗及代谢副产物积累之间的代谢规律，确定和控制细胞生长的最佳营养环境，通过化学计量关系和灌注培养策略满足细胞生长所需的营养物质量。从而解决了营养物耗竭和副产物积累之间的矛盾。采用本发明所形成的工艺可将各种营养物控制在一个较低的合适浓度，既可保证细胞的营养供应，不会限制细胞的生长，又可降低有毒废物的产生，从而可获得高的细胞密度和产物浓度。
文档编号C12N5/06GK1778903SQ200510030199
公开日2006年5月31日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者谭文松, 朱明龙, 牛红星, 周燕, 华平, 顾小华 申请人:华东理工大学